Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Homojen Glikokonkonjuggate Kombine Doğal Olmayan Amino Asit Birleşme ve Tıklama-Kimya Aşı Amaçlı Tarafından Üretilen

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/60821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

Summary

Genetik kod genişlemesi, tanımlanmış bir bölgede taşıyıcı protein üzerinde biyortgonal fonksiyonel bir grup taşıyan doğal olmayan bir amino asitin getirilmesi için uygulanır. Biorthogonal fonksiyon daha homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için bir karbonhidrat antijen site seçici kaplin için kullanılır.

Abstract

Genetik kod genişlemesi, doğal olmayan amino asitleri (UAA) proteinlerin özelliklerini değiştirmek, yeni protein fonksiyonlarını incelemek veya oluşturmak veya protein konjugatörlerine erişmek için tanıtmak için güçlü bir araçtır. Stop kodon bastırma, özellikle kehribar kodon bastırma, genetik olarak tanımlanmış pozisyonlarda BA'ları tanıtmak için en popüler yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu metodoloji burada bir biyoortogonal fonksiyonel grup barındıran bir UAA içeren bir taşıyıcı protein hazırlanması için uygulanır. Bu reaktif sap ı daha sonra homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için sentetik bir oligosakkarit hapteni özel ve verimli bir şekilde aşılamak için kullanılabilir. Protokol 1:1 karbonhidrat hapten/taşıyıcı protein oranında glikokonjugates sentezi ile sınırlıdır ancak biorthogonal fonksiyonel grupların çok sayıda çiftleri için münasiptir. Glycococonjugate aşı homojenliği tam fizyo-kimyasal karakterizasyonu sağlamak için önemli bir kriterdir, bu nedenle, daha fazla ve daha zorlu ilaç düzenleyici kurum önerileri tatmin, klasik konjugasyon stratejileri ile karşılanmayan bir kriter. Ayrıca, bu protokol, yapı-immünojenite ilişkilerine yönelik araçlar ortaya çıkararak, gerçek eşleç aşının yapısını hassas bir şekilde ayarlamayı mümkün kılmıştır.

Introduction

Glikokonjugate aşıları, bulaşıcı hastalıkların profilaktik tedavisinde mevcut olan aşı cephaneliğinin temel unsurlarıdır. Onlar güvenli, iyi tolere ve genç bebekler de dahil olmak üzere geniş bir yaş grubunda verimli. Meningokok, pnömokok veya Haemophilus influenzae tip b1gibi kapsüllü bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlara karşı en iyi savunmayı sağlarlar. Glycococonjugate aşılar bakteri kapsülleri oluşturan saflaştırılmış bakteriyel polisakkaritler veya bu yüzey ifade li polisakkaritler taklit sentetik oligosakkaritler yapılır2, kovalent bir taşıyıcı protein ebağlı. Bir taşıyıcı protein varlığı karbonhidrat antijenleri tarafından ifade antijenik determinant karşı yönlendirilen koruyucu humoral bağışıklık yanıtları teşvik etmek esastır3. Karbonhidrat antijeninin dikkatli bir seçimi ve üretimi dışında, glikokonjugate aşısının etkinliği üzerinde etkili olduğu bilinen özellikler şunlardır: taşıyıcı proteinin doğası, konjugasyon kimyası (kullanılırsa bağlayıcının doğası ve uzunluğu dahil) veya sakkarit/protein oranı3. Açıkçası, sakkarit proteine konjuge pozisyonları yanı sıra bağlantı noktalarının sayısı immünjenite için ilgilidir. Glikokonjugates hazırlanması büyük ölçüde ampirik kalır, çünkü bugüne kadar, bu iki parametre pek çalışılmıştır. Sentezleri genellikle taşıyıcı protein dizisinde bulunan lizin veya aspartik/glutamik asit yan zincir kalıntılarının amin veya karboksilik asit fonksiyonlarının kullanımına dayanır. Bu tek bir değil, glikokonjugates heterojen bir karışıma yol açar.

Proteindeki amino asit kalıntılarının reaktivitesi, erişilebilirliği veya dağılımı üzerinde oynamak, sakkarit/protein bağlantısının etkisini belgelemek için daha güvenilir olan daha tanımlı glikokonjugates'e yol açar4. Bu hedefe doğru bir adım protein glikan kaplin teknolojisi, hücre fabrikalarında kontrollü glikokonkonjugate aşıların üretimine olanak sağlayan bir rekombinant süreci uygulayarak elde edilebilir5,6. Ancak, glikozilasyon sadece D /EXNYS/T sequons içinde bir asparagin kalıntısı yer alır (x herhangi bir olduğu gibi 20 doğal amino asitler, doğal taşıyıcı proteinler üzerinde mevcut değildir.

