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Bioengineering

Glycoconjugate homogène produit par combined unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glycoconjugate Produit par Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glycoconjugate Produit par Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glyc

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/60821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

Summary

L’expansion du code génétique est appliquée pour l’introduction d’un acide aminé contre nature portant un groupe fonctionnel biorthogonal sur une protéine porteuse à un site défini. La fonction biorthogonale est également utilisée pour le couplage sélectif d’un antigène carbohydrate pour fournir un vaccin glycoconjugate homogène.

Abstract

L’expansion du code génétique est un outil puissant pour introduire des acides aminés contre nature (UUA) dans les protéines afin de modifier leurs caractéristiques, d’étudier ou de créer de nouvelles fonctions protéiques ou d’avoir accès à des conjugués protéiques. Arrêter la suppression du codon, en particulier la suppression du codon ambré, est apparue comme la méthode la plus populaire pour introduire génétiquement des AUA à des positions définies. Cette méthodologie est appliquée à la préparation d’une protéine porteuse contenant un UAA hébergeant un groupe fonctionnel bioorthogonal. Cette poignée réactive peut ensuite être utilisée pour greffer spécifiquement et efficacement un hapten oligosaccharide synthétique pour fournir un vaccin glycoconjugate homogène. Le protocole est limité à la synthèse des glycoconjugates dans un rapport 1:1 de protéine de hydrate de carbone/porteur mais favorable à de nombreuses paires de groupes fonctionnels biorthogonal. L’homogénéité vaccinale du glycococonjugate est un critère important pour assurer une caractérisation physico-chimique complète, satisfaisant ainsi des recommandations de plus en plus exigeantes des organismes de réglementation des médicaments, un critère qui n’est pas satisfait par les stratégies classiques de conjugaison. En outre, ce protocole permet d’affiner finement la structure du vaccin conjugué réel, donnant lieu à des outils pour traiter les relations structure-immunogénicité.

Introduction

Les vaccins glycoconjugates sont des éléments essentiels de l’arsenal vaccinal disponible pour le traitement prophylactique des maladies infectieuses. Ils sont sûrs, bien tolérés et efficaces dans un large groupe d’âge, y compris les jeunes nourrissons. Ils fournissent la défense optimale contre les infections causées par des bactéries capsulées comme le méningocoque, le pneumocoque ou Haemophilus influenzae de type b1. Les vaccins glycococonjugates sont faits de polysaccharides bactériens purifiés qui forment les capsules de bactéries ou d’oligosaccharides synthétiques qui imitent ces polysaccharides exprimés en surface2, qui sont covalents liés à une protéine porteuse. La présence d’une protéine porteuse est essentielle pour favoriser les réponses immunitaires humoristiques protectrices dirigées contre le déterminant antigénique exprimé par les antigènes de hydrate decarbone 3. Outre une sélection et une production minutieuses de l’antigène médicide, les caractéristiques connues pour exercer une influence sur l’efficacité d’un vaccin glycoconjugate sont les suivantes : la nature de la protéine porteuse, la chimie de conjugaison (y compris la nature et la longueur du lien s’il est utilisé), ou le rapport saccharide/protéine3. De toute évidence, les positions auxquelles le saccharide est conjugué à la protéine ainsi que le nombre de points de connectivité sont pertinents pour l’immunogénicité. À ce jour, ces deux paramètres n’ont guère été étudiés parce que la préparation des glycoconjugates reste largement empirique. Leur synthèse repose habituellement sur l’utilisation de fonctions d’acide amine ou carboxylique de lysine ou de résidus de chaîne latérale aspartique/glutamique présents sur la séquence des protéines porte-avions. Cela conduit non pas à un seul, mais à un mélange hétérogène de glycoconjugates.

Jouer sur la réactivité, l’accessibilité ou la distribution des résidus d’acides aminés dans la protéine donne lieu à des glycoconjugates plus définis qui sont plus fiables pour documenter l’effet de la connectivité saccharide/protéine4. Un pas en avant vers cet objectif peut être atteint en appliquant la technologie de couplage glycan de protéine, un processus recombinant qui permet la production des vaccins contrôlés de glycoconjugate dans les usines cellulaires5,6. Cependant, la glycosylation a lieu exclusivement à un résidu d’asparagine dans les séquons D/EXNYS/T (auquel cas X est l’un des 20 acides aminés naturels), non naturellement présents sur les protéines porteuses.

