Summary
氧化铁纳米粒子通过无味溶胶程序合成,并涂有离子短分子或聚合物。利用磁力计(VSM)来监测人类干细胞内磁纳米粒子的整合和生物转化。
Abstract
由氧化铁制成的磁性纳米粒子对广泛的生物医学应用有着特殊的兴趣,它们经常被内化在细胞中,然后留在细胞内。一个挑战是用可靠和精确的方法评估他们在细胞内环境中的命运。在此,我们介绍了振动样品磁力计 (VSM) 的使用,通过测量其磁力矩精确量化细胞内磁性纳米粒子的完整性。干细胞首先被标记为两种类型的磁性纳米粒子:纳米粒子具有通过快速高效的微波无味溶胶合成产生的相同核心,其涂层也不同:常用柠檬酸分子与聚丙烯酸相比。然后通过离心实现3D细胞球体的形成,用VSM在不同时间测量这些球体的磁力矩。获得的时刻是纳米粒子完整性的直接指纹,其值下降表明纳米粒子退化。对于两个纳米粒子来说,磁性时刻会随着培养时间的减少而减少,揭示它们的生物降解。与柠檬酸相比,还显示了聚丙烯酸涂层的保护作用。
Introduction
人们越来越关注氧化铁纳米粒子的磁性特征,用于广泛的生物医学应用。他们对磁共振的反应使得它们成为磁共振成像(MRI)的可靠对比剂,这是再生医学的一个优势,在植入1后,可以跟踪带有磁纳米粒子的细胞。利用磁场,也可以在远处引导细胞:这样,细胞球体2,3,环4,或表5可以进行磁力工程,也可以远程刺激6,在无脚手架组织发展的资产。这些纳米粒子的可能性范围还包括药物输送系统7,8和磁性和光诱导的高温治疗杀死癌细胞9,10,11。对于所有这些应用,纳米粒子通过静脉注射或直接内化在细胞中集成在生物环境中,然后留在细胞内,这使人对其细胞内的命运产生疑问。
在体内分析传达了对纳米粒子在生物体中命运的一般理解:在血液中注射后,它们首先被肝脏(库普弗细胞)、脾脏和骨髓的巨噬细胞捕获,逐渐退化,并加入生物体12、13、14、15、16、17、18、19的铁池。只有由于纳米粒子在整个生物体中的循环,才能进行定性观测。通常,传输电子显微镜 (TEM) 可用于直接观察纳米粒子,并且可以通过剂量确定器官中铁的存在。最近,他们的命运被直接评估在细胞池,这意味着在近距离电路没有铁逃逸,允许定量测量他们的生物转化在细胞水平20,21,22。通过分析与其结构完整性密切相关的纳米粒子的磁性,可以进行此类测量。振动样品磁力计 (VSM) 是一种定期振动样品的技术,因此所诱导的通量线圈测量提供了应用磁场样品的磁时刻。这种同步检测允许快速测量,这是确定大量样品20,21,22,23的磁时刻的资产。然后,VSM检索到的宏观磁信号对与纳米粒子的大小和结构直接相关的整个生物样本进行了定量概述。特别是,它提供了样品饱和时的磁时刻(以 emu 表示),这是直接量化样品中存在的磁性纳米粒子的数量,分别到其特定的磁性。
结果表明,磁性纳米粒子的细胞内处理与其结构特征紧密相连。这些功能可以通过最佳的合成协议进行控制。每个协议都具有优点和局限性。氧化铁纳米粒子通常通过共生铁离子24在液态溶液中合成。为克服纳米粒子尺寸多分散性的局限性,已开发出聚醇介质溶胶法等其他合成方法25种。通过热分解的无声方法导致生产非常校准的氧化铁纳米粒子26。然而,使用大量的表面活性剂,如烯酰胺或油酸,使其功能化和生物医学应用的水转移复杂化。因此,我们通过一条无糖溶胶路线合成这种磁性纳米粒子,从而达到高晶度、纯度和可重复性。该协议产生控制良好的大小纳米粒子,可以通过温度变化28调整。然而,微波辅助的非水溶胶路由的纳米粒子的上限约为12纳米。此程序将不适用于在室温下使用铁氧颗粒的应用。除了核心合成,另一个主要功能要考虑的是涂层。涂层位于纳米粒子表面,充当锚定分子,帮助纳米粒子有针对性地内化,或者保护纳米粒子免受降解。由于苯乙醇同时作为氧气源和配体,光裸纳米粒子的产生无需额外的表面活性剂或配体。然后,纳米粒子在没有表面活性剂交换过程的情况下,在合成后很容易表面功能化。