Site seçici mutagenez ve sistein özellikle dahil onların yüksek ve seçici reaktivite yararlanmak için alternatif olarak görünür7,8. Kendi sıralarına UAA'ları içeren taşıyıcı proteinlerin üretimi homojen glikokonleklek aşı hazırlanması için daha fazla esneklik sunabilir. 100'den fazla UAA geliştirilmişve daha çeşitli proteinler9,10dahil edilmiştir. Birçoğu genellikle post translational modifikasyonlar11 veya aşılamak için kullanılan biyoortogonal fonksiyonlar içerir12 veya ilaçlar13 ama karbonhidrat antijenleri ile daha fazla konjugasyon için ideal kolları vardır. Başarılı örnekler Biotech14 tarafından hücresiz protein sentezi15 kullanılarak iddia edilmiştir ancak bu stratejiye göre glikokonjugate aşıların hazırlanması hala popüler hale gelmesini beklemaktadır.

Mutasyona uğramış taşıyıcı protein üretimi için in vivo stratejisinin uygulanması belirli bir kodon içeren değiştirilmiş bir çeviri makine ihtiyacı, kodonu tanıyan bir tRNA ve özellikle tRNA üzerinde UAA transferi katalizler bir aminoasil-tRNA synthetase (aaRS) (Şekil 1)16. Pyrrolysine kehribar stop kodon bastırma uaa dahil etmek için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir, özellikle propargyl-lizin (PrK)17. İkincisi sırayla tam tanımlanmış, homojen glycococonjugates sağlamak için azido fonksiyonel karbonhidrat haptens ile reaksiyona olabilir. Bu el yazmasında, alkin sapı taşıyan bir UAA olan propargyl-L-lizinin nasıl sentezleneceğini, bir bakterinin çevirisi sırasında hedef proteine nasıl dahil edilebildiğini ve son olarak da modifiye edilmiş protein ile tıklama kimyası kullanan bir azit fonksiyonu taşıyan hapten arasında çekimin nasıl yapılacağını anlatıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. UAA sentezi: propargyl-lizin (PrK)

  1. N αsentezi -Boc-propargyl-lizin18
    1. 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) sulu 1 M NaOH (5 mL) ve THF (5 mL) karışımını bir şişede çözün ve şişeyi silikon septumla sığdırın.
    2. Bir buz banyosunda şişeyi soğutun ve karıştırırken mikroşiniş kullanarak 158 μL propargyl kloroformate (1,62 mmol) damla (2-3 dk'lık bir süre içinde) ekleyin.
    3. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına Kadar ısıtın ve 10 saat karıştırmaya devam edin.
    4. Bir buz banyosunda 50 mL dietil eter, 50 mL sulu 1 M hidroklorik asit ve 60 mL etil asetat çözeltilerini soğutun.
    5. Bir buz banyosunda ham reaksiyon karışımı serin ve bir ayırma hunisi içine karışımı dökün. Metil eter 50 mL ile karışımı ayıklayın. Organik katmanı atın.
    6. Ayırma hunisindeki sulu faza sulu 1 M hidroklorik asit dikkatlice ekleyin. Daha sonra 30 mL etil asetat kullanarak sulu tabakayı iki kez ayıklayın. Organik fazda N-Boc-propargyl-lizin in varlığını TLC ile CH2Cl2-metanol (9:1) elüent olarak kullanarak doğrulayın.
    7. MgSO4üzerinde kombine organik katmanları kurulayın, katı faz kapalı filtre ve bir döner buharlaştırıcı üzerinde azaltılmış basınç altında filtrat konsantre.
    8. Ham yağlı Nα-Boc-propargyl-lizin örneğini deuterated kloroform (CDCl3)içinde çözünve 1H NMR ile kimliğini kontrol edin.
      DİkKAT: Çıkarma basınç birikme neden olabilir. Sık sık herhangi bir basınç birikimi bırakın.
  2. Doğal olmayan amino asit propargyl-L-lizin sentezi (PrK)
    1. Bir septum ile donatılmış yuvarlak bir alt şişe Nα-Boc-propargyl-lizin tanıtın.
    2. Nα-Boc-propargyl-lizin içözünür argon altında şişeye 4 mL susuz diklorotan (CH2Cl2)ekleyin.
    3. Karıştırırken bir şırınga kullanarak 4 mL trifloroasetik asit (TFA) ekleyin.
    4. RT'de 1 saat boyunca reaksiyon karışımını karıştırın.
    5. Reaksiyon karışımını azaltılmış basınç altında yoğunlaştırın.
    6. Ham kalıntıya dietil eter ekleyin ve PrK'yı çökeltmek için 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Daha yüksek ölçekte çalışırken, PrK tamamen çökelmemişse, onu çökeltmek ve gerekirse kuluçka süresini uzatmak için trituat.
    7. PrK'yi, çatallı camüzerinde beyaz bir katı şeklinde filtreleyin.
    8. PrK'nın bir aliquotunu D2O'da eritin. Daha sonra kimliğini ve saflığını kontrol etmek için NMR analizleri gerçekleştirin.
    9. Daha fazla kullanım için, 100 mM nihai konsantrasyonda distile suda doğal olmayan amino asit PrK eritin ve 1 mL aliquots olarak -20 °C'de saklayın.

