Summary
Demir oksit nanopartiküller, zararsız bir sol jel prosedürü ile sentezlenir ve anionik kısa moleküller veya polimer ile kaplanır. İnsan kök hücrelerinin içindeki manyetik nanopartiküllerin birleştirilmesi ve biyotransformasyonlarını izlemek için manyetometri kullanımı titreşimli bir örnek manyetometre (VSM) kullanılarak gösterilmiştir.
Abstract
Demir oksittan yapılmış manyetik nanopartiküller, genellikle hücrelerde içselleştirildikleri ve daha sonra içinde bırakıldıkları çok çeşitli biyomedikal uygulamalar için tuhaf bir ilgi sunar. Bir zorluk, hücre içi ortamdaki kaderlerini güvenilir ve kesin metodolojilerle değerlendirmektir. Burada, manyetik momentlerini ölçerek hücreler içindeki manyetik nanopartiküllerin bütünlüğünü hassas bir şekilde ölçmek için titreşimli numune manyetometresinin (VSM) kullanımını tanıtıyoruz. Kök hücreler ilk olarak iki tür manyetik nanopartikül ile etiketlenir; nanopartiküller hızlı ve verimli bir mikrodalga bazlı nonaqueous sol jel sentezi ile üretilen aynı çekirdeğe sahiptir ve kaplamalarında farklılık gösterir: yaygın olarak kullanılan sitrik asit molekülü poliakrilik asit ile karşılaştırılır. Daha sonra santrifüjleme ile 3D hücre-sferoidlerin oluşumu sağlanır ve bu sferoidlerin manyetik momenti VSM ile farklı zamanlarda ölçülür. Elde edilen an, nanopartiküllerin bütünlüğünün doğrudan bir parmak izidir ve azalan değerler nanopartikül bozulmasının göstergesidir. Her iki nanopartikül için de manyetik moment kültür zamanla azalır ve biyobozunurluklarını ortaya çıkarır. Sitrik aside kıyasla poliakrilik asit kaplamasının koruyucu bir etkisi de gösterilmiştir.
Introduction
Çok çeşitli biyomedikal uygulamalar için demir oksit nanopartiküllerin manyetik özelliklerine ilgi artmaktadır. Manyetik rezonansa verdikleri yanıt, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) için güvenilir kontrast ajanları yapar, manyetik nanopartiküllerle etiketlenmiş hücrelerin implantasyondan sonra in vivo olarak izlenebildiği rejeneratif tıpta biravantajdır 1. Manyetik alanlar kullanılarak, hücreler uzaktan da yönlendirilebilir; bu şekilde, hücresel sferoidler2,3, halkalar4veyalevhalar 5 manyetik olarak mühendislik yapılabilir ve ayrıca uzaktan uyarılabilir6, iskelesiz dokuların geliştirilmesinde bir varlık. Bu nanopartiküller için olasılıklar yelpazesi ayrıca ilaç dağıtım sistemleri7,8 ve kanserli hücreleri öldürmek için manyetik ve fotoindüklenmiş hipertermal tedaviyi içerir9,10,11. Tüm bu uygulamalar için nanopartiküller ya intravenöz enjeksiyonla ya da hücrelerde doğrudan içselleştirme yoluyla biyolojik ortama entegre edilir ve daha sonra hücre içi kaderlerini sorgulayan içinde bırakılır.