La mutagenèse sélective du site et en particulier l’incorporation de cystéines pour exploiter leur réactivité hautement et sélective apparaît comme une alternative7,8. La production de protéines porteuse intégrant des UUA dans leur séquence peut offrir encore plus de souplesse pour la préparation homogène du vaccin glycoconjugate. Plus de 100 AUA ont été développés et incorporés dans diverses protéines9,10. Beaucoup d’entre eux contiennent des fonctions bioorthogonales habituellement utilisées pour effectuer des modifications post-translationnelles11 ou pour greffer des sondes biophysiques12 oudes médicaments 13, mais qui sont des poignées idéales pour une conjugaison plus approfondie avec les antigènes glucides. Des exemples réussis ont été revendiqués par Biotech14 en utilisant la synthèse des protéines sans cellules15, mais la préparation des vaccins glycoconjugate selon cette stratégie attend toujours d’être popularisée.

L’application de la stratégie in vivo pour la production de protéines porteuse mutées nécessite une machine translationnelle modifiée qui comprend un codon spécifique, un ARN reconnaissant le codon et une synthétase aminoacyl-tRNA (aaRS) qui catalyse spécifiquement le transfert de l’UAA sur l’ARN t (Figure 1)16. La suppression de codon d’arrêt d’ambre de pyrrolysine est l’une des méthodes les plus employées pour incorporer UAA, en particulier le propargyl-lysine (PrK)17. Ce dernier peut à son tour réagir avec des haptens de glucides fonctionnalisés à l’azido pour fournir des glycococonjugates entièrement définis et homogènes. Dans le présent manuscrit, nous décrivons comment synthétiser le propargyl-L-lysine, un UAA portant une poignée d’alkyne, comment l’incorporer dans une protéine cible lors de sa traduction dans une bactérie et enfin comment effectuer la conjugaison entre la protéine modifiée et un hapten portant une fonction d’azide à l’aide de la chimie du clic.

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Protocol

1. Synthèse de l’UAA : propargyl-lysine (PrK)

  1. Synthèse de Nα-Boc-propargyl-lysine18
    1. Dissoudre 500 mg de Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) dans un mélange d’aqueuse 1 M NaOH (5 mL) et THF (5 mL) dans un flacon et adapter le flacon avec un septum de silicium.
    2. Refroidir le flacon dans un bain de glace, puis ajouter 158 μL de chloroformate propargyl (1,62 mmol) dans le sens de la goutte (sur une période de 2 à 3 minutes) à l’aide d’une microsyringe en remuant.
    3. Chauffer le mélange de réaction à température ambiante et continuer à remuer pendant 10 h.
    4. Refroidir les solutions de 50 mL d’éther de diététhyle, 50 mL d’acide hydrochlorique aqueux de 1 M et 60 mL d’acétate éthylique dans un bain de glace.
    5. Refroidir le mélange de réaction brute dans un bain de glace et verser le mélange dans un entonnoir de séparation. Extraire le mélange avec 50 mL d’éther de diététhyle. Jeter la couche organique.
    6. Ajouter prudemment l’acide chlorhydrique aqueux de 1 M à la phase aqueuse de l’entonnoir de séparation. Puis extraire la couche aqueuse deux fois à l’aide de 30 mL d’acétate d’éthyle. Vérifiez la présence de N-Boc-propargyl-lysine dans la phase organique par TLC en utilisant CH2Cl2-méthanol (9:1) comme élitiste.
    7. Séchez les couches organiques combinées sur MgSO4,filtrez la phase solide et concentrez le filtrate sous une pression réduite sur un évaporateur rotatif.
    8. Dissoudre un échantillon du pétrole brut Nα-Boc-propargyl-lysine dans du chloroforme déréflé (CDCl3) et contrôler son identité par 1H NMR.
      MISE EN GARDE : L’extraction peut entraîner une accumulation de pression. Relâchez fréquemment toute accumulation de pression.
  2. Synthèse de l’acide aminé non naturel propargyl-L-lysine (PrK)
    1. Introduire Nα-Boc-propargyl-lysine dans un flacon rond du fond équipé d’un septum.
    2. Ajouter 4 mL de dichloromethane anhydre (CH2Cl2)au flacon sous argon pour dissoudre le Nα-Boc-propargyl-lysine.
    3. Ajouter 4 mL d’acide trifluoroacétique (ALE) dans le sens de la goutte à l’aide d’une seringue en remuant.
    4. Remuer le mélange de réaction pendant 1 h à RT. Surveiller la réaction de TLC à l’aide de CH2Cl2-méthanol (9:1) aussi élitiste.
    5. Concentrez le mélange de réaction sous pression réduite.
    6. Ajouter l’éther de déthyle au résidu brut et l’incuber à 4 °C pendant 1 h pour précipiter la PrK. Lorsque vous travaillez à plus grande échelle, si le PrK n’est pas complètement précipité, triturate pour le précipiter et prolonger le temps d’incubation si nécessaire.
    7. Filtrer la PrK sous la forme d’un solide blanc sur un verre fritté.
    8. Dissoudre un aliquot de la PrK en D2O. Effectuez ensuite des analyses NMR pour contrôler son identité et sa pureté.
    9. Pour une utilisation plus précise, dissoudre l’acide aminé contre nature PrK dans de l’eau distillée à une concentration finale de 100 mM et conserver à -20 °C sous forme d’aliquots de 1 mL.

