Summary
Las nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan a través de un procedimiento de gel sol noaqueoso y están recubiertas con moléculas cortas aniónicas o polímero. El uso de magnetometría para monitorear la incorporación y biotransformaciones de nanopartículas magnéticas dentro de células madre humanas se demuestra utilizando un magnetómetro de muestra vibratoria (VSM).
Abstract
Las nanopartículas magnéticas, hechas de óxido de hierro, presentan un interés peculiar para una amplia gama de aplicaciones biomédicas para las que a menudo se interiorizan en las células y luego se dejan dentro. Un desafío es evaluar su destino en el entorno intracelular con metodologías fiables y precisas. En este documento, introducimos el uso del magnetómetro de la muestra vibratoria (VSM) para cuantificar con precisión la integridad de las nanopartículas magnéticas dentro de las células midiendo su momento magnético. Las células madre se etiquetan por primera vez con dos tipos de nanopartículas magnéticas; las nanopartículas tienen el mismo núcleo producido a través de una síntesis rápida y eficiente de gel sol a base de microondas y difieren en su recubrimiento: la molécula de ácido cítrico comúnmente utilizada se compara con el ácido poliacrílico. La formación de esferoides celulares 3D se logra a través de la centrifugación y el momento magnético de estos esferoides se mide en diferentes momentos con el VSM. El momento obtenido es una huella digital directa de la integridad de las nanopartículas, con valores decrecientes indicativos de una degradación de las nanopartículas. Para ambas nanopartículas, el momento magnético disminuye con el tiempo de cultivo revelando su biodegradación. También se muestra un efecto protector del recubrimiento de ácido poliacrílico, en comparación con el ácido cítrico.
Introduction
Hay un mayor interés en las características magnéticas de las nanopartículas de óxido de hierro para una amplia gama de aplicaciones biomédicas. Su respuesta a la resonancia magnética los convierte en agentes de contraste fiables para la resonancia magnética (RM), una ventaja en la medicina regenerativa donde las células etiquetadas con nanopartículas magnéticas pueden ser rastreadas in vivo después de la implantación1. Utilizando campos magnéticos, las células también se pueden guiar a distancia; de esta manera, los esferoides celulares2,3,anillos4,o hojas5 se pueden diseñar magnéticamente y también estimulado remotamente6,un activo en el desarrollo de tejidos sin andamios. La gama de posibilidades para estas nanopartículas también incluye sistemas de administración de fármacos7,8 y tratamiento hipertérmico magnético y fotoinducido para matar las células cancerosas9,10,11. Para todas estas aplicaciones, las nanopartículas se integran en el entorno biológico, ya sea mediante inyección intravenosa o a través de la internalización directa en las células y luego se dejan dentro, lo que pone en tela de juicio su destino intracelular.
Los análisis in vivo transmitieron una comprensión general del destino de las nanopartículas en el organismo: al inyectarse en el torrente sanguíneo, primero son capturadas en su mayoría por los macrófagos del hígado (células de Kupffer), bazo y médula ósea, se degradan progresivamente, y se unen a la piscina de hierro del organismo12,13,14,15,16,17,18,19. Las observaciones cualitativas sólo son posibles debido a la circulación de las nanopartículas en todo el organismo. Por lo general, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) se puede utilizar para observar directamente las nanopartículas y la presencia de hierro en los órganos se puede determinar a través de la dosificación. Más recientemente, su destino ha sido evaluado directamente en un conjunto de células, lo que significa en circuito cercano sin escape de hierro, permitiendo una medición cuantitativa de sus biotransformaciones a nivel celular20,21,22. Tales mediciones son posibles a través del análisis de las propiedades magnéticas de las nanopartículas que están estrechamente vinculadas a su integridad estructural. La magnetometría de muestras vibratorias (VSM) es una técnica en la que la muestra vibra periódicamente para que la medición de la bobina del flujo inducido proporcione el momento magnético de la muestra en el campo magnético aplicado. Dicha detección sincrónica permite una medición rápida, que es un activo para determinar los momentos magnéticos de un gran número de muestras20,21,22,23. La firma magnética macroscópica recuperada por VSM ofrece una visión cuantitativa de toda la muestra biológica directamente correlacionada con el tamaño y la estructura de las nanopartículas. En particular, proporciona el momento magnético en saturación (expresado en emú) de las muestras, que es una cuantificación directa del número de nanopartículas magnéticas presentes en la muestra, respectivamente a sus propiedades magnéticas específicas.