2. PrK tarafından modifiye edilen rekombinant proteinin üretimi

  1. Plazmid hazırlığı
    1. Hedef olgun Pnömokok yüzey yapıştırıcısı A (mPsaA) geni (p) içeren bir plazmid (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) bir ekspresyon oluşturmak ET24d-mPsaA-WT) pET24d plazmid Insert ve XhoI kısıtlama siteleri arasında ekleme klonlama tarafından bir Tütün Etch Virüs (TEV) proteaz dizisi izledi. Bu proteinin C-terminus bir His6 etiketi tanıtacak. Konvansiyonel site yönelimli mutagenez tekniği ni kullanarak lizin-32 kodonunu kehribar kodonu (TAG) ile değiştirin.
    2. Methanosarcina mazei (MmPylRS) pirrolysyl-tRNA synthetase için gen kodlama iki kopyasını içeren ikinci bir ifade plazmid (pEVOL-MmPylRS) ve daha önce açıklandığı gibi ilgili tRNAPyr için gen kodlama oluşturmak19. BaA'ların verimli bir şekilde dahil edilmesi için bu özel olarak tasarlanmış plazmid vektörü olan pEVOL'u kullanın.
      NOT: Ayrıntılı plazmids bilgileri Ek Dosya 1'deaçıklanmıştır.
  2. Plazmidlerin ifade gerilimine ortak dönüşümü
    1. 5 dakika boyunca buz üzerinde kimyasal olarak yetkin Escherichia coli BL21(DE3) bir 100 μL aliquot çözülme.
    2. Hücrelere her plazmidin 1 μL'sini (her biri 50-100 ng) ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
    3. 1,5 mL'lik mikrotüpü 42 °C'de bir kuvözde erimiş hücrelerle 45 s'ye aktarın ve 2 dakika boyunca tekrar buza taşıyın.
    4. Antibiyotik ekspresyonuna izin vermek için 37 °C'de 1 saat sallayarak 900 μL LB orta ve inkübat ekleyin. Daha sonra bakterileri 25 g/mL kanamisin ve 30 g/mL kloramfenikol ile LB agar üzerine plakalayın. Bakterilerin bir gecede 37 °C'de büyümesini bekleyin.
  3. PrK ile modifiye proteinlerin ekspresyonu
    1. 5 mL LB orta sında tek bir ortak dönüştürülmüş koloniyi antibiyotiklerle (25 μg/mL kanamisin ve 30 g/mL kloramfenikol) aşılamak. Bir gece boyunca 37 °C'de sallayarak kuluçkaya yat.
    2. Birincil kültürü (5 mL) antibiyotik içeren 500 mL,L-arabinose%0.02 ve doğal olmayan amino asit PrK'nın 1 mM'sine seyreltin ve 37 °C'de 24 saat sallayarak inkükarta edin. WT proteini içeren bir klonun kültürünü gerçekleştirerek prk olmadan kültürü paralel olarak gerçekleştirerek negatif bir kontrol ve pozitif kontrol ekleyin.
    3. Aliquot 5 mL 500 mL kültür orta ve santrifüj dışında 10 dakika 5.000 x g. Supernatant atın ve -20 °C pelet dondurun. Kalan 495 mL'den 10 dk 5.000 x g.'da santrifüj ile hasat hücreleri . Supernatant atın ve -20 °C pelet dondurun.
  4. SDS-PAGE ve batı Blot analizi ile 5 mL kültür örneklerinden ham hücre özlerini analiz edin
    1. 5 mL hücreli peleti 250 μL lysis tamponuna (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF) yeniden askıya alın ve 1,5 mL mikrotüpiçine aktarın.
    2. Hücreleri sıvı nitrojendeki tüpleri dondurarak, 42 °C'lik bir banyoda eriterek ve 30 s yüksek hızda girdap layarak lyse hücreleri. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
    3. Hücre enkazLarını ortadan kaldırmak için 10 dk için 17.000 x g'de santrifüj örnekleri.
    4. Supernatant 10 μL alın ve 5 μL su ve yükleme tampon (bromofenol mavisi, SDS, β-mercaptoetanol) 5 μL ekleyin. Numuneleri 100 °C'de 5 dk ısıtın ve SDS-PAGE ve western Blot analizlerini gerçekleştirin.
  5. Nikel-NTA boncuklar kullanılarak yerçekimi akış-tezgah afinite kromatografisi ile protein saflaştırma
    1. Hücre peletlerini (495 mL kültüründen) 20 mL lysis tamponuna (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF) yeniden askıya alın.
    2. Süspansiyona 5 μL DNase I (1 mg/mL) ve 500 μL (50 mg/mL) ekleyin ve süspansiyonu 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırarak lysis'e izin verin.
    3. Hücreleri 5 dakika boyunca sonicate (5 s-5 s döngüleri, genlik 50%) ve sonra 30 dk için 20.000 x g santrifüj ile hücre enkaz kaldırmak ve 0.45 μm filtre üzerinde filtrasyon takip.
    4. Süspansiyona Ni-NTA reçin ekleyin (hücre kültürünün 500 mL'si için 500 l L) ve 4 °C'de 1 saat hafifçe karıştırın.
    5. Bir polipropilen sütuniçine süspansiyon dökün ve bağlanmamış fraksiyonu toplamak.
    6. Reçin'i 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazol içeren 10 mL yıkama tamponu ile yıkayın. Reçiyiyi 5 mL yıkama tamponu (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 20 mM imidazol) ile ikinci kez yıkayın. Yıkama kesirlerini toplayın.
    7. 1 mL elüsyon tamponu (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol) ile etiketli proteini eute. Bu adımı 4 kez tekrarlayın ve tüm elüsyon kesirlerini toplayın.
    8. %12 akrilamid jelüzerinde SDS-PAGE tarafından 7 saflaştırma fraksiyonu gibi ham lysate analiz edin.
    9. Saf His-tagged protein içeren fraksiyonları birleştirin ve bir diyaliz membranı kullanarak bir gecede TEV proteaz tampon (50 mM Tris-HCl, 0.5 m M EDTA, pH 8) 1 L karşı diyaliz diyaliz membranı (cut-off MW 6000-8000 Da) karşılaştırın. 37 360 cm-100 M-1 molar yok olma katsayısı ve mPsAA için 34,14 kDa molekül ağırlığı ile proteinin konsantrasyonu 280 nm ölçün.