In vivo analizler nanopartiküllerin organizmadaki kaderi hakkında genel bir anlayış aktardı: kan akışına enjekte edildikten sonra, ilk olarak karaciğerin makrofajları (Kupffer hücreleri), dalak ve kemik iliği tarafından yakalanır, giderek bozulur ve organizmanın demir havuzuna katılır12,13,14,15,16,17,18,19. Nitel gözlemler sadece nanopartiküllerin organizma boyunca dolaşımı nedeniyle mümkündür. Tipik olarak, iletim elektronik mikroskopisi (TEM) nanopartikülleri doğrudan gözlemlemek için kullanılabilir ve organlardaki demir varlığı dozaj yoluyla belirlenebilir. Daha yakın zamanlarda, kaderleri doğrudan bir hücre havuzu üzerinde değerlendirildi, yani demir kaçışı olmayan yakın devrede, hücre düzeyinde biyotransformasyonlarının nicel bir ölçümüne izin verdi20,21,22. Bu tür ölçümler, nanopartiküllerin yapısal bütünlüklerine sıkıca bağlı manyetik özelliklerinin analizi ile mümkündür. Titreşimli numune manyetometrisi (VSM), numunenin periyodik olarak titreştirildiği bir tekniktir, böylece akı indüklenen bobin ölçümü, numunenin uygulanan manyetik alandaki manyetik momentini sağlar. Bu tür senkron algılama, çok sayıda numunenin manyetik anlarını belirlemek için bir varlık olan hızlı bir ölçüme izin verir20,21,22,23. VSM tarafından alınan makroskopik manyetik imza daha sonra nanopartiküllerin boyutu ve yapısıyla doğrudan ilişkili tüm biyolojik numuneye nicel bir genel bakış sağlar. Özellikle, numunelerin doygunluğundaki manyetik anı (DAÜ'de ifade edilir) sağlar, bu da numunede bulunan manyetik nanopartikül sayısının doğrudan bir nicelemesidir, sırasıyla spesifik manyetik özelliklerine.
Manyetik nanopartiküllerin hücre içi işlenmesinin yapısal özelliklerine sıkıca bağlı olduğu gösterilmiştir20. Bu özellikler optimum sentez protokolleri ile kontrol edilebilir. Her protokol avantajlar ve sınırlamalar sunar. Demir oksit nanopartikülleri genellikle demir iyonlarının koprecipitasyonu yoluyla sulu çözeltilerde sentezlenir24. Nanopartikül boyutu polidisperitesinin sınırlamalarını aşmak için poliol aracılı sol jel yöntemleri gibi diğer sentez yöntemleri geliştirilmiştir25. Termal ayrışma ile gereksiz yaklaşımlar çok iyi kalibre edilmiş demir oksit nanopartiküllerinin üretimine yol açar26. Bununla birlikte, oleylamin veya oleik asit gibi büyük miktarlarda yüzey aktif madde kullanımı, biyomedikal uygulamalar için işlevselleşmelerini ve su transferlerini zorlaştırmaz. Bu nedenle, bu tür manyetik nanopartikülleri yüksek kristalite, saflık ve tekrarlanabilirliğe yol açan zararsız bir sol jel rotası ile sentezleriz27. Bu protokol, sıcaklık değişimi28ile ayarlanabilen iyi kontrol edilen boyut nanopartikülleri üretir. Bununla birlikte, mikrodalga destekli sulu olmayan sol-jel rotası, elde edilen nanopartiküllerin yaklaşık 12 nm'lik bir üst boyut sınırına sahiptir. Bu prosedür oda sıcaklığında ferromanyetik parçacıklar kullanan uygulamalar için uyarlanmaz. Çekirdek sentezine ek olarak, dikkat edilmesi gereken bir diğer ana özellik kaplamadır. Nanopartikül yüzeyinde yatan kaplama, nanopartiküllerin hedeflenen içselleştirilmesine yardımcı olan bir ankraj molekülü görevi görür veya nanopartikülleri bozulmaya karşı koruyabilir. Benzil alkol aynı zamanda bir oksijen kaynağı ve bir ligand görevi gördüğünden, ek yüzey aktif madde veya ligandlara ihtiyaç duymadan çıplak nanopartiküller üretilir. Nanopartiküller daha sonra bir yüzey aktif madde değişim işlemi olmadan sentezden sonra kolayca yüzey fonksiyonelleştirilir.