其中,评估了两种纳米粒子,它们的核心相同,涂层也不同。该核心采用快速高效的微波技术合成。比较的两种涂层包括柠檬酸,这是生物医学应用中用作涂层剂最多的涂层之一,29、30和聚丙烯酸 (PAA), 聚合物涂层具有大量的溷合功能。然后,VSM磁力计测量首先用于量化细胞吸收的纳米粒子,然后作为干细胞内化后纳米粒子结构完整性的直接评估。结果表明,孵化浓度影响纳米粒子的吸收,涂层影响其降解,PAA的大量锚定分子保护核心免受降解。
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Protocol
1. 磁纳米粒子的合成
- 核心合成–微波辅助
- 溶解 400 毫克铁 (III) 乙酰乙酰酮 (+99.9%)在 10 mL 苯酒精 (BA, 99.8%)在30毫升单波玻璃瓶内。
- 在20分钟内将悬架的温度从25°C提高到250°C(以11.25°C/min的速度),并使用微波反应器将其保持在250°C30分钟。
- 将苯醇中悬浮的纳米粒子转移到玻璃瓶中,使用新磁铁分离纳米粒子30分钟。
- 用10毫升二氯甲烷、1 M氢氧化钠、乙醇、pH 7水(三次)清洗前100毫升玻璃瓶中的沉淀物,每步用新钛磁铁清洗5分钟,使纳米粒子颗粒化并去除超生剂。
- 使用 1M 盐酸将水中的纳米粒子悬架调整为 pH 2,然后在 100 kDa 超中分子过滤器中离心,在 2,200 x g 下使用 10 分钟。
- 取出滤液,在纳米粒子溶液中加入12 mL的10-2M 盐酸,在100千达超中度滤液中离心机在2,200 x g 下10分钟(三次)。然后在涂层前将纳米粒子溶液稀释在 10 mL 内10-2 M 盐酸。
- 涂层
- 在 100 mL 玻璃瓶中以 pH2 在水中稀释 175 毫克柠檬酸和聚丙烯酸,并使用 1M 盐酸溶液将 pH 调整为 2。
- 将10 mL纳米粒子液分散到涂层分子溶液中,相当于涂层分子和纳米粒子之间的质量比为5。在室温下在磁性搅拌下搅拌2小时。
- 反应后,用1M氢氧化钠将pH调整为7。
- 将纳米粒子溶液与去离子化 (DI) 水混合 3 次,在 100 kDa 超中度滤清器中以 2,200 x g 的速度 喷水 10 分钟:在 12 mL 的 DI 水中去除过滤液并稀释纳米粒子溶液。
2. 干细胞的培养和磁性标记
- 培养人类间质干细胞(MSC)在完整的间质干细胞生长介质(MSCGM)在37°C和5%二氧化碳。当细胞处于 90% 的汇合处时,以每 150 cm2 烧瓶 37°C 的速度加入 10 mL 的尝试素-EDTA 预热,然后离开 2-3 分钟分离细胞。
- 要知道细胞何时分离,使用明亮的场显微镜观察它们。将MSCGM中的分离细胞重新悬浮,并将它们分成四个150厘米2的烧瓶。通过这种方式放大细胞,直到通道4到5。
- 为细胞标签准备磁性纳米粒子的溶液:将选择的氧化铁纳米粒子浓度分散在无血清罗斯韦尔公园纪念研究所介质(RMPI-1640)中,无谷氨酰胺。RPMI 用于纳米粒子孵化(和相关冲洗步骤),因为它的离子强度低于 DMEM,可更好地防止纳米粒子聚集事件。
- 当细胞处于通道 4 或 5 和 90% 的交汇处时,去除 MSCGM 介质,用无血清 RPMI(无谷氨酰胺)冲洗细胞,每 150 cm2 培养瓶添加 10 mL 氧化铁纳米粒子溶液,这是覆盖所有细胞所需的最小体积。
- 在37°C和5%二氧化碳 下孵化30分钟,然后丢弃纳米粒子溶液。用无血清RPMI-1640(无谷氨酰胺)清洗一次,用Dulbecco的改良鹰介质(DMEM)孵化,辅以10%FBS和1%青霉素链霉素(每150厘米2瓶25 毫升),在37°C和5%二氧化碳 下过夜,使纳米粒子完全内化。
3. 干细胞球体的形成