3. TEV proteaz sindirim tarafından histidin etiketinin kaldırılması

  1. Protein örneğini 50 mL'lik bir tüpe toplayın ve 2 mg/mL konsantrasyonda 1 mL'ye kadar TEV tamponu (50 mM Tris HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8) ekleyin.
    NOT: Konsantrasyon önceki sonuçlara göre değişebilir. Test ettiğimiz protein konsantrasyonları tipik 2-3 mg/mL aralığındadır.
  2. 100 μL TEV proteaz ekleyin (sindirimi için 20 μg protein için 10 ünite TEV proteaz içeren 1 μL ekleyin).
  3. 0,1 M dithiothreitol (DTT) 50 μL ekleyin.
  4. 5 mL'ye kadar TEV tamponu (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) ile tamamlanır.
  5. Gece boyunca 4 °C'de yavaş sallayarak kuluçkaya yat.
    NOT: Sindirim tamamlanmazsa, daha fazla TEV proteaz ekleyin, daha uzun süre veya 30 °C'ye kadar daha yüksek sıcaklıkta kuluçkaya yatırın.
  6. Fosfat tamponuna karşı bir diyaliz membranı (cut-off 6000-8000 Da) kullanarak bir gecede 4 °C'de EDTA'yı çıkarmak için sindirilmiş proteini diyalize kapatın (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM imidazol).
  7. TEV proteazını ve sindirilmemiş proteini ortadan kaldırmak için karışımı Ni-NTA boncuklarıyla kuluçkaya yatırın ve 4 °C'de 1 saat hafifçe karıştırın.
  8. Süspansiyonu polipropilen kolona dökün. Bağlanmamış fraksiyonu toplayın ve kolon5 mL yıkama tamponu (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazol) ile yıkayın
    NOT: İlgi proteini bağlanmamış ve yıkanan kesirlerde geri kazanılmalıdır.
  9. Kolona 5 mL elüsyon tamponu (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol) ekleyerek TEV protease ve sindirilmemiş proteini ete. 280 nm'de ve SDS-PAGE analizi ile protein içeriği için kesirleri kontrol edin.
  10. Sindirilmiş numuneleri sindirilmemiş proteini kontrol edilerek Sindirilmiş numuneleri sindirerek sindirimin verimliliğini kontrol edin.
  11. Sindirilmiş proteini 1 L'lik tıklama tamponuna (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) bir gecede bir diyaliz zarı (cut-off 6000-8000 Da) ile diyaliz membranı ile diyaliz etimine karşı diyalize sindirin, tamponu değiştirmek için, ve mÖsyö lerin mösyö yok olma katsayısı ve mPsaA'nın moleküler ağırlığı (37 360 cm-1-1 ve MW 34,14 kDa) ile proteinin konsantrasyonunu 280 nm olarak ölçün.

4. Tıklama kimyası için doğal olmayan amino asit propargyl-lizin erişilebilirliğinin ve işlevselliğinin değerlendirilmesi

NOT: Presolski ve ark.20 tarafından tıklama kimyası için açıklanan protokolü kullanarak 6-hexachloro-fluorescein-azide ile milletvekillerini biraraya edin.