2. Production de la protéine recombinante modifiée par PrK

  1. Préparation plasmide
    1. Construire un plasmide d’expression (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) qui contient le gène A (mPsaA) de surface pneumococcique mature cible pET24d-mPsaA-WT) suivi d’une séquence de protéase du virus de l’etch du tabac (TEV) en clonage de l’insert entre les sites de restriction BamHI et XhoI du plasmide pET24d. Ceci introduiraun son 6 étiquette au C-terminus de la protéine. Remplacez le codon de lysine-32 par le codon ambré (TAG), en utilisant la technique conventionnelle de mutagenèse dirigée par le site.
    2. Construire un plasmide de deuxième expression (pEVOL-MmPylRS) contenant deux copies du codage génétique pour la synthétase pyrrolysyl-tRNA de Methanosarcina mazei (MmPylRS) et le codage génétique pour le pyrtRNA correspondant comme décritprécédemment 19. Utilisez ce vecteur plasmide spécialement conçu, pEVOL, pour une incorporation efficace des UUA.
      REMARQUE : L’information détaillée sur les plasmides est décrite dans le dossier supplémentaire 1.
  2. Co-transformation des plasmides en souche d’expression
    1. Décongeler un aliquot de 100 μL d’Escherichia coli BL21 (DE3) chimiquement compétent sur la glace pendant 5 min.
    2. Ajouter 1 μL de chaque plasmide (50-100 ng de chacun) dans les cellules et incuber pendant 30 min sur la glace.
    3. Transférer le microtube de 1,5 mL avec les cellules compétentes décongelées dans un incubateur à 42 °C pendant 45 s, puis le remettre sur la glace pendant 2 min.
    4. Ajouter 900 μL de LB moyen et incuber sous la secousse pendant 1 h à 37 °C pour permettre l’expression antibiotique. Ensuite, plaquez les bactéries sur l’agar LB avec 25 μg/mL de kanamycine et 30 μg/mL de chloramphéniphénol. Laisser la croissance des bactéries pendant la nuit à 37 °C.
  3. Expression des protéines modifiées avec prk
    1. Inoculer une seule colonie co-transformée en 5 mL de moyenne LB avec des antibiotiques (25 μg/mL de kanamycine et 30 μg/mL de chloramphéniphénol). Incuber toute la nuit à 37 °C en secouant.
    2. Diluer la culture primaire (5 mL) en 500 mL de milieu d’auto-induction contenant des antibiotiques, 0,02% de L-arabinose et 1 mM de l’acide aminé contre nature PrK et l’incuber à 37 °C pendant 24 h avec secousses. Inclure un contrôle négatif en effectuant la culture sans PrK en parallèle et un contrôle positif en effectuant la culture d’un clone contenant la protéine wt.
    3. Aliquot 5 mL sur le milieu de culture de 500 mL et centrifugeuse pendant 10 min à 5000 x g. Jeter le supernatant et congeler la pastille à -20 °C. Récoltez les cellules des 495 mL restants par centrifugation pendant 10 min à 5 000 x g. Jeter le supernatant et congeler la pastille à -20 °C.
  4. Analyser les extraits de cellules brutes des échantillons de culture de 5 mL par SDS-PAGE et l’analyse des taches occidentales
    1. Resuspendez 5 mL de granulés cellulaires dans 250 μL de tampon de lyse (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM d’imidazole, 0,2 mM PMSF) et transférez-les dans un microtube de 1,5 mL.
    2. Cellules de lyse en gelant les tubes dans de l’azote liquide, en le décongelant dans un bain à 42 °C et en vortexant à grande vitesse pendant 30 s. Répétez cette étape 3 fois.
    3. Échantillons de centrifugeuses à 17 000 x g pendant 10 minutes pour éliminer les débris cellulaires.
    4. Prendre 10 μL du supernatant et ajouter 5 μL d’eau et 5 μL de tampon de chargement (bleu bromophénol, SDS, β-mercaptoéthanol). Chauffer les échantillons pendant 5 min à 100 °C et effectuer des analyses SDS-PAGE et western Blot.
  5. Purification des protéines par chromatographie d’affinité par banc d’écoulement gravitationnel à l’aide de perles Nickel-NTA
    1. Resuspendez les granulés cellulaires (de la culture de 495 mL) en 20 mL de tampon de lyse (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0,2 mM PMSF).
    2. Ajouter 5 μL de DNase I (1 mg/mL) et 500 μL de lysozyme (50 mg/mL) dans la suspension et permettre la lyse en incubant la suspension à 37 °C pendant 30 min.
    3. Sonicate les cellules pendant 5 min (cycles de 5 s-5 s, amplitude 50%) puis retirez les débris cellulaires par centrifugation à 20 000 x g pendant 30 min, puis filtration sur filtre de 0,45 μm.
    4. Ajouter la résine Ni-NTA à la suspension (500 μL pour 500 mL de culture cellulaire) et mélanger délicatement à 4 °C pendant 1 h.
    5. Verser la suspension dans une colonne de polypropylène et recueillir la fraction non lié.
    6. Laver la résine avec 10 mL de tampon de lavage contenant 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM d’imidazole. Laver la résine une deuxième fois avec 5 mL de tampon de lavage (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole). Recueillir les fractions de lavage.
    7. Elute la protéine son-marqué avec 1 mL de tampon d’élitution (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole). Répétez cette étape 4 fois et collecter toutes les fractions d’élitution.
    8. Analyser le lysate brut ainsi que les 7 fractions de purification par SDS-PAGE sur un gel d’acrylamide de 12%.
    9. Combinez les fractions contenant de la protéine pure étiquetée His et dialysez-la contre 1 L de tampon de protéase TEV (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) pendant la nuit à l’aide d’une membrane de dialyse (MW coupé 6000-8000 Da). Mesurer la concentration de la protéine à 280 nm avec un coefficient d’extinction molaire de 37 360 cm-1◊M-1 et un poids moléculaire de 34,14 kDa pour mPsaA.