- 新鲜制备由DMEM高葡萄糖和L-谷氨酰胺组成的细胞球体培养介质,辅以50μM L-抗坏血酸2-磷酸盐, 0.1 μM 德萨美松,1 米硫酸钠,0.35 m M L-丙氨酸,以及 1% 含有胰岛素、人类转移素和 Selenous 酸 (ITS-Premix) 的通用培养补充剂。
- 通过添加 10 mL 的 0.05% 的尝试-EDTA 预热,每 150 厘米2 瓶 37 °C 分离磁性 MSC 2-3 分钟。当细胞分离时,立即灭活胰腺素,加入1/3的DMEM体积,补充10%FBS和1%青霉素链霉素预热在37°C。
- 将分离细胞以260 x g 为5分钟,吸气介质,并在细胞球体培养介质的小体积(每150厘米2瓶不到1 mL)中重新悬浮细胞,例如在大约50μL的介质中拥有200,000个细胞。使用血细胞计计算细胞数,并在需要时调整体积。
- 在 15 mL 无菌圆锥形离心管中加入 1 mL 新鲜制备的细胞球体培养介质,并添加相当于 200,000 个细胞的重新悬浮溶液体积。
- 将这些磁性标记的细胞在180 x g 上离心3分钟,例如在管子底部形成细胞颗粒,并保持超纳坦,这是细胞培养介质。
- 稍微打开管子,让空气交换和孵育在37°C与5%二氧化碳 长达21天,培养时间沿细胞形成一个凝聚力的3D结构,导致一个完全形成的球体。每周更换两次介质。
- 在给定的日子里,用在去纳化水中稀释的0.2M可可地酸盐制成的可可酸酯缓冲液两次清洗球形,并在室温下用2%的谷胱甘肽在蒸馏水中稀释30分钟。将固定球体存储在PBS中,直至用于VSM测量或TEM成像。这个固定步骤停止所有生物过程,并允许长期保护。
4. 使用振动样品磁力计(VSM)在溶液和纤维素中量化磁纳米粒子
- 将一定体积的磁性纳米粒子溶液(最大 10 μL)或单个细胞球体放入专门设计用于 VSM 的样品架中。
- 将样品插入 VSM 并扫描以进行样品偏移。将样品放置在与磁化最大值对应的位置。
- 以 20 Oe/s 的速率在低磁场(-1500 Oe 和 +1500 Oe 之间)进行首次测量。
- 以 200 Oe/s 的速率在高磁场(-30 000 Oe 和 +30 000 Oe 之间)进行第二次测量。
5. 传输电子显微镜分析
- 对于纳米粒子溶液,将 10 μL 的液态溶液沉积到碳涂层铜网格中,使其在室温下干燥。
- 对于细胞内化的纳米粒子,将固定细胞球体与乌龙茶提取物 (OTE) 进行对比,在 0.1 M 可可酸酯缓冲液中稀释 0.5%,在 1% 的四氧化硅中固化后含有 1.5% 氰化钾,然后在分级乙醇浴池中脱水,包括在 Epon 中。切片超切 70 nm 并将其沉积到库珀网格中。
- 使用80千伏的电子显微镜拍摄图像,放大倍数从1k用于观察整个细胞到40k用于观察内分泌室。
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Representative Results
使用微波辅助合成,产生单分散 8.8 ± 2.5 纳米核心尺寸的磁性纳米粒子,并涂上柠檬酸盐或 PAA(图 1A)。然后,干细胞与这些纳米粒子一起在培养基中以给定的浓度分散30分钟,导致其内分泌和细胞内分泌(图1B)内。然后,磁性干细胞悬浮在介质、离心体中,形成的细胞颗粒培养长达21天(图1C)。获得的球体是固定的,例如停止生物过程,并保存在PBS中,直到通过VSM测量。
首先,使用VSM测量纳米粒子溶液的磁性时刻:测量含有7μg铁的纳米粒子液分散的10微升,获得的曲线显示在图2A中。由于此溶液中存在水,并且对于样品持有人,除了纳米粒子的超下磁信号外,还捕获了诊断信号。可以测量与曲线第二部分的坡度对应的诊断常数 (Mdia),如图 2A所示,此常数可以减去,例如仅获取纳米粒子的磁力矩(M样本= M - Mdia)。然后可以提取纳米粒子的饱和磁化:它对应于518μemu用于液态分散,这意味着溶液为74 emu/g的铁(Fe),相当于52 emu/g的纳米粒子(Fe3O4)。
