Summary
Järnoxidnanopartiklar syntetiseras via en nonaqueous sol gel förfarande och belagda med anjoniska korta molekyler eller polymer. Användning av magnetometri för övervakning av införlivande och biotransformationer av magnetiska nanopartiklar inuti mänskliga stamceller demonstreras med hjälp av en vibrerande provmagnetometer (VSM).
Abstract
Magnetiska nanopartiklar, tillverkade av järnoxid, utgör ett märkligt intresse för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar för vilka de ofta internaliseras i celler och sedan lämnas inuti. En utmaning är att bedöma deras öde i den intracellulära miljön med tillförlitliga och exakta metoder. Häri introducerar vi användningen av den vibrerande provmagnetometern (VSM) för att exakt kvantifiera integriteten hos magnetiska nanopartiklar i celler genom att mäta deras magnetiska ögonblick. Stamceller är först märkta med två typer av magnetiska nanopartiklar; nanopartiklarna har samma kärna som produceras via en snabb och effektiv mikrovågsbaserad nonaqueous sol gel syntes och skiljer sig åt i sin beläggning: den vanliga citronsyramolekylen jämförs med polyakrylsyra. Bildandet av 3D-cellsfäroider uppnås sedan via centrifugation och det magnetiska ögonblicket för dessa sfäroider mäts vid olika tidpunkter med VSM. Det erhållna ögonblicket är ett direkt fingeravtryck av nanopartiklarnas integritet, med sjunkande värden som tyder på en nanopartikelnedbrytning. För båda nanopartiklarna minskar det magnetiska ögonblicket med kulturtid och avslöjar deras biologiska nedbrytbarhet. En skyddande effekt av polyakrylsyrabeläggningen visas också, jämfört med citronsyra.
Introduction
Det finns ett ökat intresse för de magnetiska egenskaperna hos järnoxidnanopartiklar för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar. Deras svar på magnetisk resonans gör dem till tillförlitliga kontrastmedel för magnetisk resonanstomografi (MRT), en fördel inom regenerativ medicin där celler märkta med magnetiska nanopartiklar kan spåras in vivo efter implantation1. Med hjälp av magnetfält kan celler också styras på avstånd; På så sätt kan cellulära sfäroider2,3,ringar 4ellerark 5 konstrueras magnetiskt och också fjärrstimuleras6, en tillgång i utvecklingen av byggnadsställningsfria vävnader. Utbudet av möjligheter för dessa nanopartiklar inkluderar också läkemedelsleveranssystem7,8 och magnetisk och fotoinducerad hypertermisk behandling för att döda cancerceller9,10,11. För alla dessa tillämpningar integreras nanopartiklarna i den biologiska miljön antingen genom intravenös injektion eller via direkt internalisering i celler och lämnas sedan inom, vilket ifrågasätter deras intracellulära öde.
In vivo-analyser förmedlade en allmän förståelse av nanopartiklarnas öde i organismen: vid injektion i blodet fångas de först mestadels av leverns makrofager (Kupffer-celler), mjälte och benmärg, bryts gradvis ned och går med i organismens järnpool12,13,14,15,16,17,18,19. Kvalitativa observationer är endast möjliga på grund av cirkulationen av nanopartiklarna i hela organismen. Vanligtvis kan överföring av elektronisk mikroskopi (TEM) användas för att direkt observera nanopartiklarna och närvaron av järn i organen kan bestämmas genom dosering. På senare tid har deras öde bedömts direkt på en cellpool, vilket betyder i nära krets utan järnflykt, vilket möjliggör en kvantitativ mätning av deras biotransformationer på cellnivå20,21,22. Sådana mätningar är möjliga genom analys av nanopartiklarnas magnetiska egenskaper som är tätt kopplade till deras strukturella integritet. Vibrerande provmagnetometri (VSM) är en teknik där provet vibreras regelbundet så att spolemätningen av det inducerade flödet ger provets magnetiska ögonblick vid det applicerade magnetfältet. Sådan synkron detektion möjliggör en snabb mätning, vilket är en tillgång för att bestämma de magnetiska ögonblicken i ett stort antal prover20,21,22,23. Den makroskopiska magnetiska signaturen som hämtats av VSM ger sedan en kvantitativ översikt över hela det biologiska provet som är direkt korrelerat med nanopartiklarnas storlek och struktur. I synnerhet ger det det magnetiska ögonblicket vid mättnad (uttryckt i emu) av proverna, vilket är en direkt kvantifiering av antalet magnetiska nanopartiklar som finns i provet, respektive deras specifika magnetiska egenskaper.
