Summary
酸化鉄ナノ粒子は、非水性ゾルゲル法を介して合成され、アニオン性短分子またはポリマーでコーティングされる。ヒト幹細胞内部の磁気ナノ粒子の組み込みや生体変換をモニタリングするための磁気測定の使用は、振動試料磁力計(VSM)を用いて実証されています。
Abstract
酸化鉄で作られた磁性ナノ粒子は、細胞内にしばしば内在し、その後内部に残される生物医学的用途の広い範囲に独特の関心を提示する。1つの課題は、信頼性の高い正確な方法論で細胞内環境における彼らの運命を評価することです。ここでは、振動サンプル磁力計(VSM)を用いて、磁気モーメントを測定することで、細胞内の磁性ナノ粒子の完全性を正確に定量化する。幹細胞は、まず2種類の磁性ナノ粒子で標識されます。ナノ粒子は、迅速かつ効率的なマイクロ波ベースの非水溶液ゾルゲル合成を介して生成される同じコアを有し、そのコーティングにおいて異なる:一般的に使用されるクエン酸分子は、ポリアクリル酸と比較される。3Dセルスフェロイドの形成は遠心分離によって達成され、これらの回転楕円体の磁気モーメントはVSMと異なる時間に測定される。得られた瞬間は、ナノ粒子の完全性の直接の指紋であり、ナノ粒子の分解を示す値が減少する。両方のナノ粒子について、磁気モーメントは培養時間の経過とともに減少し、その生分解を明らかにする。クエン酸と比較した場合、ポリアクリル酸コーティングの保護効果も示される。
Introduction
広範囲の生物医学用途に対する酸化鉄ナノ粒子の磁気的特徴に対する関心が高まっている。磁気共鳴に対する応答は、磁気共鳴画像法(MRI)の信頼性の高い造影剤を作り、磁気ナノ粒子で標識された細胞を移植1後に生体内で追跡できる再生医療における利点である。磁場を使用すると、距離でセルを誘導することもできます。このように、セルラーススフェロイド2、3、リング4、またはシート5は、磁気的に設計され、また足場のない組織の開発における資産である6を遠隔刺激することができる。これらのナノ粒子の可能性の範囲はまた、薬物送達システム7、8および癌細胞9、10、11を殺すために磁気および光誘導性高熱治療を含む。これらすべての用途に対して、ナノ粒子は、静脈内注射または細胞内の直接の内在化によって生物学的環境に統合され、その後、その中に残され、細胞内の運命に疑問をもたらします。
生体内分析は、生体内のナノ粒子の運命の一般的な理解を伝えた:血流中の注入時に、それらは最初に肝臓(クファー細胞)、脾臓および骨髄のマクロファージによって主に捕捉され、徐々に分解され、生物12、13、14、15、16、17、18、18の鉄プールに結合する。定性的な観察は、生物全体のナノ粒子の循環のためにのみ可能です。典型的には、透過電子顕微鏡(TEM)を使用して、ナノ粒子を直接観察することができ、器官中の鉄の存在は、投与量を介して決定することができる。最近では、それらの運命は細胞のプールで直接評価されており、鉄分けのない近い回路では、細胞レベル20、21、22での生体変換の定量的測定が可能である。このような測定は、構造の完全性に密接に関連しているナノ粒子の磁気特性の分析によって可能である。振動サンプル磁気測定(VSM)は、誘導されたフラックスのコイル測定が適用された磁場でのサンプルの磁気モーメントを提供するようにサンプルを周期的に振動させる技術です。このような同期検出は、多数のサンプル20、21、22、23の磁気モーメントを決定するための資産である迅速な測定を可能にする。VSMによって得られた巨視的磁気シグネチャは、ナノ粒子のサイズと構造に直接相関する生物学的サンプル全体の定量的な概要を与える。特に、サンプルの飽和時の磁気モーメント(emuで表す)を提供し、これはサンプル中に存在する磁気ナノ粒子の数をそれぞれ特異的な磁気特性に直接定量するものである。