Burada, aynı çekirdeğe sahip ve kaplamada farklılık gösteren iki tür nanopartikül değerlendirilir. Çekirdek, hızlı ve yüksek verimli mikrodalga tabanlı bir teknik kullanılarak sentezlenmiştir. Karşılaştırılan iki kaplama, biyomedikal uygulamalarda en çok kullanılanlardan biri olan sitrik asit29,30ve poliakrilik asitten (PAA), çok sayıda şelatlama fonksiyonuna sahip polimerik bir kaplamadan oluşur. VSM manyetometri ölçümleri daha sonra önce hücreler tarafından nanopartikül alımını ölçmek için, daha sonra kök hücrelerde içselleştirme üzerine nanopartikül yapısal bütünlüğünün doğrudan bir değerlendirmesi olarak kullanılır. Sonuçlar, inkübasyon konsantrasyonunun nanopartikül alımını etkilediğini ve kaplamanın bozulmalarını etkilediğini ve PAA'nın çok sayıda ankraj molekülünün çekirdeği bozulmaya karşı koruduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Manyetik nanopartiküllerin sentezi
- Çekirdek sentezi – mikrodalga destekli
- 400 mg demir (III) asetilosenat çözün (>99.9%) 10 mL benzil alkolde (BA, %99,8) 30 mL monowave cam şişe içinde.
- Süspansiyonun sıcaklığını 20 dakikada 25 ila 250 °C'ye çıkarın (11,25 °C/dk hızında) ve mikrodalga reaktörü kullanarak 30 dakika boyunca 250 °C'de saklayın.
- Benzil alkolde asılı kalan elde edilen nanopartikülleri bir cam şişeye aktarın ve nanopartikülleri 30 dakika boyunca bir neodimyum mıknatıs kullanarak ayırın.
- Nanopartikülleri peletlemek ve süpernatantı çıkarmak için her adımda 5 dakika boyunca bir neodimyum mıknatıs kullanarak önceki 100 mL cam şişedeki çökeltiyi 10 mL diklorometan, 1 M sodyum hidroksit, etanol, pH 7 su (üç kez) ile yıkayın.
- Sudaki nanopartikül süspansiyonu 1 M hidroklorik asit kullanarak pH 2'ye ayarlayın ve ardından 10 dakika boyunca 2.200 x g'da 100 kDa ultracentrifugal filtrelerde santrifüj yapın.
- Filtratı çıkarın, nanopartikül çözeltisine 12 mL10 -2 M hidroklorik asit ekleyin ve 100 kDa ultrasantrifüj filtrelerinde 10 dakika (üç kez) 2.200 x g'da santrifüj ekleyin. Daha sonra kaplamadan önce nanopartikül çözeltisini 10-2 M hidroklorik asit 10 mL içinde seyreltin.
- Kaplama
- 100 mL'lik bir cam şişede pH 2'de suda 175 mg sitrik asit ve poliakrilik asit seyreltin ve pH'ı 1 M hidroklorik asit çözeltisi ile 2'ye ayarlayın.
- Kaplama molekülü ile nanopartiküller arasında 5 kütle oranına karşılık gelen 10 mL nanopartikül sulu dispersiyonunu kaplama molekülü çözeltisine ekleyin. Oda sıcaklığında manyetik karıştırma altında 2 saat ajite edin.
- Reaksiyondan sonra, pH'ı 1 M sodyum hidroksit ile 7'ye ayarlayın.
- Nanopartikül çözeltisini 10 dakika boyunca 2.200 x g'da 100 kDa ultrasantrifüj filtrede deiyonize (DI) su ile 3 kez santrifüjleyin; filtrat çıkarın ve nanopartikül çözeltisini 12 mL DI suda seyreltin.
2. Kök hücrelerin kültürü ve manyetik etiketlemesi
- Kültür insan mezenkimal kök hücreler (MSC) tam Mezenkimal Kök Hücre Büyüme Ortamı (MSCGM) 37 °C ve% 5 CO2. Hücreler % 90 birleştiğinde, 150 cm² şişe başına 37 °C'de önceden ısıtılmış 10 mL tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak için 2-3 dakika bekletin.
- Hücrelerin ne zaman ayrıldığını bilmek için, onları parlak alan mikroskobu ile gözlemleyin. Müstakil hücreleri MSCGM'de yeniden biriktirin ve dört adet 150 cm² şişeye bölün. 4'e 5 geçişe kadar hücreleri bu şekilde güçlendirin.