Se ha demostrado que el procesamiento intracelular de nanopartículas magnéticas está estrechamente vinculado a sus características estructurales20. Estas características se pueden controlar a través de protocolos de síntesis óptimos. Cada protocolo presenta ventajas y limitaciones. Las nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan comúnmente en soluciones acuosas a través de la coprecipitación de iones de hierro24. Para superar las limitaciones de la polidispersidad del tamaño de las nanopartículas, se han desarrollado otros métodos de síntesis como los métodos sol-gel mediados por poliol25. Los enfoques noaqueos por descomposición térmica conducen a la producción de nanopartículas de óxido de hierro muy bien calibradas26. Sin embargo, el uso de cantidades masivas de tensioactivos como la oleylamina o el ácido oleico complica su funcionalización y transferencia de agua para aplicaciones biomédicas. Por esta razón, sintetizamos tales nanopartículas magnéticas a través de una ruta de gel sol noaqueís que conduce a alta cristalina, pureza y reproducibilidad27. Este protocolo produce nanopartículas de tamaño bien controladas que se pueden ajustar a través de la variación de temperatura28. Sin embargo, la ruta sol-gel no acuosa asistida por microondas tiene un límite de tamaño superior de las nanopartículas obtenidas de alrededor de 12 nm. Este procedimiento no se adaptaría para aplicaciones que utilicen partículas ferromagnéticas a temperatura ambiente. Además de la síntesis del núcleo, otra característica principal a tener en cuenta es el recubrimiento. Acostado en la superficie de la nanopartícula, el revestimiento actúa como una molécula de anclaje, ayudando a la internalización específica de las nanopartículas, o puede proteger la nanopartícula de la degradación. Dado que el alcohol bencílico actúa como una fuente de oxígeno y un ligando al mismo tiempo, las nanopartículas desnudas se producen sin necesidad de tensioactivos o ligandos adicionales. Las nanopartículas se funcionalizan fácilmente después de la síntesis sin un proceso de intercambio de tensioactivos.
En este documento, se evalúan dos tipos de nanopartículas que poseen el mismo núcleo y difieren en el recubrimiento. El núcleo se sintetiza utilizando una técnica rápida y altamente eficiente basada en microondas. Los dos recubrimientos comparados consisten en ácido cítrico, uno de los más utilizados como agente de recubrimiento en aplicaciones biomédicas29,30,y ácido poliacrílico (PAA), un revestimiento polimérico con un alto número de funciones quelantes. Las mediciones de magnetometría VSM se utilizan primero para cuantificar la absorción de nanopartículas por las células, y luego como una evaluación directa de la integridad estructural de las nanopartículas al internalizarse en las células madre. Los resultados demuestran que la concentración de incubación afecta a la absorción de nanopartículas y que el recubrimiento influye en su degradación, con el gran número de moléculas de anclaje de PAA protegiendo el núcleo de la degradación.
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Protocol
1. Síntesis de nanopartículas magnéticas
- Síntesis de núcleos – asistido por microondas
- Disolver 400 mg de acetiletonato de hierro (III) (>99,9%) en 10 ml de alcohol bencílico (BA, 99,8%) dentro de un vial de vidrio monowave de 30 ml.
- Aumente la temperatura de la suspensión de 25 a 250 °C en 20 min (a una velocidad de 11,25 °C/min) y mantenla a 250 °C durante 30 minutos utilizando un reactor microondas.
- Transfiera las nanopartículas resultantes suspendidas en alcohol bencílico a un vial de vidrio y separe las nanopartículas utilizando un imán de neodimio durante 30 min.