磁気ナノ粒子の細胞内処理は、その構造特徴20と密接に結びついていることが示されている。これらの機能は、最適な合成プロトコルを介して制御することができます。各プロトコルには利点と制限があります。酸化鉄ナノ粒子は、一般的に、鉄イオン24の共沈を介して水溶液中で合成される。ナノ粒子サイズの多分散性の限界を克服するために、ポリオール媒介ゾルゲル法などの他の合成方法が25に開発されている。熱分解による非水性アプローチは、非常によく較正された酸化鉄ナノ粒子26の製造につながる。しかし、オレイラミンやオレイン酸のような大量の界面活性剤を使用すると、生物医学の用途のために機能化と水の移動が複雑になります。このため、このような磁性ナノ粒子を、高い結晶性、純度、再現性27に至る非水性ゾルゲル経路を介して合成する。このプロトコルは、温度変動28によって調整することができる十分に制御されたサイズのナノ粒子を生成する。それにもかかわらず、マイクロ波支援非水性ゾルゲル経路は、12nm前後の得られたナノ粒子の上限サイズ制限を有する。この手順は、室温で強磁性粒子を使用するアプリケーションには適合しません。コア合成に加えて、検討されるもう一つの主な特徴はコーティングである。ナノ粒子の表面に横たわって、コーティングはアンカー分子として機能し、ナノ粒子の標的化された内在化を助ける、またはナノ粒子を分解から保護することができる。ベンジルアルコールは酸素源とリガンドとして同時に作用するため、追加の界面活性剤やリガンドを必要とせずに裸ナノ粒子が生成されます。ナノ粒子は、界面活性剤交換プロセスなしで合成後に容易に機能する表面化される。
本明細書において、2種類のナノ粒子が同じコアを有し、コーティングにおいて異なると評価される。コアは高速かつ高効率のマイクロ波ベースの技術を使用して合成されます。比較した2つのコーティングは、バイオメディカルアプリケーションで最も使用されるクエン酸、29、30、およびポリアクリル酸(PAA)、キレート機能の高いポリマーコーティングで構成されています。VSM磁気測定は、まず細胞のナノ粒子取り込みの定量を行い、次に幹細胞内在化時のナノ粒子構造の完全性を直接評価するために使用されます。結果は、インキュベーション濃度がナノ粒子の取り込みに影響を与え、コーティングが劣化に影響を与えることを示し、PAAのアンカー分子の数が多く、コアを劣化から保護する。
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Protocol
1. 磁性ナノ粒子の合成
- コア合成 – マイクロ波アシスト
- 400mgの鉄(III)アセチルアセトネートを溶解する(>99.9%)ベンジルアルコール10mL(BA、99.8%)30 mLモノウェーブガラスバイアル内。
- サスペンションの温度を20分間(11.25°C/minの速度で)25〜250°Cに上げ、マイクロ波反応器を使用して30分間250°Cで維持します。
- 得られたナノ粒子をベンジルアルコールに懸濁してガラスバイアルに移し、ネオジム磁石を用いてナノ粒子を30分間分離する。
- 前の100 mLガラスバイアルでジクロロメタン10mL、1M水酸化ナトリウム、エタノール、pH7水(3回)を各ステップで5分間ネオジム磁石を使用して沈殿物を洗浄し、ナノ粒子をペレット化し、上清を除去します。
- 1 M塩酸を使用してpH2に水中のナノ粒子懸濁液を調整し、100kDa超遠心フィルターで10分間2,200xgで遠心分離機を調整します。
- 濾液を取り除き、10-2Mの塩酸の12mLをナノ粒子溶液に加え、遠心分離機を100kDaの超遠心フィルターで100mgで10分間(3回)加える。次に、ナノ粒子溶液を10-2M塩酸の10 mL以内で希釈してからコーティングします。