- Hücre etiketlemesi için manyetik nanopartiküllerin çözeltisini hazırlayın: seçilen demir oksit nanopartikül konsantrasyonlarını glutamin olmadan serumsuz Roswell Park Memorial Institute ortamında (RMPI-1640) dağıtın. RPMI, DMEM'den daha düşük bir iyonik mukavemete sahip olduğu ve nanopartikül toplama olaylarını daha iyi önlediği için nanopartikül inkübasyonu (ve ilgili durulama adımları) için kullanılır.
- Hücreler pasajdayken 4 veya 5 ve% 90 birleştiğinde, MSCGM ortamını çıkarın, hücreleri serumsuz RPMI (glutamin olmadan) ile durulayın ve tüm hücreleri kaplamak için gereken minimum hacim olan 150 cm2 kültür şişesi başına 10 mL demir oksit nanopartikül çözeltisi ekleyin.
- 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından nanopartikül çözeltisini atın. Serumsuz RPMI-1640 (glutamin yok) ile bir kez yıkayın ve Dulbecco'nun %10 FBS ve %1 penisil ile desteklenmiş Modifiye Kartal Orta (DMEM) ile kuluçkaya yatırın nanopartiküllerin tam bir içselleştirilmesine izin vermek için 37 °C ve% 5 CO2'de gece boyunca 150 cm 2 şişe başına 25 mL) streptomisinin(25 mL).
3. Kök hücre-sferoid oluşumu
- 50 μM L-askorbik asit 2-fosfat ile desteklenmiş L-glutamin ile DMEM yüksek glikozdan oluşan hücre-sferoid kültür ortamını taze hazırlayın, 0.1 μM deksametazon, 1 mM sodyum piruvat, 0.35 mM L-prolin ve% 1 insülin, insan Transferrin ve Selenöz asit (ITS-Premiks) içeren evrensel kültür takviyesi.
- Manyetik MSC'leri 2-3 dakika boyunca 150 cm2 şişe başına 37 °C'de önceden ısıtılmış %0,05 tripsin-EDTA'nın 10 mL'sini ekleyerek ayırın. Hücreler ayrıldığında, 37 °C'de önceden ısıtılmış %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM hacminin 1/3'ünü ekleyerek tripsin'i hemen devre dışı bırakın.
- Ayrışmış hücreleri 5 dakika boyunca 260 x g'da santrifüj edin, ortamı epire edin ve hücreleri yaklaşık 50 μL orta alanda 200.000 hücreye sahip olmak gibi hücre-küresel kültür ortamının küçük bir hacminde (150 cm² şişe başına 1 mL'den az) yeniden askıya alın. Hemositometre kullanarak hücre numarasını sayın ve gerekirse ses seviyesini ayarlayın.
- 15 mL steril konik santrifüj tüpüne 1 mL taze hazırlanmış hücre-küresel kültür ortamı ekleyin ve 200.000 hücreye karşılık gelen yeniden sulendirilmiş çözelti hacmini ekleyin.
- Manyetik olarak etiketlenmiş bu hücreleri tüpün dibinde bir hücre peletı oluşturmak gibi 3 dakika boyunca 180 x g'da santrifüj edin ve hücre kültürü ortamı olan süpernatantı saklayın.
- Tüpleri hafifçe açarak hava değişimine izin verin ve 21 güne kadar% 5 CO2 ile 37 ° C'de kuluçkaya yatırın, hücrelerin tam olarak oluşan bir küreselle sonuçlanan uyumlu bir 3D yapı oluşturduğu kültür zamanı. Ortamı haftada iki kez değiştirin.
- Belirli günlerde, sferoidleri demineralize suda seyreltilmiş 0.2 M kakadodylattan yapılmış cacodylate tamponu ile iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca damıtılmış suda seyreltilmiş 0.1 M kakadodylat tamponunda% 2 glutaraldehit kullanarak sabitlayın. VSM ölçümü veya TEM görüntüleme için kullanılana kadar sabit küreselleri PBS'de saklayın. Bu sabitleme adımı tüm biyolojik süreçleri durdurur ve uzun süreli koruma sağlar.