- Lave el precipitado en el vial de vidrio anterior de 100 ml con 10 ml de diclorometano, 1 M de hidróxido sódico, etanol, agua pH 7 (tres veces) utilizando un imán de neodimio durante 5 minutos cada paso para peletizar nanopartículas y eliminar el sobrenadante.
- Ajuste la suspensión de nanopartículas en agua a pH 2 utilizando ácido clorhídrico de 1 M y, a continuación, centrífuga en filtros ultracentrífugos de 100 kDa a 2.200 x g durante 10 minutos.
- Retire el filtrado, agregue 12 ml de ácido clorhídrico de10-2 M a la solución de nanopartículas y centrífuga en filtros ultracentrífugos de 100 kDa a 2.200 x g durante 10 min (tres veces). A continuación, diluya la solución de nanopartículas dentro de 10 ml de ácido clorhídrico de10-2 M antes de recubrimiento.
- Capa
- Diluir 175 mg de ácido cítrico y ácido poliacrílico en agua a la pH 2 en un vial de vidrio de 100 ml y ajustar el pH a 2 con una solución de ácido clorhídrico de 1 M.
- Añadir las nanopartículas de 10 ml de dispersión acuosa a la solución de molécula de recubrimiento, correspondiente a una relación de masa de 5 entre la molécula de recubrimiento y las nanopartículas. Agitar durante 2 h bajo agitación magnética a temperatura ambiente.
- Después de la reacción, ajuste el pH a 7 con hidróxido de sodio de 1 M.
- Centrífuga la solución de nanopartícula 3 veces con agua desionizada (DI) en filtros ultracentrífugos de 100 kDa a 2.200 x g durante 10 minutos; eliminar el filtrado y diluir la solución de nanopartículas en 12 ml de agua di.
2. Cultivo y etiquetado magnético de células madre
- Cultivo de células madre mesenquimales humanas (MSC) en el medio de crecimiento completo de células madre mesenquimales (MSCGM) a 37 °C y 5% CO2. Cuando las células estén al 90% de confluencia, agregue 10 ml de trippsina-EDTA precalentada a 37 °C por matraz de 150 cm² y deje durante 2-3 minutos para separar las células.
- Para saber cuándo se separan las células, observelas con un microscopio de campo brillante. Resuspend las células separadas en MSCGM y divida en cuatro matraces de 150 cm². Amplificar las células de esta manera hasta el paso 4 a 5.
- Preparar la solución de nanopartículas magnéticas para el etiquetado celular: dispersar la concentración elegida de nanopartículas de óxido de hierro en el medio gratuito Roswell Park Memorial Institute (RMPI-1640) sin glutamina. RPMI se utiliza para la incubación de nanopartículas (y los pasos de enjuague relacionados) ya que tiene una fuerza iónica más baja que DMEM y previene mejor los eventos de agregación de nanopartículas.
- Cuando las células estén en el paso 4 o 5 y 90% confluentes, retire el medio MSCGM, enjuague las células con RPMI libre de suero (sin glutamina) y agregue 10 ml de solución de nanopartículas de óxido de hierro por 150 cm2 matraz de cultivo, que es el volumen mínimo necesario para cubrir todas las células.
- Incubar a 37 °C y 5% CO2 durante 30 min y luego desechar la solución de nanopartículas. Lávese una vez con RPMI-1640 libre de suero (sin glutamina) e incubar con el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco complementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina (25 ml por 150 cm2 matraz) durante la noche a 37 °C y 5% CO2 para permitir una internalización completa de las nanopartículas.
3. Formación de esferoides de células madre
- Preparar recién preparado medio de cultivo de esferoides celulares compuesto de DMEM alta glucosa con L-glutamina complementada con 50 μM L-ácido ascórbico 2-fosfato, 0.1 μM dexametasona, 1 mM de piruvato sódico, 0.35 mM L-proline, y 1% suplemento de cultivo universal que contiene insulina, transferrina humana y ácido seleno (ITS-Premix).