3. Retrait de l’étiquette d’histidine par digestion de protéase de TEV

  1. Recueillir l’échantillon de protéines dans un tube de 50 mL et ajouter le tampon TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) jusqu’à 1 mL à une concentration de 2 mg/mL.
    REMARQUE : La concentration peut varier en fonction des résultats précédents. Les concentrations de protéines que nous avons testées se trouvent dans une fourchette typique de 2 à 3 mg/mL.
  2. Ajouter 100 μL de protéase TEV (ajouter 1 μL contenant 10 unités de protéase TEV pour 20 μg de protéines à digérer).
  3. Ajouter 50 μL de 0,1 M de dithiothreitol (TNT).
  4. Avec tampon TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) jusqu’à 5 mL.
  5. Incuber toute la nuit à 4 °C avec des secousses lentes.
    REMARQUE : Si la digestion n’est pas terminée, ajouter plus de protéase TEV, incuber plus longtemps ou à une température plus élevée jusqu’à 30 °C.
  6. Dialyz la protéine digérée pour enlever l’EDTA à 4 °C pendant la nuit à l’aide d’une membrane de dialyse (coupure 6000-8000 Da) contre le tampon phosphaté (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM imidazole).
  7. Pour éliminer la protéase TEV et la protéine non digérée, incuber le mélange avec des perles Ni-NTA et mélanger délicatement pendant 1 h à 4 °C.
  8. Verser la suspension dans une colonne de polypropylène. Recueillir la fraction non lié et laver la colonne avec 5 mL de tampon de lavage (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole)
    REMARQUE : La protéine d’intérêt doit être récupérée dans les fractions non liées et de lavage.
  9. Elute la protéase TEV et la protéine non digérée en ajoutant 5 mL de tampon d’élitution (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole) sur la colonne. Vérifiez la teneur en protéines des fractions à 280 nm et par analyse SDS-PAGE.
  10. Vérifiez l’efficacité de la digestion en chargeant les échantillons digérés sur une PAGE SDS avec la protéine non digérée comme un contrôle.
  11. Dialyz la protéine digérée contre 1 L de tampon de clic (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) à 4 °C pendant la nuit avec une membrane de dialyse (coupure 6000-8000 Da) pour enlever l’imidazole ainsi que pour échanger le tampon, et mesurer la concentration de la protéine à 280 nm avec coefficient d’extinction molaire et poids moléculaire de mPsaA (37 360 cm-1◊M-1 et MW 34,14 kDa).

4. Évaluation de l’accessibilité et de la fonctionnalité non naturelles de propargyl-lysine d’acide aminé pour la chimie de clic

REMARQUE : Conjuguer le mPsaA avec 6-hexachloro-fluorescein-azide en utilisant le protocole décrit par Presolski et coll.20 pour la chimie de clic.