4. Manyetik nanopartiküllerin çözeltide ve selülozda titreşimli bir numune manyetometresi (VSM) kullanılarak nicelleştirilmesi
- Belirli bir manyetik nanopartikül çözeltisi hacmini (maksimum 10 μL) veya tek bir hücre-sferoidi, VSM'ye uyacak şekilde özel olarak tasarlanmış numune tutucusuna yerleştirin.
- Örneği VSM'ye ekleyin ve örnek uzaklığını tarayın. Numuneyi mıknatıslama maksimumuna karşılık gelen konuma yerleştirin.
- İlk ölçümü 20 Oe/s hıza sahip düşük manyetik alanda (-1500 Oe ile +1500 Oe arasında) gerçekleştirin.
- 200 Oe/s hıza sahip yüksek manyetik alanda (-30.000 Oe ile +30.000 Oe arasında) ikinci bir ölçüm gerçekleştirin.
5. İletim Elektron Mikroskopisi (TEM) analizi
- Nanopartikül çözeltileri için, sulu çözeltinin 10 μL'yi karbon kaplı bir bakır ızgaraya yatırın ve oda sıcaklığında kurumasına izin verin.
- Hücrelerde içselleştirilen nanopartiküller için, sabit hücre-sferoidleri Oolong Çay Özü (OTE) ile 0.1 M kakadot tamponunda seyreltilmiş% 0.5 ile kontrast, % 1 osmiyum tetroksit ile post fix% 1.5 potasyum siyanoferrat içeren ve daha sonra Epon dahil dereceli etanol banyolarında susuz. 70 nm'lik ultraseksiyonları dilimleyin ve cooper ızgaralarına biriktirin.
- Endosomal bölmelerin gözlemlenmesi için tüm hücrelerin gözlemlenmesi için 1k'dan 40k'ya kadar büyütme ile 80 kV'da bir elektron mikroskobu kullanarak görüntüler alın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrodalga destekli sentez kullanılarak, monodisperz 8,8 ± 2,5 nm çekirdek boyutuna sahip manyetik nanopartiküller üretilir ve sitrat veya PAA ile kaplanır (Şekil 1A). Kök hücreler daha sonra kültür ortamında 30 dakika boyunca belirli bir konsantrasyonda dağılan bu nanopartiküllerle inkübe edilir ve bu da endositozları ve hücresel endozomlar içinde hapsedilmesiyle sonuçlanır (Şekil 1B). Manyetik kök hücreler daha sonra orta, santrifüjlü olarak askıya alınır ve oluşan hücre peletı 21 güne kadar kültürlenir (Şekil 1C). Elde edilen küreseller, biyolojik süreçlerin durdurulması gibi sabitlenir ve VSM ile ölçülene kadar PBS'de tutulur.
İlk olarak, nanopartikül çözeltisinin manyetik momenti VSM kullanılarak ölçülür: 7 μg demir içeren nanopartikül sulu dağılımının 10 μL'si ölçülür ve elde edilen eğri Şekil 2A'dagörüntülenir. Bu çözeltideki su varlığı ve numune tutucuya bağlı olarak, nanopartiküllerin süperparmagnetik sinyaline ek olarak bir diamanyetik sinyal yakalanır. Şekil 2A'dagösterildiği gibi, eğrinin ikinci bölümünün eğimine karşılık gelen bir diamanyetik sabit (Mdia)ölçülebilir ve bu sabit sadece nanopartiküllerin manyetik momentini elde etmek gibi çıkarılabilir (Mörneği = M - Mdia). Nanopartiküllerin (Ms)doygunluk mıknatıslanması daha sonra çıkarılabilir; sulu dağılım için 518 μemu'ya karşılık gelir, yani çözelti 52 emu / g nanopartiküllere (Fe3O4)karşılık gelen 74 emu / g demir (Fe) seviyesindedir.