- コーティング
- 100 mLガラスバイアルでpH2の水中で175mgのクエン酸とポリアクリル酸を希釈し、1M塩酸溶液でpHを2に調整した。
- 10 mLナノ粒子をコーティング分子溶液に加え、被覆分子とナノ粒子との間の質量比5に対応する。室温で磁気撹拌を行う場合は2時間撹拌する。
- 反応後、1M水酸化ナトリウムでpHを7に調整します。
- ナノ粒子溶液を100kDa超遠心フィルターで100kDaの脱イオン(DI)水で3回遠心分離し、10分間2,200 x g; 濾液を取り除き、ナノ粒子溶液を12mLのDI水で希釈してください。
2. 幹細胞の培養・磁気標識
- ヒト間葉系幹細胞(MSC)を37°Cおよび5%CO2で完全な間葉系幹細胞増殖培地(MSCGM)で培養する。細胞が合流率90%のとき、トリプシン-EDTAの10 mLを150 cm²フラスコあたり37°Cであらかじめ加え、2〜3分間放置して細胞を取り外します。
- 細胞が剥離するタイミングを知るために、明視野顕微鏡でそれらを観察します。MSCGMで剥離した細胞を再懸濁し、4つの150 cm²フラスコに分けます。この方法で細胞を4~5の範囲まで増幅する。
- 細胞標識用の磁性ナノ粒子の溶液を調製:グルタミンなしで血清遊離ロズウェルパーク記念研究所培地(RMPI-1640)中に酸化鉄ナノ粒子の選択濃度を分散させる。RPMIは、DMEMよりもイオン強度が低く、ナノ粒子凝集事象を防ぐため、ナノ粒子インキュベーション(および関連するリンスステップ)に使用されます。
- 細胞が4または5および90%コンフルエントの通路にある場合、MSCGM培地を取り除き、血清を含まないRPMI(グルタミンなし)で細胞をすすいで、150cm2培養フラスコあたり10mLの酸化鉄ナノ粒子溶液を加え、すべての細胞をカバーするのに必要な最小体積である。
- 37°Cおよび5%CO2で30分間インキュベートし、ナノ粒子溶液を廃棄する。血清フリーRPMI-1640(グルタミンなし)で1回洗浄し、ダルベックコの修正イーグルミディアム(DMEM)でインキュベートし、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシン(15mL/150 cm2フラスコ)を一晩で37°Cで、5%CO2でインキュベートして内部ナノ粒子の内部を完成させます。
3. 幹細胞スフェロイドの形成
- DMEM高グルコースで構成された新しい細胞スフェロイド培地を、L-グルタミンを50 μM L-アスコルビン酸2リン酸、0.1 μMデキサメタゾン、1 mMナトリウムピルビン酸、0.35 mM L-プロリン、インスリン、ヒトトランスフェリンおよびセレン酸(ITS-PREmix)を含む1%のユニバーサル培養サプリメントを添加した。
- 150 cm2 フラスコあたり 37 °C で 0.05% トリプシン EDTA の 10 mL を 2~3 分間加えて、磁気 CS を取り外します。細胞が剥離したら、10%FBSを添加したDMEMの体積の1/3を加え、37°Cで予め加温したペニシリン・ストレプトマイシンを1%添加して、すぐにトリプシンを不活性化する。
- 解約細胞を5分間260xgで遠心分離し、培地を吸引し、約50μLの培地で20万個の細胞を有するなどの細胞スフェロイド培地の少量(150cm²フラスコあたり1mL未満)で細胞を再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用してセル数をカウントし、必要に応じて音量を調整します。
- 15 mLの無菌円錐形遠心分離機チューブに作りたての細胞スフェロイド培地を1 mL加え、200,000個の細胞に対応する再懸濁液の体積を加えます。