同样可以获得细胞球体的磁力矩。在这种情况下,将细胞球形(由 200,000 个细胞组成)插入样本持有人,放置在 VSM 中并测量(图 2B)。获得的磁时值远远低于最初的纳米粒子溶液:但是,它们仍处于检测范围内。此特定样品的饱和磁化为 69μemu。此外,这种球形含有1.3μg的纳米粒子(每个细胞6.7pg的纳米粒子),符合52 emu/gFe3O4的饱和值。因此,该值可用于确定细胞样本中的纳米粒子量。在 图2C中,与标有三浓度柠檬酸盐涂层纳米粒子的细胞相对应的球形在贴标签一天后被测量。结果清楚地表明,纳米粒子的吸收取决于孵化浓度,浓度分别为0.125、0.25和0.5 mM,导致每个球体的铁吸收量分别为0.3、0.7和1.3 μg,即每个细胞1.3、3、3和6.7 pg的铁。
人们已经注意到表面涂层的重要性,它与生物环境直接相互作用。这里已经生产了两种涂料:一种用于生物医学应用的柠檬酸盐涂层和一种 PAA 涂层,具有较高的溷合功能。干细胞被标记为这两种类型的纳米粒子和离心,如形成一个细胞颗粒,然后成为一个有凝聚力的细胞球体(图3A)。这些细胞球体的磁性在第 1 天和第 21 天通过 VSM 测量(图 3B 和 图 3C)。结果表明,在培养的21天中,磁力下降,表明纳米粒子的生物降解,这种降解对于柠檬酸盐涂层的纳米粒子(图3B)比PAA涂层的纳米粒子(图3C)更重要。TEM图像确认纳米粒子的降解,并显示较小的(6纳米大小)浅灰色点的外观,典型的铁氧体装载铁。还可以观察到一些完好无损的纳米粒子,特别是PAA涂层。
图1:氧化铁(Fe3O4)纳米粒子的微波辅助合成,它们在干细胞中的内化以及细胞作为球形的后续培养。(A) 纳米粒子合成各个步骤的示意图。首先,核心通过非液溶胶程序合成。涂层分子,无论是柠檬酸盐(Cit)或聚丙烯酸(PAA),然后嫁接在氧化铁芯的表面。具有代表性的 TEM 图像显示了带柠檬酸盐涂层的合成纳米粒子。(B) 干细胞内化纳米粒子的示意图,显示纳米粒子在内化后被限制在内体中。代表性的TEM图像还显示了细胞内的柠檬酸盐和PAA涂层纳米粒子,这些纳米粒子被限制在内体中。(C) 干细胞球体形成原理图。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2:通过VSM测量样品磁性时刻。(A) 通过VSM测量分散在液态溶液中的10μL纳米粒子。获得的信号代表了这种纳米粒子溶液在磁场(B)功能中的磁性时刻。然后,可以测量来自水的存在和样品持有人的直径,因为它对应于曲线第二部分的斜率,并减去,如只获得纳米粒子的磁力矩。然后可以确定饱和(Ms) 的磁性时刻。(B) 细胞球体的磁性时刻同样可以获得:在这种情况下,在给定时间段内测量单个细胞球体。(C) 与标有柠檬酸盐涂层纳米粒子的细胞相对应的球形曲线,三个独立浓度为 0.125 mM(橙色)、0.25 mM(灰色)和 0.5 mM(蓝色)。请点击这里查看此数字的较大版本。
图3:通过VSM对纤维素中的磁性纳米粒子降解进行量化。(A) 在用磁纳米粒子标记细胞时,细胞颗粒是由离心形成的(第0天)。然后,细胞形成一个凝聚力结构,从而产生一个易于处理的细胞球体,可以在培养中保存,而不会长时间(几个月)细胞流失。(B, C)其中,两种磁性纳米粒子,涂有柠檬酸盐(B)或PAA(C),在干细胞中内化,细胞被培养为球形长达21天。用VSM测量培养了1天(橙色曲线)和21天(灰色曲线)的球形磁性,磁力的降低表明纳米粒子的退化。第21天拍摄的代表性TEM图像显示,大约6nm的浅灰色点在细胞的内生体和细胞质中是大小,铁储存蛋白(黑箭头)的典型大小和形状。也可以观察到一些完整的纳米粒子,主要是PAA涂层的纳米粒子(棕色箭头)。 请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