  1. Prenez 432,5 μL de protéines mutées par prk à une concentration de 57,8 μM dans un microtube de 2 mL.
    REMARQUE : Une concentration minimale de 2 μM d’alkyne est acceptable. Si la concentration en protéines est plus faible, concentrez-la avec un concentrateur centrifuge ou favorisez l’équilibre de la réaction en augmentant le rapport molaire azide/alkyne.
  2. Ajouter 10 μL de 5 mM 6-hexachloro-fluorescéine-azide, puis ajouter un préméx de 2,5 μL de solution CuSO4 à 20 mM et 7,5 μL de Tris (benzyltriazolylmethyl)amine (THPTA) à 50 mM (concentrations de solutions de stock).
    1. Ajouter 25 μL d’hydrochlorure aqueuse de 100 mM d’aminoguanidine.
    2. Ajouter 25 μL de 20 mg/mL une solution aqueuse extemporanéée d’ascorbate de sodium.
    3. Fermer le tube, mélanger en inversant plusieurs fois et incuber à température ambiante pendant 2 h.
    4. Arrêtez la réaction en ajoutant 50 μL de 0,5 M EDTA.
    5. Prendre 15 μL du mélange de réaction et le mettre un microtube, ajouter 5 μL de tampon de chargement (bleu bromophénol, SDS, β-mercaptoethanol), chauffer le mélange à 100 °C pendant 5 min, puis le charger dans un gel d’acrylamide de 12%. Après la migration, visualisez la conjuguée fluorescente sur le gel sous la lumière UV à 312 nm.

5. Conjugaison de mPsaA avec un antigène de hydrate de carbone azido-fonctionnalisé (Pn14TS-N3)par la chimie de clic

  1. Couplage
    1. Prenez 432,5 μL de protéines mutées par prk à 57,8 μM dans un microtube de 2 mL.
    2. Ajouter 10 μL de 5 mM Pn14TS-N321 dans l’eau puis ajouter un préméta de 2,5 μL de solution CuSO4 à 20 mM et 7,5 μL de THPTA à 50 mM.
      REMARQUE : La synthèse de Pn14TS-N3, un tétrasaccharide imitant le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae 14, a été décrite dans la référence 21. Théoriquement, n’importe quel antigène de hydrate de carbone contenant une fonction d’azide peut être employé.
    3. Ajouter 25 μL d’hydrochlorure d’aminoguanidine de 100 mM.
    4. Ajouter 25 μL de 20 mg/mL de solution aqueuse préparée de façon extemporanée d’ascorbate de sodium.
    5. Fermer le tube, mélanger en inversant plusieurs fois et incuber à RT pendant 2 h.
    6. Arrêtez la réaction en ajoutant 50 μL de 0,5 M EDTA.
    7. Prenez 15 μL d’échantillons et analysez par SDS-PAGE.
  2. Purification de filtration de gel du glycoconjugate
    1. Purifiez le glycoconjugate en l’appliquant à une colonne d’agarose d’exclusion stérique (15 x 600 dimensions de lit, plage de fractionnement de 3 000 à 70 000), équilibrée avec tampon PBS de 100 mM, pH 7,3 à un débit de 0,8 mL/min avec détection à 280 nm.
    2. Recueillir les fractions contenant le glycoconjugate.
      REMARQUE : Pour un stockage prolongé, dialyser le glycoconjugate contre 1 L de H2O deux fois pendant 2 h, puis passer la nuit à 4 °C à l’aide d’une membrane de dialyse (coupure Mw 6000-8000 Da), puis congeler-sécher et conserver le glycoconjugate à -80 °C.

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Representative Results

Dans le cadre de ce projet, un vaccin homogène contre la glycoconjugate a été préparé à l’aide de la stratégie de suppression du codon d’arrêt ambré pour introduire un UAA à un site défini (figure 1). L’adhésine de surface pneumoccocale A a été choisie comme protéine porteuse moiety. Cette protéine est fortement conservée et exprimée par toutes les souches de Streptococcus pneumoniae22. Il est hautement immunogène et précédemment utilisé comme porteur dans les formulations de vaccins antipneumococciques21,23. Comme preuve de concept, la paire UAA propargyl-lysine efficacement chargée par le type sauvage pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS)/tRNA paire de l’archée Methanosarcina mazei a été étudiée. Le propargyl-lysine est disponible dans le commerce, mais peut être préparé avantageusement à partir de Boc-L-lysine en seulement deux étapes synthétiques (Figure 2). Un codon ambré a été généré à une position désirée dans un plasmide pET24d contenant le gène mPsaA. Ce plasmide a été co-transformé avec un plasmide pEVOL (un cadeau aimable d’Edward Lemke (EMBL19) contenant les outils orthogonaux nécessaires pour incorporer la propargyl-lysine, dans la souche compétente E. coli BL21(DE3). Des clones co-transformés positifs ont été sélectionnés à l’aide de 25 μg/mL de kanamycine et de 30 chloramphéniphénicol de μg/mL. Le pEVOL plasmide contient à l’origine non pas une mais deux copies du codage génétique pour MmPylRS pour incorporer le résidu propargyl-lysine : la première copie est sous le contrôle d’un promoteur constitutif tandis que l’expression de l’autre est inductible en présence d’arabinose. Cependant, nous n’avons remarqué aucune diminution dramatique de l’incorporation propargyl-lysine si le gène MmPylRS sous le contrôle du promoteur constitutif est supprimé.