- これらの磁気標識細胞は、チューブの底部に細胞ペレットを形成する等の3分間180xgで遠心分離し、上清、細胞培養培地である上清を保つ。
- チューブをわずかに開けて空気交換を可能にし、5%CO2で37°Cで最大21日間インキュベートし、細胞が凝集した3D構造を形成する培養時間で完全に形成されたスフェロイドを生じる。週に2回メディアを変更します。
- 特定の日に、脱塩水で希釈した0.2Mカコチル酸カコジレートバッファーでスフェロイドを2回洗浄し、2%グルタルアルデヒドを0.1Mのカコチル化緩衝液で0.1Mのカコチル化緩衝液を室温で30分間希釈して固定します。VSM測定またはTEMイメージングに使用されるまで、固定されたスフェロイドをPBSに保管してください。この固定ステップは、すべての生物学的プロセスを停止し、長期的な保全を可能にします。
4. 振動サンプル磁力計(VSM)を用いた溶液中およびセルロ中の磁気ナノ粒子の定量化
- 特定の体積の磁気ナノ粒子溶液(最大10 μL)または単一のセルスフェロイドを、VSMに収まるように特別に設計されたサンプルホルダーに配置します。
- サンプルを VSM に挿入し、サンプル オフセットをスキャンします。サンプルを最大磁化に対応する位置に配置します。
- 低磁場(-1500 Oe~+1500 Oe)で、最初の測定を20 Oe/sのレートで行います。
- 200 Oe/sの速度で高磁場(-30 000 Oeと+30 000 Oeの間)で2回目の測定を行います。
5. 透過電子顕微鏡(TEM)解析
- ナノ粒子溶液の場合、水溶液の10μLをカーボンコーティングされた銅グリッドに堆積させ、室温で乾燥させます。
- 細胞内に内在化したナノ粒子については、0.1Mカコジレート緩衝液で希釈した0.5%のウーロン茶抽出物(OTE)と固定セルスフェロイドを対比し、1.5%のシアノフェレートカリウムを含む1%オスミウム四酸化1%で後固定し、等級エタノール浴中で脱水し、エポンに含まれる。70 nmの超断面をスライスし、クーパーグリッドに堆積させます。
- 80kVの電子顕微鏡を使用して、細胞全体を観察するために1kから40kまでの拡大で、内視鏡コンパートメントの観察のために画像を撮ります。
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Representative Results
マイクロ波支援合成を用いて、単分散8.8±2.5nmコアサイズの磁性ナノ粒子が製造され、クエン酸またはPAAのいずれかでコーティングされる(図1A)。次いで、これらのナノ粒子を一定の濃度で培養培地に分散させて培養し、細胞内エンドソーム内でエンドサイトーシスと閉じ込めを行う(図1B)。次いで磁気幹細胞を培地に懸濁し、遠心分離し、形成された細胞ペレットを最大21日間培養する(図1C)。得られたスフェロイドは、生物学的プロセスを停止するなどの固定され、VSMを介して測定されるまでPBSに保管する。
まず、ナノ粒子溶液の磁気モーメントを、7μgの鉄を含むナノ粒子水分散液の10μLを測定して、得られた曲線を図2Aに示したVSMを用いて測定する。この溶液中の水の存在、およびサンプルホルダーに、ナノ粒子の超常磁性信号に加えて、対磁性信号が捕捉される。図2Aに示すように、曲線の第2部の傾きに対応する対磁性定数(Mdia)を測定することができ、ナノ粒子のみの磁気モーメントを得るなどこの定数を減算することができる(Mサンプル=M-Mdia)。そして、ナノ粒子(M)の飽和磁化を抽出することができます。それは水性分散の518 μemuに相当し、ナノ粒子の52エミュー/gに対応する鉄(Fe)の74 emu/g(Fe)の溶液であることを意味する(Fe3O4)。
細胞回転楕円体の磁気モーメントも同様に得ることができる。この場合、細胞回転楕円体(20万個の細胞から成る)をサンプルホルダに挿入し、VSMに入れて測定した(図2B)。得られた磁気モーメント値は、初期ナノ粒子溶液の値よりもはるかに低い値です。ただし、検出範囲内に残ります。この特定のサンプルの飽和磁化は69 μemuです。また、このスフェロイドは、1.3 μgのナノ粒子(1細胞当たり6.7 pgのナノ粒子)を含み、52 emu/gFe3O4の飽和値と一致する。この値は、このように細胞サンプル中のナノ粒子の量を決定するために使用することができる。 図2Cにおいて、クエン酸被覆ナノ粒子の3つの濃度で標識された細胞に対応するスフェロイドは、標識後1日測定される。結果は、ナノ粒子の取り込みがインキュベーション濃度に依存し、濃度は0.125、0.25、0.5mMで、それぞれ球状1個当たり0.3、0.7、1.3μgの鉄分を取り込み、1細胞当たり1.3、3、3、6.7pgを意味することを明確に示している。
生体環境20と直接相互作用する表面被覆の重要性に注目が集められている。ここでは、生物医学の用途に一般的に使用されるクエン酸塩コーティングと、キレート機能の数が多いPAAコーティングの2つのコーティングが製造されています。幹細胞は、これら2種類のナノ粒子で標識され、次いで凝集した細胞球体となる細胞ペレットを形成するなどの遠心分離された(図3A)。これらのセルスフェロイドの磁性は、1日目および21日目のVSMを介して測定される(図3B および 図3C)。結果は、培養21日の培養時の磁性の低下を示し、ナノ粒子の生分解を示し、この分解は、PAAコーティングされたものよりもクエン酸被覆ナノ粒子(図3B)にとってより重要である(図3C)。TEM画像は、ナノ粒子の劣化を確認し、鉄を装填したフェリチンの典型的な、より小さい(サイズが6nm)薄い灰色の点の外観を示す。無傷のままのナノ粒子の中には、特にPAAコーティングで観察されるものもあります。
図1:酸化鉄(Fe3O4)ナノ粒子のマイクロ波支援合成、幹細胞におけるそれらの内在化およびスフェロイドとしての細胞の培養。(A)ナノ粒子合成の様々なステップの概略。まず、コアは、非水性ゾルゲル手順を介して合成される。コーティング分子は、クエン酸(Cit)またはポリアクリル酸(PAA)のいずれかであり、酸化鉄コアの表面に移植される。代表的なTEM画像は、クエン酸コーティングを有する合成ナノ粒子を示す。(B)幹細胞内のナノ粒子内在化の概略、内在化時に内在性に閉じ込められたナノ粒子を示す。代表的なTEM画像はまた、細胞内のクエン酸およびPAAコーティングされたナノ粒子を示し、子宮内に閉じ込められている。(C)幹細胞・スフェロイド形成の概略図この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:VSMを介したサンプル磁気モーメントの測定(A)水溶液中に分散したナノ粒子の10 μLをVSMを介して測定する。得られた信号は、磁場(B)の機能におけるこのナノ粒子溶液の磁気モーメントを表す。水と試料ホルダーの存在から来る反磁性は、カーブの第2の部分の傾きに対応し、ナノ粒子の磁気モーメントのみを得るなどの減算として測定することができる。飽和時の磁気モーメント(Ms)を決定することができます。(B) 同様に細胞回転楕円体の磁気モーメントが得られる。この場合、一定の期間に単一のセルスフェロイドが測定されます。(C)クエン酸被覆ナノ粒子で標識された細胞に対応するスフェロイドの曲線は、0.125 mM(オレンジ)、0.25mM(グレー)、0.5mM(青)の3つの独立した濃度で覆われた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:VSMを介したセルロにおける磁気ナノ粒子分解の定量化。