Hücre sferoidlerinin manyetik momenti de benzer şekilde elde edilebilir. Bu durumda, örnek tutucuya bir hücre-sferoid (200.000 hücreden yapılmış) yerleştirilir, VSM'ye yerleştirilir ve ölçülür (Şekil 2B). Elde edilen manyetik moment değerleri burada ilk nanopartikül çözeltisinden çok daha düşüktür; ancak, algılama aralığında kalırlar. Bu özel numunenin doygunluk mıknatıslanması 69 μemu'dur. Ayrıca, bu küresel 1.3 μg nanopartiküller içerir (hücre başına nanopartiküllerin 6.7 pg), 52 emu / gFe3O4doygunluk değeri ile tutarlı. Bu değer böylece hücresel örneklerdeki nanopartikül miktarını belirlemek için kullanılabilir. Şekil 2C'de,üç konsantrasyonda sitrat kaplı nanopartiküllerle etiketlenmiş hücrelere karşılık gelen küreseloidler etiketlemeden bir gün sonra ölçülür. Sonuçlar açıkça nanopartiküllerin alımının inkübasyon konsantrasyonuna bağlı olduğunu göstermektedir, 0.125, 0.25 ve 0.5 mM konsantrasyonları ile sferoid başına 0.3, 0.7 ve 1.3 μg demir alımına yol açan, hücre başına sırasıyla 1.3, 3,3 ve 6.7 pg demir.
Biyolojik çevre ile doğrudan etkileşime giren yüzey kaplamasının önemine dikkat edilmiştir20. Burada iki kaplama üretildi: biyomedikal uygulamalar için yaygın olarak kullanılan bir sitrat kaplama ve daha fazla şelasyon fonksiyonuna sahip bir PAA kaplama. Kök hücreler bu iki tür nanopartikül ile etiketlenir ve daha sonra yapışkan bir hücre-küresel haline gelen bir hücre peleti oluşturmak gibi santrifüjlenir (Şekil 3A). Bu hücre-sferoidlerin manyetizması VSM ile 1. Sonuçlar, nanopartiküllerin biyobozunurluğunu gösteren 21 günlük kültürde manyetizmada bir azalma olduğunu göstermektedir, bu bozulma sitrat kaplı nanopartiküller için (Şekil 3B) PAA kaplı olanlardan daha önemlidir (Şekil 3C). TEM görüntüleri nanopartiküllerin bozulmasını doğrular ve demir yüklü ferritin tipik olarak daha küçük (6 nm boyutunda) açık gri noktaların görünümünü gösterir. Özellikle PAA kaplama ile bozulmadan kalan bazı nanopartiküller de gözlenebilir.
Şekil 1: Demir oksit (Fe3O4)nanopartiküllerinin mikrodalga destekli sentezi, kök hücrelerde içselleşmeleri ve daha sonra hücrelerin küresel olarak kültürü. (A) Nanopartikül sentezinin çeşitli adımlarının şeması. İlk olarak, çekirdek sulu olmayan bir sol jel prosedürü ile sentez edilir. Kaplama molekülü, Sitrat (Cit) veya poliakrilik asit (PAA), daha sonra demir oksit çekirdeğinin yüzeyine aşılanır. Temsili bir TEM görüntüsü, sentezlenmiş nanopartikülleri sitrat kaplama ile gösterir. (B) Kök hücre içindeki nanopartikül içselleştirme şeması, içselleştirme üzerine endozomlarda sınırlı nanopartikülleri gösterir. Temsili TEM görüntüleri, hücrelerin içindeki sitrat ve PAA kaplı nanopartikülleri de endozomlara hapsedilmiş olarak göstermektedir. (C) Kök hücre-sferoid oluşumunun şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Vsm üzerinden numunelerin manyetik momentinin ölçümü. (A) Sulu bir çözeltide dağılmış 10 μL nanopartikül VSM üzerinden ölçülür. Elde edilen sinyal, bu nanopartikül çözeltisinin manyetik alan (B) işlevindeki manyetik anını temsil eder. Daha sonra suyun ve numune tutucunun varlığından gelen diamanyetizma, eğrinin ikinci kısmının eğimine karşılık geldiği ve sadece nanopartiküllerin manyetik momentini elde etmek gibi çıkarılabildiği için ölçülebilir. Doygunluk (Ms)manyetik moment daha sonra belirlenebilir. (B) Hücre sferoidlerinin manyetik momenti benzer şekilde elde edilebilir; Bu durumda belirli bir zaman diliminde tek bir hücre-sferoid ölçülür. (C) 0.125 mM (turuncu), 0.25 mM (gri) ve 0.5 mM (mavi) olmak üzere üç bağımsız konsantrasyonda sitrat kaplı nanopartiküllerle etiketlenmiş hücrelere karşılık gelen sferoid eğrileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: VSM ile selülodaki manyetik nanopartikül bozulmasının nicelleştirilmesi. (A) Manyetik nanopartiküllerle hücre etiketlemesi üzerine, santrifüjleme ile bir hücre peleti oluşur (gün 0). Hücreler daha sonra yapışkan bir yapı oluşturur ve bu da uzun süre (ay) hücre kaybı olmadan kültürde tutulabilen kullanımı kolay bir hücre-sferoid ile sonuçlanır. (B, C) Burada, sitrat (B) veya PAA (C) ile kaplanmış iki tür manyetik nanopartikül kök hücrelerde içselleştirilir ve hücreler 21 güne kadar küresel olarak kültürlenir. 1 gün (turuncu eğriler) ve 21 gün (gri eğriler) için kültüre edilen küresellerin manyetizması VSM ile ölçülür ve manyetizmadaki azalma nanopartiküllerin bozulmasına işaret eder. 21. günde çekilen temsili TEM görüntüleri, endozomlar ve hücrelerin sitoplazma içindeki yaklaşık 6 nm'lik açık gri noktaları, ferritin tipik boyutunu ve şeklini, demir depolama proteinini (siyah oklar) göstermektedir. Bazı bozulmamış nanopartiküller de gözlemlenebilir, çoğunlukla PAA kaplı nanopartiküller (kahverengi ok). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hızlı ve verimli bir mikrodalga bazlı sentez kullanılarak, manyetik nanopartiküller kolayca sentezlenebilir, kontrollü boyutta ve verilen moleküllerle daha fazla kaplanabilir. Kritik bir adım, küçük bir dağılım sağlamak için demir tuzunu ve benzil alkolü vakum altında stoklamaktır. Benzil alkol hem çözücü hem de ligand olarak hareket eder ve ek ligandlara ihtiyaç duymadan doğrudan kalibre edilmiş çıplak demir oksit elde etmeyi sağlar. Nanopartiküller suya transfer edildikten sonra çıplak manyetik nanopartiküller çok çeşitli ligandlarla kolayca kaplanabilir. Bu kaplama, hücresel içselleştirmelerini etkileyebilecek nanopartikül ve nanopartikül hücre etkileşimi özelliklerini bir araya getirirken, biyomedikal uygulamalar için minimum içselleştirme gerektiğinden sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gereken bir parametre, çok yüksek bir içselleştirme hücrelere zarar verebilir ve potansiyel olarak sitotoksik olaylardan kaynaklanabilir31. Manyetometri, selülodaki manyetik nanopartiküllerin kaderinin yanı sıra bu içselleştirmeyi değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Manyetik nanopartiküllerin kök hücrelere dahil edilmesi üzerine, sferoidler basit bir santrifüjleme ile oluşturulabilir ve ardından hücrelerin çoğalmasını durduran ve hücre dışı matris üretimini yönlendiren bir ortamda kültür oluşabilir. Hücreler oldukça uyumlu hale gelir ve bir doku oluşturmaya başlar. Sferoidlerin kullanımı çok kolaydır ve manyetik nanopartiküllerin biyolojik bir ortamdaki kaderinin uzun süreli izlenmesini sağlayan uzun süreler (aylar) için kültürlenebilir. Hücre bölünmesini durdurarak, nanopartiküllerin anneden kız hücresine seyreltilmesi yoktur; dahası, bu hücre-küresel model ile, kültür21 , 22,23bir ay boyunca demir kaçış olmadığı doğrulanmıştır. Sonuç olarak, manyetizma değerlerindeki bir azalma sadece nanopartiküllerin bozulmasına ve hücrelerin dışına ihraç edilen demire karşılık gelmeyebilir.
Hücre sferoidlerinin manyetizması, hızlı ve hassas bir nicelik sağlayan VSM ile ölçülür. VsM için 10-6 emu'ya kıyasla 10-7 emu hassasiyete sahip vsm'den daha hassas bir makine olan Süperiletken Arayüz Cihazı (SQUID) kullanmak gibi hücresel manyetizmaları ölçmek için başka yöntemler de araştırıldı, ancak operasyonel maliyet32. Vsm'nin deneysel kurulumda 2 pg/hücreden daha düşük manyetik demir dozu ölçümlerine izin verme hassasiyeti, burada yeterince hassastır, çünkü 2 pg/ hücreden daha düşük demir dozları, hücre rehberliği ve doku mühendisliği amacıyla bir manyetik için hücre cazibesi gibi hedeflenen uygulamalar için çok düşüktür. Hem VSM hem de SQUID manyetometrisi, hücre manyetizmasının ölçülmesine izin vermenin yanı sıra, nanopartiküllerin özellikleri hakkında ek ayrıntılar verebilir. Elde edilen sinyalin analizi ile nanopartiküllerin büyüklüğü22,23 düşülebilir ve ayrıca manyetik özelliklerinin genel kavramı elde edilebilir, örneğin nanomalzemelerin histezi ve zorlaması ortaya çıkarılabilir. Bir mıknatısa doğru çekildiğinde tek tek hücrelerin hızının ölçülmesinde oluşan manyetoforiz gibi alternatif manyetometri yaklaşımları da mevcuttur ve tek hücrelerin manyetizması tahmin edilir33,34. Tek hücre düzeyinde manyetizma bu şekilde elde edilebilir; ancak ek nanopartikül özellikleri belirlenemez. Ek olarak, örnek manyetizma ile orantılı bir sinyal sağlayan küçük bir manyetik sensör son zamanlarda benzer bir hücre sferoid modeli ile kullanılmıştır. Bu manyetik sensör, manyetik nanopartiküllerin biyobozunurluğunun gerçek zamanlı olarak, sürekli olarak, 7 gün boyunca izlenmesini sağladı35. Bununla birlikte, bu manyetik sensörün sinyali, nanopartiküllerin boyutuna bağlı olduğu için doğrudan manyetik bir ana çevrilemez. Bu nedenle, vsm kullanılarak gerçekleştirilebilecek her nanopartikül tasarımı, eğrisi için bir kalibrasyon eğrisi yapılması gerekir.
Burada VSM ile yapılan ölçümler, hücresel ortamdaki manyetik nanopartiküllerin ilerleyici bir şekilde bozularak manyetizmada bir azalma olduğunu göstermektedir. Ayrıca, farklı moleküllerle kaplanmış aynı çekirdeğin kaplamaya bağlı olarak değişen oranlarda bozulmuş olduğunu kanıtlarlar. Bir PAA ve sitrat kaplama karşılaştırırken, PAA, büyük olasılıkla manyetik çekirdeğe güçlü tutturulması nedeniyle bozulmaya karşı daha yüksek çekirdek korumasına yol açar20. Hücre içi ortamda manyetik nanopartiküllerin kaderi hücre sferoidleri üzerinde değerlendirilir; ancak, yöntem bununla sınırlı değildir. Gerçekten de, kök hücre farklılaşmasının nanopartiküllerin kaderi üzerindeki etkisini değerlendirmek için zaten kullanılan hücre süspansiyonlarına tahmin edilebilir22. Farklılaşma yoluna bağlı olarak, manyetik nanopartiküllerin hücreler tarafından farklı şekilde işlendiğini ve bazı durumlarda demirin çözünmesi üzerine neo-kristalleşmesini ortaya koydu. VSM manyetometrisi, hem nanopartikül hem de hücre özelliklerinin demir oksit nano nesnelerin hücre içi işlenmesi üzerindeki etkisini daha fazla keşfetmek için yararlı bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Avrupa Birliği (ERC-2014-CoG projesi MaTissE #648779) tarafından desteklendi. Yazarlar, Paris 13 Üniversitesi'nin CNanoMat fiziko-kimyasal karakterizasyon platformunu kabul etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), Deerfield Beach, Fla. 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al.
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles - The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