Le propargyl-lysine a été introduit à la position 32 en remplacement d’une lysine près du N-terminus du PsaA. Tout résidu avec une chaîne latérale exposée à la surface peut pratiquement être échangé en vue d’effectuer d’autres conjugaisons. La protéine mutée a été produite sous sa forme mature (mPsaAK32PrK)avec l’inclusion d’une séquence clivable d’étiquette de 6-histidine à son C-terminus. L’efficacité de la production de mPsaAK32PrK a été vérifiée par l’analyse SDS-PAGE et Western Blot à l’aide d’un anticorps anti-histidine tag, lorsque la croissance a été effectuée en présence ou l’absence de l’UAA propargyl-lysine et par rapport à la production de la mPsaA de type sauvage (Figure 3). La visualisation a révélé une bande protéique à un poids moléculaire prévu (voies 4, figure 3A et 3B). La présence d’une protéine pleine longueur indique fortement l’incorporation réussie de la PrK dans mPsaA. L’intensité est toutefois inférieure à celle observée pour les mPsaA de type sauvage (voies 2, figure 3A et 3B). Les fuites (c.-à-d. la production de la protéine pleine longueur sans incorporation de l’UAA) et la libération prématurée de la protéine par le facteur de libération RF1 pendant la traduction sont deux inconvénients principaux fréquemment rencontrés au cours de ce processus. D’une part, aucune bande au poids moléculaire prévu n’est visualisée en l’absence de propargyl-lysine, ce qui signifie qu’aucune fuite ne s’est produite (Voies 3, Figure 3A & 3B)et a indirectement confirmé que la bande observée sur les voies 4 correspond à la mPsaAK32PrK. D’autre part, aucune bande ne peut être vue à faible poids moléculaire qui pourrait correspondre à la forme tronquée de mPsaA (Voie 4 sur la figure 3A). Le mPsaAK32PrK a ensuite été purifié par chromatographie par affinité, avec un rendement typique de 8 mg/L (par rapport à 12-20 mg/L pour la protéine de type sauvage) et l’incorporation du résidu de propargyl-lysine a finalement été confirmée par spectrométrie de masse (figure 4). L’étiquette d’histidine a été enlevée sur le clivage protéolytique utilisant la protéase de TEV (figure 4). La stabilité du mPsaAK32PrK ainsi obtenue a été évaluée par dichroism circulaire, qui a montré que la structure de la protéine n’a pas été perturbée par la mutation de la Lysine 32 dans un propargyl-lysine (données non montrées).

Ayant le mPsaAK32PrK, la réactivité de l’alkyne pour la chimie de clic a été évaluée utilisant une fluorescéine azido-fonctionnalisée et plus loin employée pour conjuguer un antigène synthétique d’oligosaccharide β-2-azidoethyl d-Galp-(1→4)-β-d-Glcp-(1→6)-[β-d-Galp-(1→4)]-β-d-GlcpNAc (Pn14TS) (Figure 5). Cette tétrasaccharide est liée à la polysaccharide capsulaire de type S. pneumoniae 14 et a déjà été conjuguée à mPsaA à l’aide de différentes chimies de conjugaison8,21,24. Des expériences ici ont été faites en comparaison avec le type sauvage mPsaA comme un contrôle. L’étiquette d’histidine a d’abord été enlevée sur le clivage protéolytique utilisant la protéase de TEV. Les mPsaAK32PrK et mPsaA WT digérés ont ensuite été conjugués au fluoroprobe (figure 6A) ou Pn14TS ( figure6B). La réaction a été évaluée par SDS-PAGE. La faible augmentation du poids moléculaire de l’échantillon entre la voie 6 et 7 (figure 6B) indique une conjugaison réussie avec la tétrasaccharide Pn14TS. Enfin, le glycoconjugate a été purifié par filtration de gel et son identité confirmée par spectrométrie de masse (figure 6C). La conjugaison par la chimie de clic étant quantitative la majorité des mPsaAK32PrK a été conjuguée avec le Pn14TS-N3 comme illustré par les résultats de spectrométrie de masse (figure 6C).