Det har visat sig att den intracellulära bearbetningen av magnetiska nanopartiklar är tätt kopplad till deras strukturella egenskaper20. Dessa funktioner kan styras via optimala syntesprotokoll. Varje protokoll ger fördelar och begränsningar. Järnoxidnanopartiklar syntetiseras ofta i vattenlösningar via koprecipitation av järnjoner24. För att övervinna begränsningarna hos nanopartiklar storlek polydispersitet, andra syntes metoder såsom polyol-medierade sol-gel metoder har utvecklats25. Nonaqueous tillvägagångssätt genom termisk nedbrytning leder till produktion av mycket välkalibrerade järnoxid nanopartiklar26. Användningen av enorma mängder tensider som oleylamin eller oljesyra komplicerar dock deras funktionalisering och vattenöverföring för biomedicinska tillämpningar. Av denna anledning syntetiserar vi sådana magnetiska nanopartiklar genom en nonaqueous sol gel rutt som leder till hög kristalllinitet, renhet och reproducerbarhet27. Detta protokoll producerar välkontrollerade nanopartiklar i storlek som kan justeras genom temperaturvariation28. Den mikrovågsassisterade icke-vattenhaltiga solgelvägen har dock en övre storleksgräns för de erhållna nanopartiklarna på cirka 12 nm. Detta förfarande skulle inte anpassas för applikationer med ferromagnetiska partiklar vid rumstemperatur. Förutom kärnsyntesen är beläggningen en annan huvudfunktion som ska beaktas. Beläggningen ligger på nanopartiklarnas yta och fungerar som en förankringsmolekyl som hjälper nanopartiklarnas riktade internalisering, eller så kan den skydda nanopartiklarna från nedbrytning. Eftersom bensylalkohol fungerar som en syrekälla och en ligand samtidigt produceras nakna nanopartiklar utan behov av ytterligare tensider eller ligands. Nanopartiklarna ytbehandlas sedan enkelt efter syntesen utan en surfaktantutbytesprocess.
Häri bedöms två typer av nanopartiklar som har samma kärna och skiljer sig åt i beläggningen. Kärnan syntetiseras med hjälp av en snabb och högeffektiv mikrovågsbaserad teknik. De två beläggningarna som jämförs består av citronsyra, en av de mest använda som beläggningsmedel i biomedicinskatillämpningar 29,30, och polyakrylsyra (PAA), en polymerbeläggning med ett stort antal kelaterande funktioner. VSM-magnetometrimätningar används sedan först för att kvantifiera cellernas nanopartiklars upptag och sedan som en direkt bedömning av nanopartiklarnas strukturella integritet vid internalisering i stamceller. Resultaten visar att inkubationskoncentrationen påverkar nanopartikelupptaget och att beläggningen påverkar deras nedbrytning, med det stora antalet förankringsmolekyler av PAA som skyddar kärnan från nedbrytning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntes av magnetiska nanopartiklar
- Kärnsyntes – mikrovågsassisterad
- Lös upp 400 mg järn(III) acetylacetonat (>99,9%) i 10 ml bensylalkohol (BA, 99,8 %) inom en 30 ml monovågs glasflaska.
- Öka suspensionens temperatur från 25 till 250 °C på 20 minuter (med en hastighet av 11,25 °C/min) och håll den vid 250 °C i 30 minuter med hjälp av en mikrovågsreaktor.