  1. 2 mL mikrotüp içine 57,8 μM konsantrasyonda 432,5 μL PrK mutasyona uğramış protein alın.
    NOT: En az 2 μM alkyne konsantrasyonu kabul edilebilir. Protein konsantrasyonu daha düşükse, bir santrifüj konsantratörü ile konsantre veya azide / alkyne molar oranını artırarak reaksiyon dengesi lehine.
  2. 50 mM 6-heksakloro-floresan-azit 10 μL ekleyin ve sonra 20 mM'de 2,5 μL CuSO4 çözeltisi ve 50 mM 'de (stok çözeltisi konsantrasyonları) 7,5 μL Tris(benzyltriazolyethyl)amin (THPTA) premixini ekleyin.
    1. 25 μL sulu 100 mM aminoguanidin hidroklorür ekleyin.
    2. 25 μL 20 mg/mL sodyum askorbat eksfirolarak hazırlanmış sulu çözelti ekleyin.
    3. Tüpü kapatın, birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve 2 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
    4. 0,5 M EDTA 50 μL ekleyerek reaksiyonu durdurun.
    5. Reaksiyon karışımının 15 μL'sini alın ve bir mikrotüp koyun, 5 μL yükleme tamponu (bromofenol mavisi, SDS, β-mercaptoetanol) ekleyin, karışımı 100 °C'de 5 dakika ısıtın ve sonra %12 akrilamid jeline yükleyin. Göçten sonra, 312 nm UV ışığı altında jel üzerinde floresan eşlenik görselleştirin.

5. Azido-fonksiyonel karbonhidrat antijeni (Pn14TS-N3)ile mPsAA'nın tıklama kimyası ile konjugasyonu

  1. Kaplin
    1. 2 mL mikrotüp içine 57,8 μM'de 432,5 μL PrK mutasyona uğramış protein alın.
    2. Suya 10 mM Pn14TS-N321 ekleyin ve 20 mM'de 2,5 μL CuSO4 çözeltisi ve 50 mM'de 7,5 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 0
      NOT: Streptococcus pneumoniae serotip 14 kapsüler polisakkariti taklit eden tetrasakkarit pn14TS-N3sentezi, referans 21'de tanımlanmıştır. Teorik olarak, herhangi bir karbonhidrat antijeni içeren bir azit fonksiyonu kullanılabilir.
    3. 100 mM aminoguanidin hidroklorür 25 μL ekleyin.
    4. Sodyum askorbat 25 μL 20 mg/mL extemporaneously hazırlanmış sulu çözelti ekleyin.
    5. Tüpü kapatın, birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve 2 saat boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
    6. 0,5 M EDTA 50 μL ekleyerek reaksiyonu durdurun.
    7. 15 μL numune alın ve SDS-PAGE ile analiz edin.
  2. Glikokonjugate jel filtrasyon arıtma
    1. Glikokontopil bir steric dışlama agarose sütun (15 x 600 yatak boyutları, 3.000-70.000 fraksiyonasyon aralığı) uygulayarak, 100 mM PBS tampon, pH 7.3 ile dengelenir 0.8 mL/dk akış 280 nm algılama ile arındırın.
    2. Glikokonjugate içeren kesirleri toplayın.
      NOT: Uzun süreli depolama için glikokonjugate'i 1L 2 O'ya karşı iki kez 2 saat diyaliz membranı (kesme Mw 6000-8000 Da) kullanarak 4 °C'de diyalize kapatın, sonra dondurun-kurulayın ve glikokonjugate -80 °C'de saklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu projede, tanımlanmış bir bölgede UAA tanıtmak için kehribar stop kodon bastırma stratejisi kullanılarak homojen bir glikonkonjuge aşı hazırlanmıştır(Şekil 1). Pnömokok alhesin A taşıyıcı protein moiety olarak seçildi. Bu protein son derece korunmuş ve Streptococcus pneumoniaetüm suşları ile ifade22. Bu son derece immünojenik ve daha önce pnöyokok aşı formülasyonları21,23taşıyıcı olarak kullanılır. Bir kanıtı olarak, UAA propargyl-lizin verimli yabani tip pyrrolysyl-tRNA synthetase tarafından tahsil (PylRS)/arke Methanosarcina mazei tRNA çifti araştırıldı. Propargyl-lizin ticari olarak mevcuttur ancak boc-lizin den sadece iki sentetik adımda avantajlı bir şekilde hazırlanabilir(Şekil 2). Bir kehribar kodonu, mPsAA geni içeren pET24d plazmidde istenilen pozisyonda üretildi. Bu plazmid bir pEVOL plazmid (Edward Lemke bir tür hediye (EMBL19)propargyl-lizin dahil etmek için gerekli ortogonal araçları içeren, yetkin E. coli BL21 (DE3) suşu içine dönüştürülmüştür. Pozitif ko-dönüştürülmüş klonlar 25 g/mL kanamisin ve 30 μg/mL kloramfenikol kullanılarak seçildi. Plazmid pEVOL başlangıçta bir değil, mmpylrs için gen kodlama iki kopyasını içerir propargyl-lizin kalıntısı dahil etmek: ilk kopya bir kurucu organizatörün kontrolü altında ise diğerinin ifadesi arabinose varlığında indükleyici. Ancak, kurucu organizatör kontrolü altında MmPylRS geni bastırılırsa propargyl-lizin dahil dramatik bir azalma fark ettik.