Figure 1
Figure 1 : Incorporation de propargyl-lysine (PrK) dans mPsaA pendant la traduction à l’aide d’une paire orthogonale pyrrolysyl-tRNA synthétase/tRNA et de réaffectation tag codon25. Pendant la traduction, les synthetases endogènes catalysent le lien entre les acides aminés et les ARN t correspondants. Ensuite, les tARN chargés sont utilisés par les machines ribosomales pour générer le polypeptide néo-synthétisé. Selon la stratégie de suppression du codon d’arrêt ambré, une synthétase orthogonale d’aminoacyl-tRNA (aaRS) (ci-dessous une synthétase pyrrolysyl-tRNA de M. mazei),charge un UAA (ci-après PrK) sur son ARN t cognate qui a conçu l’anticodon peut lire le codon d’arrêt ambré (TAG) sur l’ARNm. Cette reconnaissance spécifique oriente l’incorporation de l’UAA dans le site spécifique de la protéine cible. Figure reproduite de Wang et coll.25. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Synthèse propargyl-lysine. (A) Étapes de synthèse propargyl-lysine. Insert: Surveillance de la dépprotection de Boc-l-Lys (prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH intermédiaire: chromatographie à couche mince sur plaques de gel de silice de 0,25 mm avec indicateur fluorescent (GF254) et visualisée en carbonisant avec de la vanilline dans de l’acide sulfurique/éthanol (1,5:95 v/v); eluent: CH2Cl2/MeOH (9:1), voie de gauche: Boc-l-Lys (prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH(Rf 0.90), voie de droite: propargyl-lysine brut,(Rf 0.38). 400 MHz 1H (B) et 13spectres NMR C (C) de propargyl-lysine enregistré en D2O. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Analyse des échantillons de cellules brutes. (A) Analyse SDS-PAGE et ( B )analyse de tacheoccidentale sur des échantillons de cellules brutes. Voie 1 : marqueur protéique non taché; Voie 2 : extrait de cellules brutes de type sauvage mPsaA; Voie 3: extrait de cellules brutes de mPsaAK32TAG cultivé en l’absence de PrK; Voie 4 : extraction de cellules brutes de mPsaAK32TAG cultivées en présence de PrK. Conditions : gel d’acrylamide de 12 %, fonctionnant à 100 V, 2 h. SDS-PAGE taché de bleu Coomassie; Western Blot a révélé à l’aide d’anticorps anti-histidine tag et anticorps secondaire couplé avec AlexaFluor680. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Élimination de l’étiquette histidine et analyse de la spectrométrie de masse. (A) Analyse SDS-PAGE. Voie 1 : marqueur protéique non taché; Voie 2 : extrait brut de cellules ; Voie 3 : fraction non lédée; Voie 4 : fraction de lavage avec imidazole de 10 mM ; Voie 5 : fraction de lavage avec imidazole de 20 mM ; Conditions: gel d’acrylamide 12% fonctionnant à 100 V pour 2 h, et taché par coomassie bleu; (B) MALDI-TOF-MS spectres de (haut) mPsaA WT, théorique MW 33 103 Da, trouvé 33 106 Da et (en bas) mPsaA K32PrK, théorique 33 184 Da, trouvé 33 192 Da. Les masses trouvées sont dans l’erreur de marge attendue. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Représentation schématique de la stratégie de conjugaison en cliquant sur la chimie. Un seul tétrasaccharide portant un azide est spécifiquement couplé à son groupe complémentaire d’alkyne biorthogonal sur mPsaA K32PrK (représentation mPsaA basée sur le fichier PDB 1PSZ, avec une résolution de 2.0 Å26). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Digestion et conjugaison de l’étiquette histidine de mPsaA avec (A) fluorescéine-N3 et avec (B) Pn14TS. (A) Voies SDS-PAGE 1-3: WT mPsaA; Voie 4-6: mPsaAK32PrK; (B) Voie 1 : marqueur protéique non taché; Voie 2-4: WT mPsaA; Voie 5-7: mPsaAK32PrK. 2 μg échantillon/voie protéique, 12% acrylamide, 100 V, 2 h; (C) MALDI-TOF-MS spectres de la Pn14TS-mPsaAK32PrK théorique MW 34 091 Da, trouvé 34 088 Da. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Dossier supplémentaire 1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Cliquez à droite pour télécharger).