- Desenganche los MSC magnéticos añadiendo 10 ml de 0.05% trypsin-EDTA precalentado a 37 °C por 150 cm2 frasco durante 2-3 minutos. Cuando las células se desasocian, inactive inmediatamente la trippsina añadiendo 1/3 del volumen de DMEM complementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina precalentada a 37 °C.
- Centrífuga las células disociadas a 260 x g durante 5 minutos, aspirar el medio y volver a suspender las células en un volumen pequeño (menos de 1 ml por matraz de 150 cm²) del medio de cultivo esferoide celular, como tener 200.000 células en aproximadamente 50 μL de medio. Cuente el número de celda usando un hemociclo y ajuste el volumen si es necesario.
- Añadir 1 ml de medio de cultivo de esferoide celular recién preparado en un tubo centrífugo cónico estéril de 15 ml y añadir el volumen de solución resuspended correspondiente a 200.000 células.
- Centrífuga estas células etiquetadas magnéticamente a 180 x g durante 3 minutos, como formar un pellet celular en la parte inferior del tubo y mantener el sobrenadante, que es el medio de cultivo celular.
- Abra ligeramente los tubos para permitir el intercambio de aire e incubar a 37 °C con un 5% de CO2 durante un máximo de 21 días, tiempo de cultivo a lo largo del cual las células forman una estructura 3D cohesiva que resulta en un esferoide completamente formado. Cambie el medio dos veces por semana.
- En días dados, lave los esferoides dos veces con tampón de cacodilato hecho de cacodilato de 0,2 M diluido en agua desmineralizada y arréglalos usando 2% de glutaraldehído en 0,1 M de cacodilato diluido en agua destilada durante 30 min a temperatura ambiente. Almacene los esferoides fijos en PBS hasta que se utilicen para la medición VSM o imágenes TEM. Este paso de fijación detiene todos los procesos biológicos y permite la conservación a largo plazo.
4. Cuantificación de nanopartículas magnéticas en solución y en celulo utilizando un magnetómetro de muestra vibratoria (VSM)
- Coloque un volumen dado de solución de nanopartícula magnética (máximo 10 μL) o un único esferoide de celda en el soporte de muestra diseñado específicamente para caber en el VSM.
- Inserte la muestra en el VSM y busque el desplazamiento de la muestra. Coloque la muestra en la posición correspondiente al máximo de magnetización.
- Realice la primera medición en un campo magnético bajo (entre -1500 Oe y +1500 Oe) con una velocidad de 20 Oe/s.
- Realice una segunda medición en un campo magnético alto (entre -30 000 Oe y +30 000 Oe) con una velocidad de 200 Oe/s.
5. Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM)
- Para las soluciones de nanopartículas, deposite 10 μL de la solución acuosa en una rejilla de cobre recubierta de carbono y déjela secar a temperatura ambiente.
- Para las nanopartículas interiorizadas en las células, contraste los esferoides celulares fijos con extracto de té Oolong (OTE) a 0.5% diluido en 0.1 M cacodilato buffer, post fix con 1% tetroxida de osmio que contiene 1.5% de cianoferato de potasio y luego deshidratar en baños de etanol calificados, incluido en Epon. Corta ultrasecciones de 70 nm y colócalos en rejillas de cooperación.
- Tome imágenes usando un microscopio electrónico a 80 kV con una ampliación de 1k para la observación de células enteras a 40k para la observación de compartimentos endosomales.
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Representative Results
Utilizando la síntesis asistida por microondas, se producen y recubren nanopartículas magnéticas con un tamaño de núcleo monodisperse de 8,8 ± 2,5 nm con citrato o PAA (Figura 1A). A continuación, las células madre se incuban con estas nanopartículas dispersas en el medio de cultivo a una concentración determinada durante 30 minutos, lo que resulta en su endocitosis y confinamiento dentro de los endosomas celulares(Figura 1B). Las células madre magnéticas se suspenden en medio, centrifugadas, y el pellet celular formado se cultiva hasta 21 días(Figura 1C). Los esferoides obtenidos son fijos, como detener los procesos biológicos, y se mantienen en PBS hasta que se miden a través de VSM.
En primer lugar, el momento magnético de la solución de nanopartícula se mide utilizando el VSM: se mide 10 μL de la dispersión acuosa de nanopartícula que contiene 7 μg de hierro, y la curva obtenida se muestra en la Figura 2A. Debido a la presencia de agua en esta solución, y al soporte de la muestra, se captura una señal diamagnética además de la señal superparamagnética de las nanopartículas. Se puede medir una constante diamagnética (Mdia)correspondiente a la pendiente de la segunda parte de la curva, como se muestra en la Figura 2A,y esta constante se puede restar como obtener el momento magnético de las nanopartículas solamente(muestra M = M - Mdia). A continuación, se puede extraer la magnetización de saturación de las nanopartículas (Ms); corresponde a 518 μemu para la dispersión acuosa, lo que significa que la solución es de 74 emú/g de hierro (Fe) correspondiente a 52 emú/g de nanopartículas (Fe3O4).
El momento magnético de los esferoides celulares se puede obtener de manera similar. En este caso, se inserta un esferoide de celda (hecho de 200.000 celdas) en el soporte de la muestra, colocado en el VSM y medido (Figura 2B). Los valores de momento magnético obtenidos son aquí mucho más bajos que los de la solución inicial de nanopartículas; sin embargo, permanecen dentro del rango de detección. La magnetización de saturación de esta muestra en particular es de 69 μemu. Además, este esferoide contiene 1,3 μg de nanopartículas (6,7 pg de nanopartículas por célula), consistente con el valor de saturación en 52 emú/gFe3O4. Por lo tanto, este valor se puede utilizar para determinar la cantidad de nanopartículas en muestras celulares. En la Figura 2C,los esferoides correspondientes a células etiquetadas con tres concentraciones de nanopartículas recubiertas de citrato se miden un día después del etiquetado. Los resultados muestran claramente que la absorción de las nanopartículas depende de la concentración de incubación, con concentraciones de 0,125, 0,25 y 0,5 mM que conducen a captaciones de 0,3, 0,7 y 1,3 μg de hierro por esferoide, es decir, 1,3, 3,3 y 6,7 pg de hierro por célula, respectivamente.
Se ha prestado atención a la importancia del recubrimiento superficial, que interactúa directamente con el entorno biológico20. Aquí se han producido dos recubrimientos: un recubrimiento de citrato, comúnmente utilizado para aplicaciones biomédicas, y un recubrimiento PAA, con un mayor número de funciones quelantes. Las células madre están etiquetadas con estos dos tipos de nanopartículas y centrifugadas, como la formación de un pellet celular que luego se convierte en un esferoide de células cohesivo (Figura 3A). El magnetismo de estos esferoides celulares se mide a través de VSM en el día 1 y el día 21(Figura 3B y Figura 3C). Los resultados demuestran una disminución del magnetismo en los 21 días de cultivo, lo que indica la biodegradación de las nanopartículas, siendo esta degradación más importante para las nanopartículas recubiertas de citrato(Figura 3B)que las recubiertas de PAA(Figura 3C). Las imágenes tem confirman la degradación de las nanopartículas y muestran la aparición de puntos grises claros más pequeños (6 nm de tamaño), típicos de la ferritina cargadas de hierro. También se pueden observar algunas nanopartículas que permanecen intactas, particularmente con el recubrimiento PAA.
Figura 1: Síntesis asistida por microondas de nanopartículas de óxido de hierro (Fe3O4),su internalización en células madre y el cultivo posterior de las células como esferoides. (A) Esquema de los diversos pasos de la síntesis de nanopartículas. En primer lugar, el núcleo se sintetiza a través de un procedimiento de gel sol no acuoso. La molécula de recubrimiento, citrato (Cit) o ácido poliacrílico (PAA), se injerta en la superficie del núcleo de óxido de hierro. Una imagen representativa de TEM muestra las nanopartículas sintetizadas con un recubrimiento de citrato. (B) Esquema de la internalización de nanopartículas dentro de las células madre, mostrando las nanopartículas confinadas en los endomas tras la internalización. Las imágenes representativas de TEM también muestran el citrato y las nanopartículas recubiertas de PAA dentro de las células, confinadas en los endomas. (C) Esquema de formación de esferoides de células madre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Medición del momento magnético de las muestras a través de VSM. (A) 10 μL de nanopartículas dispersas en una solución acuosa se miden a través del VSM. La señal obtenida representa el momento magnético de esta solución de nanopartícula en función del campo magnético (B). El diamagnetismo procedente de la presencia de agua y del soporte de la muestra se puede medir como corresponde a la pendiente de la segunda parte de la curva y restar como la obtención del momento magnético de las nanopartículas solamente. A continuación, se puede determinar el momento magnético de saturación (Ms). (B) El momento magnético de los esferoides celulares se puede obtener de manera similar; En este caso, un solo esferoide de celda se mide en un período de tiempo determinado. (C) Curvas de esferoides correspondientes a células etiquetadas con nanopartículas recubiertas de citrato a tres concentraciones independientes de 0,125 mM (naranja), 0,25 mM (gris) y 0,5 mM (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación de la degradación magnética de nanopartículas en el celulo a través de VSM. (A) Al etiquetar la célula con nanopartículas magnéticas, un pellet celular está formado por centrifugación (día 0). A continuación, las células forman una estructura cohesiva que resulta en un esferoide de celda fácil de manejar que se puede mantener en el cultivo sin pérdida celular durante períodos de tiempo prolongados (meses). (B, C) En este documento, dos tipos de nanopartículas magnéticas, recubiertas de citrato(B)o PAA(C),están interiorizadas en células madre y las células se cultivan como esferoides durante un tiempo de hasta 21 días. El magnetismo de los esferoides cultivados durante 1 día (curvas naranjas) y 21 días (curvas grises) se mide con el VSM, con una disminución del magnetismo que indica una degradación de las nanopartículas. Las imágenes representativas de TEM tomadas en el día 21 muestran puntos grises claros de unos 6 nm de tamaño dentro de los endomas y el citoplasma de las células, el tamaño y la forma típicos de la ferritina, la proteína de almacenamiento de hierro (flechas negras). También se pueden observar algunas nanopartículas intactas, principalmente para las nanopartículas recubiertas de PAA (flecha marrón). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Utilizando una síntesis rápida y eficiente a base de microondas, las nanopartículas magnéticas se pueden sintetizar fácilmente, con tamaño controlado y recubiertas aún más con moléculas dadas. Un paso crítico es abastecer la sal de hierro y el alcohol bencílico bajo vacío para mantener una pequeña dispersión en tamaño. El alcohol bencílico actúa como disolvente y ligando al mismo tiempo permitiendo obtener directamente óxido de hierro desnudo calibrado sin necesidad de ligandos adicionales. Después de la transferencia de nanopartículas en agua, las nanopartículas magnéticas desnudas se pueden recubrir fácilmente con una gran variedad de ligandos. Este recubrimiento confiere propiedades de interacción entre nanopartículas y nanopartículas que pueden influir en su internalización celular, un parámetro que debe controlarse estrictamente ya que se requiere una internalización mínima para aplicaciones biomédicas, mientras que una internalización demasiado alta podría ser perjudicial para las células y potencialmente originar eventos citotóxicos31. La magnetometría es una poderosa herramienta para evaluar esta internalización, así como el destino de las nanopartículas magnéticas en el celulo. Tras la incorporación de nanopartículas magnéticas en células madre, los esferoides se pueden formar a través de una simple centrifugación seguida de cultivo en un medio que detiene la proliferación de las células e impulsa la producción de matriz extracelular. Las células se vuelven altamente cohesivas y comienzan a crear un tejido. Los esferoides son entonces muy fáciles de manejar y pueden ser cultivados durante largos períodos de tiempo (meses) que permite el seguimiento a largo plazo del destino de las nanopartículas magnéticas en un entorno biológico. Al detener la división celular, no hay dilución de las nanopartículas de la madre a la célula hija; además, se ha comprobado que, con este modelo de esferoide celular, no hay escape de hierro durante un mes de cultivo21,22,23. Como consecuencia, una disminución de los valores de magnetismo sólo puede corresponder a una degradación de las nanopartículas y no al hierro que se exporta fuera de las células.