Propargyl-lizin PsaA N-terminus yakınında bir lizin yerine pozisyon 32 tanıtıldı. Yüzeye maruz kalmış yan zincirli herhangi bir kalıntı, daha fazla çekim yapılması için hemen hemen değiştirilebilir. Mutasyona uğramış protein olgun formunda (mPsaAK32PrK)C-terminusuna 6-histidin etiket dizisi dahil edilebilmiştir. MPsAAK K32PrK üretiminin etkinliği SDS-PAGE ve Batı Leke analizi ile anti-Histidin etiket antikor kullanılarak kontrol edildi, büyüme UAA propargil-lizin varlığı veya yokluğunda yapıldı ve yabani tip milletvekilleri üretimi ile karşılaştırıldığında(Şekil 3). Görselleştirme beklenen molekül ağırlığı (Lanes 4, Şekil 3A & 3B)bir protein bandı ortaya. Tam uzunlukta bir proteinin varlığı PrK'nın mPsAA'ya başarılı bir şekilde dahil olduğunu göstermektedir. Yoğunluğu, ancak, yabani tip milletvekilleri için gözlenen daha düşüktür (Lanes 2, Şekil 3A & 3B). Sızıntı (yani, UAA'ya dahil edilmeden tam uzunlukta protein üretimi) ve proteinin çeviri sırasında Serbest Faktör RF1 tarafından erken salınımı bu süreçte sık karşılaşılan iki ana sakıncadır. Bir yandan, beklenen molekül ağırlığı hiçbir bant propargyl-lizin yokluğunda hiçbir sızıntı oluştu anlamı görselleştirilmiş (Lanes 3, Şekil 3A & 3B)ve dolaylı olarak lanes gözlenen bant 4 mPsaAK32PrKkarşılık geldiğini doğruladı . Diğer taraftan, düşük molekül ağırlığında, mPsAA'nın kesilen şekline karşılık gelen hiçbir bant görülemez (Şekil 3A'dakiLane 4). MPsaAK32PrK daha sonra afinite kromatografi sivertografi ile saflaştırılmıştır, tipik bir verim ile 8 mg /L (yabani tip protein için 12-20 mg /L ile karşılaştırıldığında) ve propargyl-lizin kalıntısının birleştirilmesi nihayet kütle spektrometresi ile doğrulandı(Şekil 4). Histidin etiketi TEV proteaz kullanılarak proteolitik dekolte üzerine çıkarıldı (Şekil 4). Böylece elde edilen mPsaAK32PrK'nın stabilitesi dairesel dikroizm ile değerlendirildi ve bu da proteinin yapısının Lizin 32'nin propargyl-lizin mutasyonundan rahatsız olmadığını gösterdi (veriler gösterilmedi).

mPsaAK32PrKolması , tıklama kimyası için alkyne reaktivitesi azido-fonksiyonel floresan kullanılarak değerlendirildi ve daha sentetik oligosakkarit antijen β-2-azido konjuge için kullanılan etil d-Galp-(1→4)-β-d-Glcp-(1→6)-[β-d-Galp-(1→4)]-β-d-GlcpNAc (Pn14TS) (Şekil 5). Bu tetrasakkarit S. pneumoniae tip 14 kapsüler polisakkarit ile ilgilidir ve daha önce farklı konjugasyon kimyaları8,21,24kullanılarak mPsAA için konjuge edilmiştir. Deneyler burada bir kontrol olarak vahşi tip milletvekilleri ile karşılaştırıldığında yapıldı. Histidin etiketi ilk olarak TEV proteazkullanılarak proteolitik dekolte üzerine çıkarıldı. Sindirilmiş milletvekilleriAK2PrK ve mPsaA WT daha sonra floroprobu(Şekil 6A)veya Pn14TS(Şekil 6B)konjuge edildi. Reaksiyon SDS-PAGE tarafından değerlendirildi. 6 ve 7(Şekil 6B)arasındaki numunenin molekül ağırlığındaki küçük artış tetrasakkarit Pn14TS ile başarılı bir konjugasyon olduğunu gösterir. Son olarak, glikokonjugate jel filtrasyon ve kitle spektrometresi tarafından doğrulanan kimliği ile saflaştırılmış oldu (Şekil 6C). Tıklama kimyası ile çekim kantitatif olan mPsaAK32PrK çoğunluğu kütle spektrometresi sonuçlarında gösterildiği gibi Pn14TS-N3 ile konjuge edildi (Şekil 6C).