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Discussion

La mutagenèse dirigée par le site est une stratégie simple visant à incorporer des acides aminés spécifiques à une position définie d’une protéine qui reste à peine utilisée dans le but de préparer des vaccins glycoconjugate7,8,14. La mutagenèse classique basée sur l’approche des 20 acides aminés naturels est très efficace puisqu’aucune modification des machines de traduction n’est nécessaire. Les mutations de cystéine sont habituellement visées pour explorer davantage la réactivité unique de thiol directement ou en deux étapes(par exemple,après sa modification dans un intermédiaire de déshydroalanine, une stratégie appelée mutagenesis post-translationnel)27,28. L’expansion du code génétique est peut-être encore plus attrayante et flexible puisqu’elle permet l’incorporation directe d’un large éventail d’AUA avec diversesfonctionnalités 9,10. Alors que plusieurs UUA peuvent être incorporés simultanément dans une protéine29, le nombre de mutations est généralement plus limité. Nous avons appliqué la stratégie connexe de codon d’arrêt d’ambre pour introduire un propargyl-lysine simple dans une protéine porteuse. L’incorporation peut avoir lieu à n’importe quelle position à condition que la chaise latérale de l’acide aminé initial ait été exposée à la surface, un critère facilement déterminé à partir de structures cristallographiques à rayons X ou dans la modélisation silico. En outre, il n’est pas limité à propargyl-lysine, mais peut être étendu à n’importe quel UAA fonctionnalisé avec une fonction biorthogonale qui servira plus tard d’ancrage pour greffer l’antigène de glucides entrant et pour lequel une paire orthogonale aaRS/ tRNA existe.

Un des inconvénients de la stratégie est la production possible de protéines tronquées, résultant de la libération de la sidechain peptidyl lors de la lecture du codon d’arrêt ambré, comme un produit secondaire. Même si nous n’avons observé aucune forme tronquée ici (probablement dégradée par les bactéries à cause de sa très petite taille), une étiquette d’histidine a été ajoutée au C-terminus de la protéine pour faciliter la purification de la protéine mutée pleine longueur attendue des impuretés et sensiblement de la protéine tronquée (qui par essence n’exprime pas la séquence d’étiquette d’histidine). Cela peut devenir essentiel si l’incorporation uaa est effectuée près de la protéine C-terminus puisque la purification ne peut pas être tentée en utilisant des techniques alternatives de chromatographie comme la filtration de gel.

Pour la plupart des applications, la suppression de l’étiquette histidine n’est pas obligatoire. Cependant, il peut être utile en ce qui concerne la conception du vaccin glycoconjugate dans le cadre du système immunitaire peut être détourné contre la séquence d’étiquettes. Pour cette preuve de concept, nous avons inséré une séquence de longueur d’acide aminé spécifiquement fendues par la protéase TEV qui laisse cinq acides aminés supplémentaires sur la protéine porteuse après digestion.

L’étape de conjugaison entre l’alkyne du propargyl-lysine et un oligosaccharide synthétique représentatif Pn14TS lié à une capsule pneumococcique et portant un azide complémentaire a été effectuée selon un protocole de chimie de clic rapporté par Presolski et autres.20 Si nécessaire, l’achèvement de la réaction peut facilement être atteint en augmentant le temps de réaction ou en modifiant le rapport entre les réactionnaires et les réavants d’alkyne, d’azide et de cuivre. Les sels de cuivre sont éliminés par un traitement avec excès d’EDTA suivi d’une courte purification par chromatographie d’exclusion stérique.

Le glycoconjugate obtenu avec la technique décrite dans le présent travail peut alors être utilisé pour immuniser les souris. Le fait d’avoir une glycoconjugate entièrement définie et facilement modulée dans les mains fournit des outils précieux pour évaluer l’impact de la connectivité hapten/protein carrier sur la réponseimmunitaire 8. Puisque l’augmentation du rapport hapten/protéine est souvent corrélée avec la réponse humoristique améliorée d’anti-hapten en utilisant les haptenscourts 30,on pourrait être intéressé à tester des conjugués avec des haptens multiples. L’incorporation de multiples UUA nécessite cependant quelques ajustements du protocole car l’incorporation d’un UAA dans la protéine tend à diminuer le rendement de la production de protéines en raison de l’activité RF1.

En définitive, cette méthode est un outil puissant pour avoir accès à des vaccins homogènes de glycoconjugate facilitant leur caractérisation physico-chimique et d’autres études de relation d’antigène de hydrate de carbone/porteur de connectivité-immunogénicité.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

E.C. remercie le soutien financier de La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program « BioSynProt »), en particulier une bourse doctorale à T.V. Nous reconnaissons également le Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, France) pour ses précieux conseils techniques.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AIM (autoinductif medium) Formedium AIMLB0210 Solid powder
Boc-Lys-OH Alfa-Aesar H63859 Solid powder
BL21(DE3) Merck Novagen 69450 E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin Machery Nagel Protino Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH this study same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT this study pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate Sigma-Aldrich 460923 Liquid
Sonicator Thermo Fisher FB120-220

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Glycoconjugate homogène produit par combined unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glycoconjugate Produit par Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glycoconjugate Produit par Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes Homogeneous Glyc
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Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., Grandjean, C., Camberlein, E. Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes. J. Vis. Exp. (166), e60821, doi:10.3791/60821 (2020).

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