- Överför de resulterande nanopartiklarna upphängda i bensylalkohol till en glasflaska och separera nanopartiklarna med en neodymmagnet i 30 minuter.
- Tvätta fällningen i den tidigare 100 ml glasflaskan med 10 ml diklormetan, 1 M natriumhydroxid, etanol, pH 7 vatten (tre gånger) med en neodymmagnet i 5 minuter varje steg för att pelletisera nanopartiklar och ta bort supernatanten.
- Justera nanopartikelupphängningen i vatten till pH 2 med 1 M saltsyra och centrifug i 100 kDa ultracentrifugalfilter vid 2 200 x g i 10 min.
- Ta bort filtratet, tillsätt 12 ml 10-2 M saltsyra till nanopartiklarnas lösning och centrifugera i 100 kDa ultracentrifugalfilter vid 2 200 x g i 10 min (tre gånger). Späd sedan nanopartiklarlösningen inom 10 ml10-2 M saltsyra före beläggning.
- Beläggning
- Späd 175 mg citronsyra och polyakrylsyra i vatten vid pH 2 i en 100 ml glasflaska och justera pH till 2 med en 1 M saltsyralösning.
- Tillsätt 10 ml nanopartiklar vattendispersion till beläggningsmolekyllösningen, motsvarande ett massförhållande på 5 mellan beläggningsmolekylen och nanopartiklarna. Agitera i 2 timmar under magnetisk omrörning vid rumstemperatur.
- Efter reaktionen justerar du pH till 7 med 1 M natriumhydroxid.
- Centrifugera nanopartikellösningen 3 gånger med avjoniserat (DI) vatten i 100 kDa ultracentrifugalfilter vid 2 200 x g i 10 min; ta bort filtratet och späd nanopartiklarna i 12 ml DI-vatten.
2. Odling och magnetisk märkning av stamceller
- Kultur mänskliga mesenchymala stamceller (MSC) i komplett Mesenchymal stamcell tillväxt medium (MSCGM) vid 37 °C och 5% CO2. När cellerna är vid 90% sammanflöde, tillsätt 10 ml trypsin-EDTA förvärmd vid 37 °C per 150 cm² kolv och lämna i 2-3 minuter för att lossa cellerna.
- För att veta när cellerna är avskilda, observera dem med ett ljust fältmikroskop. Återanvänd de fristående cellerna i MSCGM och dela dem i fyra 150 cm² stora flaskor. Förstärk cellerna på detta sätt tills passage 4 till 5.
- Förbered lösningen av magnetiska nanopartiklar för cellmärkning: sprid den valda koncentrationen av järnoxidnanopartiklar i serumfria Roswell Park Memorial Institute medium (RMPI-1640) utan glutamin. RPMI används för nanopartikelinkubation (och tillhörande sköljsteg) eftersom det har en lägre jonisk styrka än DMEM och bättre förhindrar nanopartikelaggregeringshändelser.
- När cellerna är i passage 4 eller 5 och 90% sammanflöde, ta bort MSCGM-mediet, skölj cellerna med serumfri RPMI (utan glutamin) och tillsätt 10 ml järnoxidnanopartiklar per 150 cm2 odlingskolv, vilket är den minsta volym som krävs för att täcka alla celler.
- Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i 30 min och kassera sedan nanopartiklarlösningen. Tvätta en gång med serumfri RPMI-1640 (ingen glutamin) och inkubera med Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin (25 ml per 150 cm2 kolv) över natten vid 37 °C och 5% CO2 för att möjliggöra en fullständig internalisering av nanopartiklarna.
3. Bildning av stamcellssfäroider
- Nybered cell-sfäroid kultur medium bestående av DMEM hög glukos med L-glutamin kompletterat med 50 μM L-askorbinsyra 2-fosfat, 0,1 μM dexametason, 1 mM natrium pyruvat, 0,35 mM L-proline och 1% universellt odlingstillskott som innehåller insulin, humant transferrin och selensyra (ITS-Premix).