Figure 1
Şekil 1: Propargyl-lizin (PrK) bir ortogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase /tRNA çifti ve TAG kodon reassignment25kullanarak çeviri sırasında mPsaA içine dahil . Çeviri sırasında, endojen synthetases amino asitler ve ilgili tRNA'lar arasındaki bağlantıyı katalizler. Daha sonra, yüklü tRNA'lar neo-sentezlenmiş polipeptid oluşturmak için ribozomal makineler tarafından kullanılır. Amber stop kodon bastırma stratejisine göre, bir ortogonal aminoasil-tRNA synthetase (aaRS) (burada M. mazeibir pyrrolysyl-tRNA synthetase), yükler bir UAA yükler (burada PrK) onun cognate tRNA tasarlanmış antikodon (TAG) mRNA üzerinde kehribar stop codon (TAG) okuyabilirsiniz. Bu özel tanıma, UAA'nın hedef proteindeki belirli bir bölgeye dahil edilmesine yönlendirir. Şekil Wang ve ark25çoğaltılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Propargyl-lizin sentezi. (A) Propargyl-lizin sentezinin basamakları. Ek: Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH ara: floresan indikatörlü (GF254) ile 0,25 mm silika jel plakalar üzerinde ince tabaka kromatografisi ve sülfürik asit/etanol (1.5:95 v/v) vanilin ile kavrularak görüntülendi; elüent: CH2Cl2/MeOH (9:1), sol şerit: Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH(Rf 0.90), sağ şerit: ham propargyl-lizin,(Rf 0.38). 400 MHz 1H (B) ve 13C NMR spektrum (C) D2O kaydedilen propargyl-lizin bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Ham hücre örneklerinin analizi. (A) SDS-PAGE analizi ve (B) Ham hücre örnekleri üzerinde Batı leke analizi. Lane 1: lekesiz protein belirteci; Lane 2: yabani tip mPsaA ham hücre özü; Lane 3: PrK yokluğunda yetiştirilen mPsaAK32TAG ham hücre özü; Lane 4: prk. Koşullar varlığında yetiştirilen mPsaAK32TAG ham hücre çıkarma: 12% akrilamid jel, çalışan 100 V, 2 h. SDS-PAGE Coomassie mavi tarafından boyanmış; Western Blot, AlexaFluor680 ile birleştiğinde anti-histidin etiketantikor ve sekonder antikor kullanılarak ortaya çıktı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Histidin etiket kaldırma ve kütle spektrometresi analizi. (A) SDS-PAGE analizi. Lane 1: lekesiz protein belirteci; Lane 2: ham hücre özü; Şerit 3: bağlanmamış kesir; Lane 4: 10 mM imidazol ile fraksiyonu yıkamak; Şerit 5: 20 mM imidazol ile fraksiyonu yıkamak; Koşullar: 12% akrilamid jel 100 V 2 saat için çalışan ve Coomassie mavi ile boyanmış; (B) MALDI-TOF-MS spektrumları (üst) mPsaA WT, teorik MW 33 103 Da, bulunan 33 106 Da ve (alt) mPsaA K32PrK, teorik 33 184 Da, bulundu 33 192 Da. Bulunan kitleler beklenen marj hatası içindedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Tıklama kimyası ile çekim stratejisinin şematik gösterimi. Bir azit taşıyan tek bir tetrasakkarit özellikle mPsaA K32PrK (1PSZ PDB dosyasına dayalı mPsaA gösterimi, 2.0 ş26çözünürlüğe sahip) üzerindeki tamamlayıcı biyorthogonal alkyne grubuyla birleştiğindedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: (A) floresan-N3 ve (B) Pn14TS ile milletvekillerinin histidin-tag sindirimi ve konjugasyonu. (A) SDS-PAGE Lanes 1-3: WT mPsaA; Şerit 4-6: milletvekilleriAK32PrK; (B) Şerit 1: lekesiz protein belirteci; Lane 2-4: WT mPsaA; Şerit 5-7: mPsaAK32PrK. 2 μg protein örneği/şeridi, %12 akrilamid, 100 V, 2 saat; (C) Maldi-TOF-MS spektrumları Pn14TS-mPsaAK32PrK teorik MW 34 091 Da, bulunan 34 088 Da. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Site yönelimli mutagenez ancak glikokonjugate aşıları hazırlamak amacıyla kullanılan kalır bir protein tanımlı bir konumda belirli amino asitler dahil etmek için basit bir stratejidir7,8,14. 20 doğal amino asit yaklaşımına dayalı klasik mutagenez, çeviri makinelerinde herhangi bir değişiklik gerektirmediğinden son derece etkilidir. Sistein mutasyonları genellikle daha doğrudan ya da iki adımda benzersiz tiyol reaktivitesi keşfetmek için hedeflenir(örneğin,bir dehidroalanin ara içine modifikasyon sonra, post-translational mutagenezi denilen bir strateji)27,28. Genetik kod genişletme belki de daha çekici ve esnek tir çünkü farklı işlevlere sahip ua'ların geniş bir yelpazede doğrudan dahil sağlar9,10. Birkaç UAA aynı anda bir protein içinde dahil edilebilir iken29, mutasyonların sayısı genellikle daha sınırlıdır. Burada taşıyıcı proteinde tek bir propargyl-lizin tanıtmak için ilgili kehribar stop kodonu stratejisini uyguladık. İlk amino asitin yan zincirinin yüzeye maruz kalması, X-ışını kristalografik yapılarından veya silico modellemesinde kolayca belirlenen bir kriter olması koşuluyla, birleşme herhangi bir pozisyonda gerçekleşebilir. Ayrıca, propargyl-lizin ile sınırlı değildir ama daha sonra gelen karbonhidrat antijeni greft için bir çapa olarak hizmet edecek ve bunun için bir ortogonal aaRS / tRNA çifti var bir biyortgoonal fonksiyonu ile fonksiyonel herhangi bir UAA uzatılabilir.