El magnetismo de los esferoides celulares se mide aquí a través de VSM que proporciona una cuantificación rápida y precisa. También se han explorado otros métodos para medir el magnetismo celular, como el uso de un dispositivo de interfaz superconductor (SQUID), una máquina típicamente más precisa que el VSM con una sensibilidad de alrededor de 10-7 emúes en comparación con 10-6 emúes para el VSM, pero el costo operativo es mayor32. La sensibilidad del VSM permitiendo mediciones de dosis magnéticas de hierro inferiores a 2 pg/célula en la configuración experimental es lo suficientemente precisa como dosis de hierro inferiores a 2 pg/célula sería demasiado baja para las aplicaciones dirigidas, como la atracción celular hacia un magnético con fines de orientación celular e ingeniería de tejidos. La magnetometría VSM y SQUID, además de permitir una cuantificación del magnetismo celular, puede dar detalles adicionales sobre las características de las nanopartículas. Mediante el análisis de la señal obtenida, el tamaño de las nanopartículas se puede deducir22,23 y también se puede obtener la noción general de sus características magnéticas, la histéresis y la coercitividad de los nanomateriales pueden revelarse, por ejemplo. También existen enfoques alternativos de magnetometría, como la magnetoforesis que consiste en medir la velocidad de las células individuales cuando se atrae hacia un imán y el magnetismo de las células individuales se extrapola33,34. El magnetismo a nivel de una sola célula se puede obtener de esta manera; sin embargo, no se pueden determinar características adicionales de nanopartículas. Además, recientemente se ha utilizado un pequeño sensor magnético que proporciona una señal proporcional al magnetismo de la muestra con un modelo esferoide de celda similar. Este sensor magnético permitió el seguimiento de la biodegradación de nanopartículas magnéticas en tiempo real, continuamente, durante 7 días35. Sin embargo, la señal de este sensor magnético no se puede traducir directamente en un momento magnético, ya que depende del tamaño de las nanopartículas. Por esta razón, es necesario realizar una curva de calibración para cada diseño de nanopartícula, curva que se puede realizar utilizando el VSM.
Las mediciones realizadas en este documento con el VSM demuestran una degradación progresiva de las nanopartículas magnéticas en el entorno celular, indicada por una disminución del magnetismo. También evidencian que un mismo núcleo recubierto con diferentes moléculas se degrada a diferentes velocidades dependiendo del recubrimiento. Al comparar un PAA y un recubrimiento de citrato, PAA conduce a una mayor protección del núcleo a la degradación, muy probablemente debido a su fuerte anclaje al núcleo magnético20. El destino de las nanopartículas magnéticas en el entorno intracelular se evalúa en esferoides celulares; sin embargo, el método no se limita a él. De hecho, se puede extrapolar a las suspensiones celulares, que ya se ha utilizado para evaluar el efecto de la diferenciación de células madre en el destino de las nanopartículas22. Reveló que, dependiendo de la vía de diferenciación, las nanopartículas magnéticas son procesadas de manera diferente por las células, con, en algunos casos, la neo-cristalización del hierro tras su disolución. La magnetometría VSM es, por lo tanto, una herramienta útil para explorar aún más la influencia de las características de nanopartículas y células en el procesamiento intracelular de nano-objetos de óxido de hierro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la Unión Europea (proyecto ERC-2014-CoG MaTissE #648779). A los autores les gustaría reconocer la plataforma de caracterizaciones fisicoquímicas CNanoMat de la Universidad París 13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
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