- Lossa de magnetiska msc:erna genom att tillsätta 10 ml 0,05 % trypsin-EDTA förvärmt vid 37 °C per 150 cm2 kolv i 2-3 minuter. När cellerna lossnar, inaktivera omedelbart trypsin genom att tillsätta 1/3 av volymen DMEM kompletterad med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin förevärmd vid 37 °C.
- Centrifugera de dissocierade cellerna vid 260 x g i 5 min, aspirera på mediet och suspendera cellerna i en liten volym (mindre än 1 ml per 150 cm² kolv) av cellsfäroidkulturmedium som att ha 200 000 celler i ca 50 μL medium. Räkna cellnumret med hjälp av en hemocytometer och justera volymen om det behövs.
- Tillsätt 1 ml nylagat cellsfäroidt odlingsmedium i ett 15 ml sterilt koniskt centrifugeringsrör och tillsätt volymen återanvändd lösning motsvarande 200 000 celler.
- Centrifugera dessa magnetiskt märkta celler vid 180 x g i 3 minuter, t.ex.
- Öppna rören något för att möjliggöra luftutbyte och inkubera vid 37 °C med 5% CO2 i upp till 21 dagar, odlingstid längs vilken cellerna bildar en sammanhängande 3D-struktur som resulterar i en fullt formad sfäroid. Byt medium två gånger i veckan.
- Tvätta sfäroiderna två gånger med kakodylatbuffert av 0,2 M kakodylat utspädd i avmineraliserat vatten och fixera dem med 2% glutaraldehyd i 0,1 M kakodylatbuffert utspädd i destillerat vatten i 30 min vid rumstemperatur. Förvara de fasta sfäroiderna i PBS tills de används för VSM-mätning eller TEM-avbildning. Detta fixeringssteg stoppar alla biologiska processer och möjliggör långsiktigt bevarande.
4. Kvantifiering av magnetiska nanopartiklar i lösning och cellulo med hjälp av en vibrerande provmagnetometer (VSM)
- Placera antingen en given volym magnetisk nanopartiklarlösning (högst 10 μL) eller en enda cellsfäroid i provhållaren som är särskilt utformad för att passa in i VSM.
- Sätt in provet i VSM och sök efter provförskjutning. Placera provet på den plats som motsvarar magnetiseringsgränsen.
- Utför den första mätningen med ett lågt magnetfält (mellan -1500 Oe och +1500 Oe) med en hastighet på 20 Oe/s.
- Utför en andra mätning vid ett högt magnetfält (mellan -30 000 Oe och +30 000 Oe) med en hastighet på 200 Oe/s.
5. Analys av transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- För nanopartikellösningarna, deponera 10 μL av vattenlösningen på ett kolbelagt kopparnät och låt den torka vid rumstemperatur.
- För de nanopartiklar som internaliserats i celler, kontrastera de fasta cell-sfäroiderna med Oolong Tea Extract (OTE) vid 0,5% utspädd i 0,1 M kakodylatbuffert, efter fix med 1% osmium tetroxid som innehåller 1,5% kaliumcyanoferrat och sedan dehydrera i graderade etanolbad, ingår i Epon. Skiva ultrasections på 70 nm och deponera dem på Cooper Grids.
- Ta bilder med ett elektronmikroskop vid 80 kV med en förstoring från 1k för observation av hela celler till 40k för observation av endosomal fack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av den mikrovågsassisterade syntesen produceras och beläggas magnetiska nanopartiklar med en monodisperse 8,8 ± 2,5 nm kärnstorlek med antingen citrat eller PAA (figur 1A). Stamceller inkuberas sedan med dessa nanopartiklar spridda i odlingsmedium vid en given koncentration i 30 minuter, vilket resulterar i deras endocytos och inneslutning i cellulära endosomer (figur 1B). De magnetiska stamcellerna suspenderas sedan i medium, centrifugeras och cellpelleten som bildas odlas i upp till 21 dagar (figur 1C). De erhållna sfäroiderna är fasta, såsom att stoppa biologiska processer, och hålls i PBS tills de mäts via VSM.
För det första mäts nanopartikellösningens magnetiska ögonblick med VSM: 10 μL av nanopartikeln vattendispersion som innehåller 7 μg järn mäts och den erhållna kurvan visas i figur 2A. På grund av närvaron av vatten i denna lösning, och till provhållaren, fångas en diamagnetisk signal utöver nanopartiklarnas superparamagnetiska signal. En diamagnetisk konstant (Mdia)som motsvarar lutningen på den andra delen av kurvan kan mätas, som visas i figur 2A, och denna konstant kan subtraheras,t.ex. Mättnadsmagnetiseringen av nanopartiklarna(M)kan sedan extraheras; Det motsvarar 518 μemu för vattendispersionen, vilket innebär att lösningen ligger på 74 emu/g järn (Fe) motsvarande 52 emu/g nanopartiklar (Fe3O4).
Det magnetiska ögonblicket av cellsfäroider kan på samma sätt erhållas. I detta fall sätts en cellsfäroid (tillverkad av 200 000 celler) in i provhållaren, placeras i VSM och mäts (figur 2B). De magnetiska ögonblicksvärden som erhålls är här mycket lägre än de som erhålls i den ursprungliga nanopartiklarlösningen. De ligger dock inom detekteringsområdet. Mättnadsmagnetiseringen av just detta prov är 69 μemu. Dessutom innehåller denna sfäroid 1,3 μg nanopartiklar (6,7 pg nanopartiklar per cell), i överensstämmelse med mättnadsvärdet vid 52 emu/gFe3O4. Detta värde kan således användas för att bestämma mängden nanopartiklar i cellulära prover. I figur 2Cmäts sfäroider som motsvarar celler märkta med tre koncentrationer av citratbelagda nanopartiklar en dag efter märkningen. Resultaten visar tydligt att nanopartiklarnas upptag beror på inkubationskoncentrationen, med koncentrationer på 0,125, 0, 25 och 0,5 mM som leder till upptag på 0,3, 0, 7 respektive 1,3 μg järn per sfäroid, vilket innebär 1,3, 3,3 respektive 6,7 pg järncell per cell.
Uppmärksamhet har väckts om vikten av ytbeläggningen, som direkt interagerar med den biologiska miljön20. Två beläggningar har här producerats: en citratbeläggning, som vanligtvis används för biomedicinska tillämpningar, och en PAA-beläggning, med ett högre antal kelatfunktioner. Stamceller är märkta med dessa två typer av nanopartiklar och centrifugerade som att bilda en cellpellet som sedan blir en sammanhållen cellsfäroid (figur 3A). Magnetismen hos dessa cellsfäroider mäts via VSM dag 1 och dag 21 (figur 3B och figur 3C). Resultaten visar en minskning av magnetismen under kulturens 21 dagar, vilket tyder på biologisk nedbrytning av nanopartiklarna, och denna nedbrytning är viktigare för de citratbelagda nanopartiklarna (figur 3B) än de PAA-belagda (figur 3C). TEM-bilder bekräftar nedbrytningen av nanopartiklarna och visar utseendet på mindre (6 nm) ljusgrå prickar, typiska för ferritin lastad med järn. Vissa nanopartiklar som förblir intakta kan också observeras, särskilt med PAA-beläggningen.
Figur 1: Mikrovågsassisterad syntes av järnoxid (Fe3O4)nanopartiklar, deras internalisering i stamceller och cellernas efterföljande kultur som sfäroider. A)Schematisk för nanopartikelsyntesens olika steg. För det första syntetiseras kärnan via ett icke-vattenhaltigt solgelförfarande. Beläggningsmolekylen, antingen Citrat (Cit) eller polyakrylsyra (PAA), ympas sedan vid järnoxidkärnans yta. En representativ TEM-bild visar de syntetiserade nanopartiklarna med en citratbeläggning. B)Schematisk nanopartikelin internalisering inom stamcellen, som visar nanopartiklarna som är instängda i endosomerna vid internalisering. Representativa TEM-bilder visar också citrat och PAA belagda nanopartiklar inuti cellerna, instängda i endosomerna. C)Schematisk bildning av stamcellssfäroider. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Mätning av proverna magnetiskt ögonblick via VSM. A)10 μL nanopartiklar spridda i en vattenlösning mäts via VSM. Den erhållna signalen representerar det magnetiska ögonblicket för denna nanopartikellösning i funktion av magnetfältet (B). Diamagnetismen som kommer från närvaron av vatten och provhållaren kan sedan mätas eftersom den motsvarar lutningen på den andra delen av kurvan och subtraheras, t.ex. Det magnetiska ögonblicket vid mättnad(M)kan sedan bestämmas. B)Cellsfäroidens magnetiska ögonblick kan på samma sätt erhållas. I detta fall mäts en enda cell-sfäroid vid en viss tidsperiod. (C) Kurvor av sfäroider som motsvarar celler märkta med citratbelagda nanopartiklar vid tre oberoende koncentrationer på 0,125 mM (orange), 0,25 mM (grå) och 0,5 mM (blå). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Kvantifiering av magnetisk nanopartikelnedbrytning i cellulo via VSM. A)Vid cellmärkning med magnetiska nanopartiklar bildas en cellpellet genom centrifugering (dag 0). Cellerna bildar sedan en sammanhängande struktur som resulterar i en lätthanterlig cellsfäroid som kan hållas i kultur utan cellförlust under längre tidsperioder (månader). B,C) Häri internaliseras två typer av magnetiska nanopartiklar, belagda medcitrat( B ) eller PAA (C), i stamceller och cellerna odlas som sfäroider i upp till 21 dagar. Magnetism av sfäroider odlade i 1 dag (orange kurvor) och 21 dagar (grå kurvor) mäts med VSM, med en minskning av magnetismen som indikerar en nedbrytning av nanopartiklarna. Representativa TEM-bilder tagna dag 21 visar ljusgrå prickar ca 6 nm är storlek inom endosomerna och cellernas cytoplasma, typisk storlek och form av ferritin, järnlagringsproteinet (svarta pilar). Vissa intakta nanopartiklar kan också observeras, främst för PAA-belagda nanopartiklar (brun pil). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av en snabb och effektiv mikrovågsbaserad syntes kan magnetiska nanopartiklar enkelt syntetiseras, med kontrollerad storlek och vidare beläggas med givna molekyler. Ett kritiskt steg är att lagra järnsaltet och bensylalkoholen under vakuum för att hålla en liten spridning i storlek. Bensylalkoholen fungerar både som lösningsmedel och ligand samtidigt så att den direkt kan erhålla kalibrerad kalibrerad kaliumoxid utan behov av ytterligare ligands. Efter nanopartiklar överföring i vatten kan de nakna magnetiska nanopartiklarna enkelt beläggas med ett stort antal ligands. Denna beläggning ger internanopartiklar och nanopartiklar-cell interagerande egenskaper som kan påverka deras cellulära internalisering, en parameter som måste kontrolleras noggrant som en minimal internalisering krävs för biomedicinska applikationer medan en för hög internalisering kan vara skadlig för cellerna och potentiellt härstammar cytotoxiska händelser31. Magnetometri är ett kraftfullt verktyg för att bedöma denna internalisering samt ödet för magnetiska nanopartiklar i cellulo. Vid införlivande av magnetiska nanopartiklar i stamceller kan sfäroider bildas via en enkel centrifugering följt av kultur i ett medium som stoppar cellernas spridning och driver extracellulär matrisproduktion. Cellerna blir mycket sammanhängande och börjar skapa en vävnad. Sfäroiderna är då mycket lätta att hantera och kan odlas under längre tidsperioder (månader) som möjliggör långsiktig spårning av magnetiska nanopartiklars öde i en biologisk miljö. Genom att stoppa celldelningen finns det ingen utspädning av nanopartiklarna från mor till dottercell. Dessutom har det verifierats att med denna cellsfäroidmodell finns det ingen järnflykt över en månad av kultur21,22,23. Som en följd av detta kan en minskning av magnetismvärdena endast motsvara en nedbrytning av nanopartiklarna och inte till järn som exporteras ut ur cellerna.
Magnetismen hos cellsfäroiderna mäts här via VSM som ger en snabb och exakt kvantifiering. Andra metoder har också utforskats för att mäta cellmagnetism, till exempel att använda en Supraledande gränssnittsenhet (SQUID), en maskin som vanligtvis är mer exakt än VSM med en känslighet runt10-7 emu jämfört med 10-6 emu för VSM, men driftskostnaden ärhögre 32. Känsligheten hos VSM som tillåter mätningar av magnetisk järndos underlägsen 2 pg/cell i den experimentella inställningen är häri tillräckligt exakt eftersom järndoser underlägsna 2 pg/cell skulle vara för låga för de riktade applikationerna, såsom cellattraktion mot en magnetisk för cellvägledning och vävnadsteknik. Både VSM- och SQUID-magnetometri, förutom att tillåta kvantifiering av cellmagnetism, kan ge ytterligare detaljer om nanopartiklarnas egenskaper. Genom analys av den erhållna signalen kan nanopartiklarnas storlek drasav 22,23 och även allmän uppfattning om deras magnetiska egenskaper kan erhållas, hysteres och tvång av nanomaterial kan till exempel avslöjas. Alternativa magnetometrimetoder finns också, såsom magnetofores som består i att mäta hastigheten hos enskilda celler när de lockas mot en magnet och magnetismen hos enstaka celler extrapoleras33,34. Magnetismen på encellsnivå kan på detta sätt erhållas; Inga ytterligare nanopartiklar kan dock fastställas. Dessutom har en liten magnetisk sensor som ger en signal som står i proportion till provmagnetismen nyligen använts med en liknande cellsfäroidmodell. Denna magnetiska sensor tillät spårning av magnetiska nanopartiklars biologiska nedbrytning i realtid, kontinuerligt, under 7 dagaroch 35. Signalen från denna magnetiska sensor kan dock inte direkt översättas till ett magnetiskt ögonblick eftersom den beror på nanopartiklarnas storlek. Av denna anledning måste en kalibreringskurva utföras för varje nanopartikeldesign, kurva som kan realiseras med VSM.
Mätningar som utförs häri med VSM visar en progressiv nedbrytning av de magnetiska nanopartiklarna i cellmiljön, vilket indikeras av en minskning av magnetismen. De bevisar också att samma kärna belagd med olika molekyler bryts ned i varierande takt beroende på beläggningen. När man jämför en PAA och en citratbeläggning leder PAA till högre kärnskydd till nedbrytning, troligen på grund av dess starka förankring till den magnetiskakärnan 20. Ödet för magnetiska nanopartiklar i den intracellulära miljön bedöms på cellsfäroider; Metoden är dock inte begränsad till den. Det kan i själva verket extrapoleras till cellupphängningar, som redan har använts för att bedöma effekten av stamcells differentiering på nanopartiklarnasöde 22. Det visade att, beroende på differentieringsvägen, de magnetiska nanopartiklarna bearbetas annorlunda av cellerna, med, i vissa fall, neo-kristallisering av järn vid upplösningen. VSM-magnetometri är därför ett användbart verktyg för att ytterligare utforska påverkan av både nanopartiklar och cellfunktioner på intracellulär bearbetning av järnoxidnanoobjekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Europeiska unionen (ERC-2014-CoG-projektet MaTissE #648779). Författarna vill erkänna CNanoMat fysikalisk-kemiska karakteriseringsplattformen för University Paris 13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), Deerfield Beach, Fla. 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al.
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles - The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