Stratejinin dezavantajlarından biri, kehribar stop kodonunu bir yan ürün olarak okurken peptidil yan zincirinin serbest bırakılması sonucu kesilen proteinin olası üretimidir. Burada herhangi bir kesilmiş formu gözlemlemesek bile (muhtemelen bakteri tarafından çok küçük boyuttan dolayı bozulmuştur), proteinin C-terminus'una, kirlerden beklenen tam uzunlukta mutasyona uğramış proteinin arınmasını kolaylaştırmak ve kesilmiş proteinden (özünde histidin etiket dizisini ifade etmeyen) bir histidin etiketi eklenmiştir. Saflaştırma jel filtrasyon gibi alternatif kromatografi teknikleri kullanılarak denenemez beri UAA birleşme protein C-terminus yakınında yapılırsa bu gerekli olabilir.

Çoğu uygulama için histidin etiketinin kaldırılması zorunlu değildir. Ancak, bağışıklık sisteminin bir parçası olarak glikokonjugate aşısı tasarımı ile ilgili yararlı olabilir etiket dizisi karşı saptırılmış olabilir. Bu kavram kanıtı için, biz özellikle sindirim sonrası taşıyıcı protein üzerinde beş ekstra amino asit yaprakları TEV proteaz tarafından yarık bir amino asit uzunluğu dizisi yerleştirilir.

Presolski ve ark.'nın bildirdiği bir tıklama kimyası protokolüne göre, pnömokok kapsülüne bağlı ve tamamlayıcı azide taşıyan propargyl-lizin alkini ile temsili sentetik oligosakkarit Pn14TS arasındaki konjugasyon adımı gerçekleştirildi.20 Gerekirse reaksiyon süresi artırılarak veya alkine, azide ve bakır reaktanlar ve reaktifler arasındaki oran değiştirilerek reaksiyonun tamamlanmasına kolayca ulaşılabilir. Bakır tuzları aşırı EDTA ile tedavi ile ortadan kaldırılır ve ardından sterik dışlama kromatografisi ile kısa bir arınma yapılır.

Bu çalışmada açıklanan teknikle elde edilen glikokonjugate fareleri aşılamak için kullanılabilir. Ellerde böyle tam tanımlanmış ve kolayca modüle glycoconjugate olması bağışıklık yanıtı üzerinde hapten / protein taşıyıcı bağlantı etkisini değerlendirmek için paha biçilmez araçlar sağlar8. Hapten / protein oranını artırmak genellikle kısa haptens kullanırken gelişmiş anti-hapten humoral yanıt ile ilişkili olduğundan30, bir birden fazla haptens ile konjuge test ilginizi çekebilir. Ancak birden fazla UAA'nın dahil edilmesi, proteine bir UAA eklenmesi nin RF1 aktivitesi nedeniyle protein üretiminin verimini azaltma eğiliminde olması nedeniyle protokolün bazı ayarlamalarına ihtiyaç duyar.

Kesin olarak, bu yöntem homojen glikokonjugate aşılar onların fiziko-kimyasal karakterizasyonu ve daha fazla karbonhidrat antijen / taşıyıcı bağlantı-immünojenite ilişki çalışmaları kolaylaştıran erişim elde etmek için güçlü bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

E.C. minnetle La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Programı "BioSynProt"), özellikle t.V. bir doktora bursu mali destek kabul eder. Biz de Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Fransa) onun değerli teknik tavsiyeler için kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AIM (autoinductif medium) Formedium AIMLB0210 Solid powder
Boc-Lys-OH Alfa-Aesar H63859 Solid powder
BL21(DE3) Merck Novagen 69450 E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin Machery Nagel Protino Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH this study same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT this study pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate Sigma-Aldrich 460923 Liquid
Sonicator Thermo Fisher FB120-220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
  2. Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
  3. Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
  4. Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
  5. Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
  6. Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
  7. Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
  8. Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
  9. Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
  10. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
  11. Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
  12. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
  13. Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
  14. WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).
  15. Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
  16. Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
  17. Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
  18. Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  21. Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
  22. Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
  23. Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
  24. Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
  25. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
  26. Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
  27. Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
  28. Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
  29. Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  30. Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).

Tags

Biyomühendislik Sayı 166 sentetik biyoloji homojen glikokonjuge site seçici biyokonjugasyon doğal olmayan amino asit genetik kod genişletme tık-kimya propargyl-l-Lizin karbonhidrat
Homojen Glikokonkonjuggate Kombine Doğal Olmayan Amino Asit Birleşme ve Tıklama-Kimya Aşı Amaçlı Tarafından Üretilen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., … More

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., Grandjean, C., Camberlein, E. Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes. J. Vis. Exp. (166), e60821, doi:10.3791/60821 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter