Summary
Jernoxid nanopartikler syntetiseres via en nonaqueous sol gel procedure og belagt med anioniske korte molekyler eller polymer. Brugen af magnetometri til overvågning af inkorporering og biotransformationer af magnetiske nanopartikler i menneskelige stamceller demonstreres ved hjælp af et vibrerende prøvemagnetometer (VSM).
Abstract
Magnetiske nanopartikler, lavet af jernoxid, udgør en ejendommelig interesse for en bred vifte af biomedicinske applikationer, som de ofte internaliseres i celler og derefter efterlades inden for. En udfordring er at vurdere deres skæbne i det intracellulære miljø med pålidelige og præcise metoder. Heri introducerer vi brugen af det vibrerende prøvemagnetometer (VSM) til præcist at kvantificere integriteten af magnetiske nanopartikler i celler ved at måle deres magnetiske øjeblik. Stamceller er først mærket med to typer magnetiske nanopartikler; nanopartiklerne har den samme kerne, der produceres via en hurtig og effektiv mikrobølgebaseret nonaqueous sol gelsyntese og adskiller sig i deres belægning: det almindeligt anvendte citronsyremolekyle sammenlignes med polyacrylsyre. Dannelsen af 3D-celle-sfæroider opnås derefter via centrifugering, og det magnetiske øjeblik af disse sfæroider måles på forskellige tidspunkter med VSM. Det opnåede øjeblik er et direkte fingeraftryk af nanopartiklernes integritet med faldende værdier, der indikerer en nanopartikelforringelse. For begge nanopartikler falder det magnetiske øjeblik over kulturtid og afslører deres bionedbrydning. En beskyttende virkning af polyacrylsyrebelægningen vises også sammenlignet med citronsyre.
Introduction
Der er øget interesse for de magnetiske træk ved jernoxid nanopartikler til en bred vifte af biomedicinske applikationer. Deres reaktion på magnetisk resonans gør dem pålidelige kontraststoffer til magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), en fordel i regenerativ medicin, hvor celler mærket med magnetiske nanopartikler kan spores in vivo efter implantation1. Ved hjælp af magnetiske felter kan celler også styres på afstand; på denne måde kan cellulære sfæroider2,3, ringe4eller ark5 konstrueres magnetisk og også fjernt stimuleret6, et aktiv i udviklingen af stilladsfri væv. Rækken af muligheder for disse nanopartikler omfatter også narkotikaleveringssystemer7,8 og magnetisk og fotoinduceret hypertermisk behandling for at dræbe kræftceller9,10,11. Til alle disse applikationer er nanopartiklerne integreret i det biologiske miljø enten ved intravenøs injektion eller via direkte internalisering i celler og efterlades derefter inden for, hvilket sætter spørgsmålstegn ved deres intracellulære skæbne.
In vivo-analyser formidlede en generel forståelse af nanopartiklernes skæbne i organismen: Ved injektion i blodbanen fanges de først mest af leverens makrofager (Kupffer-celler), milt og knoglemarv nedbrydes gradvist og slutter sig til organismens jernpulje12,13,14,15,16,17,18,19. Kvalitative observationer er kun mulige på grund af cirkulationen af nanopartiklerne i hele organismen. Typisk kan elektronisk transmissionsmikroskopi (TEM) bruges til direkte at observere nanopartiklerne, og tilstedeværelsen af jern i organerne kan bestemmes ved dosering. For nylig er deres skæbne blevet vurderet direkte på en pulje af celler, hvilket betyder i tæt kredsløb uden jernflugt, hvilket giver mulighed for en kvantitativ måling af deres biotransformationer på celleniveau20,21,22. Sådanne målinger er mulige gennem analyse af nanopartiklernes magnetiske egenskaber, der er tæt forbundet med deres strukturelle integritet. Vibrerende prøvemagnetometri (VSM) er en teknik, hvor prøven vibrerer med jævne mellemrum, således at spolemålingen af den inducerede flux giver prøvens magnetiske øjeblik ved det påførte magnetfelt. En sådan synkron detektion giver mulighed for en hurtig måling, som er et aktiv til bestemmelse af de magnetiske øjeblikke i et stort antal prøver20,21,22,23. Den makroskopiske magnetiske signatur, der hentes af VSM, giver derefter et kvantitativt overblik over hele den biologiske prøve, der er direkte korreleret med nanopartiklernes størrelse og struktur. Det giver især prøvernes magnetiske øjeblik ved mætning (udtrykt i emu), som er en direkte kvantificering af antallet af magnetiske nanopartikler, der er til stede i prøven, henholdsvis til deres specifikke magnetiske egenskaber.
Det har vist sig, at den intracellulære behandling af magnetiske nanopartikler er tæt forbundet med deres strukturelle egenskaber20. Disse funktioner kan styres via optimale synteseprotokoller. Hver protokol indeholder fordele og begrænsninger. Jernoxid nanopartikler er almindeligt syntetiseret i vandige opløsninger via coprecipitation af jernioner24. For at overvinde begrænsningerne af nanopartikler størrelse polydispersitet, andre syntese metoder såsom polyol-medieret sol-gel metoder er blevet udviklet25. Nonaqueous tilgange ved termisk nedbrydning fører til produktion af meget godt kalibreret jernoxid nanopartikler26. Brugen af massive mængder overfladeaktive stoffer som oleylamin eller oliesyre komplicerer imidlertid deres funktionalisering og vandoverførsel til biomedicinske anvendelser. Af denne grund syntetiserer vi sådanne magnetiske nanopartikler gennem en nonaqueous sol gel-rute, der fører til høj krystallinitet, renhed og reproducerbarhed27. Denne protokol producerer velkontrollerede nanopartikler i størrelse, der kan indstilles gennem temperaturvariation28. Ikke desto mindre har den mikrobølgestøttede ikke-vandige sol-gel-rute en øvre størrelsesgrænse for de opnåede nanopartikler på ca. 12 nm. Denne procedure vil ikke blive tilpasset til anvendelser, der anvender ferromagnetiske partikler ved stuetemperatur. Ud over kernesyntesen er et andet hovedtræk, der skal overvejes, belægningen. Belægningen ligger på overfladen af nanopartiklerne og fungerer som et forankringsmolekyle, der hjælper med målrettet internalisering af nanopartiklerne, eller den kan beskytte nanopartiklerne mod nedbrydning. Da benzylalkohol fungerer som iltkilde og en ligand på samme tid, produceres nøgne nanopartikler uden behov for yderligere overfladeaktive stoffer eller ligands. Nanopartiklerne er derefter let overfladefunktionaliseret efter syntese uden en overfladeaktiv udvekslingsproces.
Heri vurderes to typer nanopartikler, der besidder den samme kerne og adskiller sig i belægningen. Kernen syntetiseres ved hjælp af en hurtig og yderst effektiv mikrobølgebaseret teknik. De to sammenlignede belægninger består af citronsyre, en af de mest anvendte som overfladebehandlingsmiddel i biomedicinske applikationer29,30og polyacrylsyre (PAA), en polymer belægning med et stort antal chelaterende funktioner. VSM magnetometri målinger bruges derefter først til at kvantificere nanopartikel optagelse af cellerne, og derefter som en direkte vurdering af nanopartikel strukturelle integritet ved internalisering i stamceller. Resultaterne viser, at inkubationskoncentrationen påvirker optagelsen af nanopartikler, og at belægningen påvirker deres nedbrydning, idet det store antal forankringsmolekyler i PAA beskytter kernen mod nedbrydning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese af magnetiske nanopartikler
- Kernesyntese – mikrobølgeassisteret
- 400 mg acetylacetonat (>99,9%) opløses i 10 mL benzylalkohol (BA, 99,8%) inden for et 30 mL monobølgeglasglasglas.
- Affjedringens temperatur øges fra 25 til 250 °C på 20 min. (med en hastighed på 11,25 °C/min), og den opbevares ved 250 °C i 30 min. ved hjælp af en mikrobølgereaktor.
- Overfør de resulterende nanopartikler suspenderet i benzylalkohol til et glasglas og adskil nanopartiklerne ved hjælp af en neodymmagnet i 30 minutter.
- Bundfaldet vaskes i det foregående 100 ml glasglas med 10 ml dichlormethan, 1 M natriumhydroxid, ethanol, pH 7 vand (tre gange) ved hjælp af en neodymmagnet i 5 minutter hvert trin for at pelletisere nanopartikler og fjerne supernatanten.
- Nanopartikelaffjedringen justeres i vand til pH 2 ved hjælp af 1 M saltsyre, og centrifuger derefter i 100 kDa ultracentrifugalfiltre ved 2.200 x g i 10 min.
- Filtratet fjernes, der tilsættes 12 ml 10-2 M saltsyre til nanopartiklerne og centrifuge i 100 kDa ultracentrifugalfiltre ved 2.200 x g i 10 min (tre gange). Derefter fortyndes nanopartiklerne inden for 10 ml på 10-2 M saltsyre før belægning.
- Belægning
- 175 mg citronsyre og polyacrylsyre fortyndes i vand ved pH 2 i et glasglasglas på 100 mL og justeres til 2 med en 1 M saltsyreopløsning.
- Tilsæt de 10 ml nanopartikler vandig spredning til belægningsmolekyleopløsningen, svarende til et masseforhold på 5 mellem belægningsmolekylet og nanopartiklerne. Omrøres i 2 timer under magnetisk omrøring ved stuetemperatur.
- Efter reaktionen justeres pH til 7 med 1 M natriumhydroxid.
- Centrifuge nanopartikelopløsningen 3 gange med deioniseret (DI) vand i 100 kDa ultracentrifugalfiltre ved 2.200 x g i 10 min. filtratet fjernes, og nanopartiklerne fortyndes i 12 ml DI-vand.
2. Kultur og magnetisk mærkning af stamceller
- Kultur humane mesenchymale stamceller (MSC) i komplet Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSCGM) ved 37 °C og 5% CO2. Når cellerne er ved 90% sammenløb, tilsættes 10 mL trypsin-EDTA forvarmet ved 37 °C pr. 150 cm² kolbe og lad i 2-3 minutter løsne cellerne.
- At vide, hvornår cellerne er løsrevet, observere dem med et lysfelt mikroskop. Genbrug de løsrevne celler i MSCGM og del dem i fire 150 cm² kolber. Forstærk cellerne på denne måde indtil passage 4 til 5.
- Forbered opløsningen af magnetiske nanopartikler til cellemærkning: Spred den valgte koncentration af jernoxid nanopartikler i serumfri Roswell Park Memorial Institute medium (RMPI-1640) uden glutamin. RPMI bruges til nanopartikelinkubation (og de relaterede skylletrin), da det har en lavere ionisk styrke end DMEM og bedre forhindrer nanopartikelsammenlægningshændelser.
- Når cellerne er ved passage 4 eller 5 og 90% sammenflydende, skal du fjerne MSCGM-mediet, skylle cellerne med serumfri RPMI (uden glutamin) og tilføje 10 ml jernoxidnanopartikleropløsning pr. 150 cm2 dyrkningskolbe, hvilket er det mindste volumen, der kræves for at dække alle cellerne.
- Inkuber ved 37 °C og 5% CO2 i 30 min og kassér derefter nanopartikelopløsningen. Vask en gang med serumfri RPMI-1640 (ingen glutamin) og inkuber med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (25 ml pr. 150 cm2 kolbe) natten over ved 37 °C og 5% CO2 for at muliggøre en fuldstændig internalisering af nanopartiklerne.
3. Dannelse af stamcelle-sfæroider
- Friskforbered celle-sfæroid kultur medium bestående af DMEM høj glukose med L-glutamin suppleret med 50 μM L-ascorbinsyre 2-fosfat, 0,1 μM dexamethasone, 1 mM natrium pyruvat, 0,35 mM L-proline, og 1% universel kultur supplement indeholdende Insulin, human Transferrin og Selenous syre (ITS-Premix).
- De magnetiske MSC'er fjernes ved at tilsætte 10 mL på 0,05 % trypsin-EDTA forvarmet ved 37 °C pr. 150 cm2 kolbe i 2-3 minutter. Når cellerne løsnes, inaktiveres trypsinen straks ved at tilsætte 1/3 af volumenet af DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin forvarmet ved 37 °C.
- Centrifuge de dissociated celler på 260 x g i 5 min, indgyde medierne og igen suspendere cellerne i et lille volumen (mindre end 1 mL pr 150 cm² kolbe) af celle-sfæroid kultur medium såsom at have 200.000 celler i omkring 50 μL af medium. Tæl cellenummeret ved hjælp af et hæmocytometer, og juster lydstyrken, hvis det er nødvendigt.
- Der tilsættes 1 ml frisklavet celle-sfæroidkulturmedium i et 15 ml sterilt konisk centrifugerør, og der tilsættes et volumen af genbrugt opløsning svarende til 200.000 celler.
- Centrifuge disse magnetisk mærkede celler på 180 x g i 3 min såsom at danne en celle pellet i bunden af røret og holde supernatant, som er cellen kultur medium.
- Åbn rørene lidt for at tillade luftudskiftning og inkuber ved 37 °C med 5% CO2 i op til 21 dage, dyrkningstid, langs hvilken cellerne danner en sammenhængende 3D-struktur, der resulterer i en fuldt dannet sfæroid. Skift mediet to gange om ugen.
- På de givne dage vaskes spheroiderne to gange med cacodylatbuffer lavet af 0,2 M cacodylat fortyndet i demineraliseret vand og fastgør dem ved hjælp af 2% glutaraldehyd i 0,1 M cacodylatbuffer fortyndet i destilleret vand i 30 minutter ved stuetemperatur. Opbevar de faste sfæroider i PBS, indtil de bruges til VSM-måling eller TEM-billeddannelse. Dette fikseringstrin stopper alle biologiske processer og giver mulighed for langsigtet bevaring.
4. Kvantificering af magnetiske nanopartikler i opløsning og i cellulo ved hjælp af et vibrerende prøvemagnetometer (VSM)
- Der anbringes enten et givet volumen magnetisk nanopartikelopløsning (højst 10 μL) eller en enkelt celle-sfæroid i prøveholderen, der er specielt designet til at passe ind i VSM.
- Indsæt eksemplet i VSM,og søg efter eksempelforskydning. Prøven anbringes i den position, der svarer til magnetiseringsgrænsen.
- Udfør den første måling ved et lavt magnetfelt (mellem -1500 Oe og +1500 Oe) med en hastighed på 20 Oe/s.
- Udføre endnu en måling ved et højt magnetfelt (mellem -30 000 Oe og +30 000 Oe) med en hastighed på 200 Oe/s.
5. TEM-analyse (Transmission Electron Microscopy)
- For nanopartikelopløsningerne deponeres 10 μL af den vandige opløsning på et kulstofbelagt kobbergitter og lad det tørre ved stuetemperatur.
- For nanopartikler internaliseret i celler, kontrast de faste celle-sfæroider med Oolong Tea Extract (OTE) på 0,5% fortyndet i 0,1 M cacodylate buffer, post fix med 1% osmium tetroxid indeholder 1,5% kalium cyanoferrat og derefter dehydrere i gradueret ethanol bade, inkluderet i Epon. Skær ultrasections på 70 nm og deponere dem på cooper net.
- Tag billeder ved hjælp af et elektronmikroskop ved 80 kV med en forstørrelse fra 1k til observation af hele celler til 40 k til observation af endosomale rum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den mikrobølgestøttede syntese fremstilles og belægges magnetiske nanopartikler med monodisperse 8,8 ± 2,5 nm kernestørrelse med enten citrat eller PAA (Figur 1A). Stamceller inkuberes derefter med disse nanopartikler spredt i dyrkningsmedium ved en given koncentration i 30 minutter, hvilket resulterer i deres endokytose og indeslutning i de cellulære endosomer (Figur 1B). De magnetiske stamceller opslæmmes derefter i medium, centrifugeret, og den dannede cellepille dyrkes i op til 21 dage (Figur 1C). De opnåede sfæroider er faste, såsom standsning af biologiske processer, og opbevares i PBS, indtil de måles via VSM.
For det første måles nanopartikelopløsningens magnetiske øjeblik ved hjælp af VSM: 10 μL af den vandige spredning, der indeholder 7 μg jern, måles, og den opnåede kurve vises i figur 2A. På grund af tilstedeværelsen af vand i denne opløsning og til prøveholderen opfanges et diamagnetisk signal ud over nanopartiklernes superparamagnetiske signal. En diamagnetisk konstant (Mdia), der svarer til hældningen af anden del af kurven, kan måles som vist i figur 2A, og denne konstant kan trækkes fra, f.eks. M'ernesmætningsmagnetisering kan derefter udvindes; det svarer til 518 μemu for den vandige spredning, hvilket betyder, at opløsningen er ved 74 emu/g jern (Fe), svarende til 52 emu/g nanopartikler (Fe3O4).
Det magnetiske øjeblik af celle sfæroider kan ligeledes opnås. I dette tilfælde indsættes en celle-sfæroid (lavet af 200.000 celler) i prøveholderen, placeres i VSM og måles (Figur 2B). De opnåede magnetiske øjebliksværdier er her meget lavere end værdierne i den oprindelige nanopartikelopløsning; De forbliver dog inden for detektionsområdet. Mætningsmagnetiseringen af denne prøve er på 69 μemu. Desuden indeholder denne sfæroid 1,3 μg nanopartikler (6,7 pg nanopartikler pr. celle), i overensstemmelse med mætningsværdien ved 52 emu/gFe3O4. Denne værdi kan således bruges til at bestemme mængden af nanopartikler i cellulære prøver. I figur 2Cmåles sfæroider svarende til celler, der er mærket med tre koncentrationer af citratbelagte nanopartikler, dagen efter mærkningen. Resultaterne viser klart, at optagelsen af nanopartiklerne afhænger af inkubationskoncentrationen med koncentrationer på 0,125, 0,25 og 0,5 mM, hvilket fører til optagelse af henholdsvis 0,3, 0,7 og 1,3 μg jern pr. kugleformet, dvs.
Opmærksomheden er blevet bragt på betydningen af overfladebelægningen, som direkte interagerer med det biologiske miljø20. To belægninger er her blevet produceret: en citratbelægning, der almindeligvis anvendes til biomedicinske applikationer, og en PAA-belægning med et højere antal chelaterende funktioner. Stamceller er mærket med disse to typer af nanopartikler og centrifuged såsom at danne en celle pellet, der derefter bliver en sammenhængende celle-sfæroid (Figur 3A). Magnetisme af disse celle-sfæroider måles via VSM på dag 1 og dag 21(Figur 3B og Figur 3C). Resultaterne viser et fald i magnetismen på de 21 dages kultur, hvilket indikerer nanopartiklernes bionedbrydning, idet denne nedbrydning er vigtigere for de citratbelagte nanopartikler (figur 3B) end de PAA-coatede (Figur 3C). TEM-billeder bekræfter nedbrydningen af nanopartiklerne og viser udseendet af mindre (6 nm i størrelse) lysegrå prikker, typisk for ferritin fyldt med jern. Nogle nanopartikler forbliver intakte kan også observeres, især med PAA-belægningen.
Figur 1: Mikrobølgeassisteret syntese af jernoxid (Fe3O4)nanopartikler, deres internalisering i stamceller og den efterfølgende dyrkning af cellerne som sfæroider. (A)Skematisk over de forskellige trin i nanopartikelsyntesen. For det første syntetiseres kernen via en ikke-vandig solgelprocedure. Belægningsmolekylet, enten Citrate (Cit) eller polyacrylsyre (PAA), podes derefter på overfladen af jernoxidkernen. Et repræsentativt TEM-billede viser de syntetiserede nanopartikler med en citratbelægning. (B) Skematisk over den nanopartikel internalisering i stamceller, der viser nanopartiklerne indespærret i endosomerne ved internalisering. Repræsentative TEM billeder viser også citrat og PAA belagt nanopartikler inde i cellerne, begrænset i endosomes. (C)Skematisk over stamcelle-sfæroider dannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Måling af prøvernes magnetiske øjeblik via VSM. (A) 10 μL nanopartikler, der er spredt i en vandig opløsning, måles via VSM. Det opnåede signal repræsenterer det magnetiske øjeblik for denne nanopartikelopløsning i funktion af magnetfeltet (B). Den diamagnetisme, der kommer fra tilstedeværelsen af vand, og prøveholderen kan derefter måles, da den svarer til hældningen af den anden del af kurven og trækkes fra, f.eks. Det magnetiske øjeblik ved mætning (Ms)kan derefter bestemmes. (B) Cellespærroidernes magnetiske øjeblik kan ligeledes opnås; I dette tilfælde måles en enkelt celle-sfæroid på et givet tidsrum. (C) Kurver af sfæroider svarende til celler mærket med citratbelagte nanopartikler ved tre uafhængige koncentrationer på 0,125 mM (orange), 0,25 mM (grå) og 0,5 mM (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af magnetisk nanopartikelforringelse i cellulo via VSM. (A) Ved cellemærkning med magnetiske nanopartikler dannes en cellepellet ved centrifugering (dag 0). Cellerne danner derefter en sammenhængende struktur, der resulterer i en let at håndtere celle-sfæroid, der kan holdes i kultur uden celletab i længere tidsperioder (måneder). (B, C) Heri internaliseres to typer magnetiske nanopartikler, belagt med citrat (B) eller PAA (C), i stamceller, og cellerne dyrkes som sfæroider i op til 21 dage. Magnetisme af sfæroider dyrket i 1 dag (orange kurver) og 21 dage (grå kurver) måles med VSM, med et fald i magnetisme, der indikerer en nedbrydning af nanopartiklerne. Repræsentative TEM billeder taget på dag 21 viser lysegrå prikker omkring 6 nm er størrelse i endosomer og cytoplasma af cellerne, typisk størrelse og form af ferritin, jern opbevaring protein (sorte pile). Nogle intakte nanopartikler kan også observeres, for det meste for PAA-coatede nanopartikler (brun pil). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af en hurtig og effektiv mikrobølgebaseret syntese kan magnetiske nanopartikler let syntetiseres med kontrolleret størrelse og yderligere belagt med givne molekyler. Et kritisk skridt er at lagerføre jernsalt og benzylalkohol under vakuum for at holde en lille spredning i størrelse. Benzylalkoholen fungerer både som opløsningsmiddel og ligand, samtidig med at den gør det muligt direkte at opnå kalibreret bare jernoxid uden behov for yderligere ligands. Efter nanopartikler overførsel i vand de nøgne magnetiske nanopartikler kan nemt belægges med et stort udvalg af ligands. Denne belægning giver inter-nanopartikel og nanopartikelcelle interagerende egenskaber, der kan påvirke deres cellulære internalisering, en parameter, der skal styres tæt, da der kræves en minimal internalisering til biomedicinske applikationer, mens en for høj internalisering kan være skadelig for cellerne og potentielt stamme cytotoksiske hændelser31. Magnetometri er et kraftfuldt værktøj til at vurdere denne internalisering såvel som skæbnen for magnetiske nanopartikler i cellulo. Ved inkorporering af magnetiske nanopartikler i stamceller kan sfæroider dannes via en simpel centrifugering efterfulgt af kultur i et medium, der stopper spredningen af cellerne og driver ekstracellulær matrixproduktion. Cellerne bliver meget sammenhængende og begynder at skabe et væv. Kugleformierne er derefter meget nemme at håndtere og kan dyrkes i længere perioder (måneder), der giver mulighed for langsigtet sporing af magnetiske nanopartiklers skæbne i et biologisk miljø. Ved at stoppe celledeling er der ingen fortynding af nanopartiklerne fra mor til datter-celle; desuden er det blevet verificeret, at der med denne celle-sfæroid model, er der ingen jern undslippe over en måneds kultur21,22,23. Som følge heraf kan et fald i magnetismeværdier kun svare til en nedbrydning af nanopartiklerne og ikke til jern, der eksporteres ud af cellerne.
Magnetisme af cellen sfæroider er her målt via VSM, der giver en hurtig og præcis kvantificering. Andre metoder er også blevet undersøgt for at måle cellulær magnetisme, såsom at bruge en Superconducting Interface Device (SQUID), en maskine typisk mere præcis end VSM med en følsomhed omkring 10-7 emu sammenlignet med 10-6 emu for VSM, men driftsomkostningerne er højere32. Følsomheden af VSM tillader målinger af magnetisk jern dosis ringere end 2 pg / celle i den eksperimentelle setup er heri tilstrækkelig præcis som jern doser ringere end 2 pg / celle ville være for lav til de tilsigtede applikationer, såsom celle attraktion mod en magnetisk for celle vejledning og væv engineering formål. Både VSM og SQUID magnetometri, ud over at tillade en kvantificering af cellemagnetisme, kan give yderligere detaljer om nanopartiklernes funktioner. Ved analyse af det opnåede signal kan nanopartiklernes størrelse fratrækkes22,23 og også generel opfattelse af deres magnetiske egenskaber kan opnås, hysterese og tvang af nanomaterialer kan for eksempel afsløres. Alternative magnetometri tilgange findes også, såsom magnetophoresis, der består i at måle hastigheden af de enkelte celler, når tiltrukket mod en magnet og magnetisme af enkeltceller er ekstrapoleret33,34. Magnetismen på enkeltcelleniveau kan på denne måde opnås; der kan dog ikke bestemmes yderligere nanopartikelfunktioner. Derudover er en lille magnetisk sensor, der giver et signal, der er proportionalt med prøvemagnetismen, for nylig blevet brugt med en lignende cellespærremodel. Denne magnetiske sensor gjorde det muligt at spore magnetiske nanopartiklers bionedbrydning i realtid, kontinuerligt, over 7 dage35. Signalet fra denne magnetiske sensor kan dog ikke oversættes direkte til et magnetisk øjeblik, da det afhænger af nanopartiklernes størrelse. Af denne grund skal der udføres en kalibreringskurve for hvert nanopartikeldesign, kurve, der kan realiseres ved hjælp af VSM.
Målinger udført heri med VSM viser en progressiv nedbrydning af de magnetiske nanopartikler i cellemiljøet, indikeret af et fald i magnetisme. De beviser også, at en samme kerne belagt med forskellige molekyler nedbrydes ved forskellige hastigheder afhængigt af belægningen. Når du sammenligner en PAA og en citratbelægning, fører PAA til højere kernebeskyttelse til nedbrydning, sandsynligvis på grund af dens stærke forankring til den magnetiske kerne20. Skæbnen for magnetiske nanopartikler i det intracellulære miljø vurderes på cellesprædroider; Metoden er dog ikke begrænset til den. Faktisk kan det ekstrapoleres til celleaffjedring, som allerede er blevet brugt til at vurdere virkningen af stamcelledifferentiering på nanopartiklernes skæbne22. Det afslørede, at de magnetiske nanopartikler afhængigt af differentieringsvejen behandles forskelligt af cellerne, med i nogle tilfælde neokrystallisering af jern ved dets opløsning. VSM magnetometri er således et nyttigt redskab til yderligere at udforske indflydelsen af både nanopartikel og celle funktioner på intracellulær behandling af jernoxid nano-objekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Den Europæiske Union (ERC-2014-CoG-projektet MaTissE #648779). Forfatterne vil gerne anerkende CNanoMat fysisk-kemiske karakteristik platform af University Paris 13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), Deerfield Beach, Fla. 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al.
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles - The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