使用快速高效的微波合成,磁性纳米粒子可以轻松合成,控制大小,并进一步涂上给定分子。关键的一步是在真空下储存铁盐和苯基醇,以保持小的分散大小。苯基醇同时作为溶剂和配体,允许直接获得校准裸氧化铁,而无需额外的配体。纳米粒子在水中转移后,裸露的磁性纳米粒子可以很容易地涂上多种配体。这种涂层具有纳米粒子和纳米粒子细胞相互作用的特性,可以影响其细胞内化,生物医学应用需要严格控制这一参数,因为内化程度过高可能会损害细胞,并可能产生细胞毒性事件31。磁力学是评估纤维素中磁纳米粒子内化和命运的有力工具。磁纳米粒子加入干细胞后,球形可以通过简单的离心形成,然后培养在阻止细胞增殖并推动细胞外基质生成的介质中形成。细胞变得高度凝聚力,并开始创建一个组织。然后,球体很容易处理,可以培养很长一段时间(几个月),从而能够长期跟踪磁纳米粒子在生物环境中的命运。通过停止细胞分裂,纳米粒子不会从母细胞稀释到女儿细胞:此外,已经证实,有了这种细胞球形模型,没有铁逃脱超过一个月的文化21,22,23。因此,磁值的降低只能与纳米粒子的降解相对应,而不能与从细胞中出口的铁相对应。
通过VSM测量细胞球体的磁性,提供快速精确的量化。其他方法也已探索,以测量细胞磁性,如使用超导接口设备(SQUID),一台机器通常比VSM更精确,灵敏度约10-7 emu相比,10-6 emu的VSM,但操作成本更高32。在实验设置中,VSM 允许测量磁铁剂量低于 2 pg/细胞的灵敏度非常精确,因为低于 2 pg/细胞的铁剂量对于目标应用来说太低,例如细胞对磁性的吸引力,用于细胞制导和组织工程目的。VSM 和 SQUID 磁力学除了允许对细胞磁性进行量化外,还可以提供有关纳米粒子特征的其他详细信息。通过分析获得的信号,可以扣除纳米粒子的大小22,23,还可以获得其磁性特征的一般概念,例如,纳米材料的滞后性和胁迫性可以揭示出来。另一种磁力学方法也存在,如磁光学,包括测量单个细胞的速度时,吸引到磁铁和单个细胞的磁力推断33,34。单细胞级的磁性可以这样获得:但是,无法确定其他纳米粒子特性。此外,最近还使用了与样品磁性成正比的小型磁性传感器,其模型与类似的细胞球形模型相称。这种磁性传感器允许在7天35内实时、连续地跟踪磁纳米粒子的生物降解。但是,这种磁性传感器的信号不能直接转换成磁矩,因为它取决于纳米粒子的大小。因此,每个纳米粒子设计都需要执行校准曲线,该曲线可以使用 VSM 实现。
此处使用 VSM 进行的测量表明,细胞环境中的磁纳米粒子逐渐退化,这表明磁性降低。他们还证明,涂有不同分子的相同核心会根据涂层以不同的速度降解。在比较 PAA 和引文涂层时,PAA 可导致更高的核心保护降解,很可能是由于其强锚定到磁芯20。磁性纳米粒子在细胞内环境中的命运在细胞球体上进行评估:但是,该方法并不局限于它。事实上,它可以推断为细胞悬浮物,它已经被用来评估干细胞分化对纳米粒子22的命运的影响。它揭示了,根据分化途径,磁纳米粒子由细胞以不同的方式处理,在某些情况下,铁在溶解时具有新结晶。因此,VSM磁力学是进一步探索纳米粒子和细胞特性对氧化铁纳米物体的细胞内处理的影响的有用工具。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了欧洲联盟(ERC-2014-CoG项目马蒂斯#648779)的支持。作者想承认巴黎大学13号的CNanoMat物理化学特征平台。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
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