(A)磁気ナノ粒子で細胞標識を行う際に、遠心分離(0日目)により細胞ペレットが形成される。その後、細胞は凝集構造を形成し、長期間(か月)細胞損失を伴わずに培養中に保つことができる細胞スフェロイドを扱いやすくする。(B, C)本明細書において、クエン酸(B)またはPAA(C)で被覆された2種類の磁気ナノ粒子は、幹細胞で内在化され、細胞は最大21日間スフェロイドとして培養される。1日培養したスフェロイドの磁性(オレンジカーブ)と21日間(灰色の曲線)をVSMで測定し、ナノ粒子の劣化を示す磁性の低下を伴う。21日目に撮影された代表的なTEM画像は、約6nmの薄い灰色の点が細胞の内の大きさであり、フェリチンの典型的な大きさおよび形状、鉄貯蔵タンパク質(黒矢印)を示す。一部のインタクトナノ粒子は、主にPAAコーティングされたナノ粒子(茶色の矢印)について観察することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
高速かつ効率的なマイクロ波ベースの合成を使用して、磁気ナノ粒子は、制御されたサイズで、容易に合成することができ、さらに与えられた分子でコーティングされています。重要なステップは、鉄塩とベンジルアルコールを真空下でストックし、小さな分散液を小さく保つことです。ベンジルアルコールは溶媒とリガンドの両方として作用すると同時に、追加のリガンドを必要とせずに直接較正されたベア酸化鉄を得ることができます。ナノ粒子が水中に移動した後、裸の磁性ナノ粒子は、多種多様なリガンドで容易にコーティングすることができる。このコーティングは、細胞内在化に影響を与えることができるナノ粒子間およびナノ粒子細胞相互作用特性を与え、生物医学的用途には最低限の内在化として厳しく制御する必要があるパラメータが必要であり、高い内在化は細胞に損傷を与え、細胞傷害事象31を引き起こす可能性がある。磁気測定は、セルロ内の磁気ナノ粒子の運命と同様に、この内在化を評価するための強力なツールです。幹細胞に磁気ナノ粒子を組み込む際に、単純遠心分離を経て、細胞の増殖を停止し、細胞外マトリックス産生を促進する培地で培養を行って、スフェロイドを形成することができる。細胞は非常に凝集し、組織の作成を開始します。スフェロイドは、その後、非常に扱いやすく、生物学的環境での磁気ナノ粒子の運命の長期的な追跡を可能にする長期間(月)培養することができます。細胞分裂を止めることによって、母細胞から娘細胞へのナノ粒子の希釈は存在しない。さらに、この細胞回転楕円体モデルでは、培養21、22、23の1ヶ月にわたって鉄のエスケープが存在することが確認されています。その結果、磁性値の低下はナノ粒子の劣化にしか対応せず、細胞から出て出る鉄には対応できない。
セルスフェロイドの磁性は、ここで高速かつ正確な定量を提供するVSMを介して測定されます。他の方法は、超伝導インタフェースデバイス(SQUID)を用いるなど、VSMの感度が10-7 emuのVSMよりも一般的に高精度であるようなセルラー磁気を測定するために検討されているが、運用コストは32である。実験用セットアップで2pg/cellに劣る磁気鉄線量の測定を可能にするVSMの感度は、2pg/cellに劣る鉄用量が、細胞誘導および組織工学の目的で磁気に向かう細胞誘引などの目的の用途には低すぎるため、本明細書では十分に正確である。VSMとSQUID磁気測定の両方は、細胞磁気の定量化を可能にすることに加えて、ナノ粒子の特徴に関する追加の詳細を与えることができる。得られた信号の解析により、ナノ粒子のサイズは22、23、またそれらの磁気特徴の一般的な概念が得られ得る、例えばナノ材料のヒステリシスおよび強制力が明らかにすることができる。磁石に引き付けられた個々の細胞の速度を測定する際に構成される磁気フォレス症や、単一の細胞の磁性が33,34に外挿されるなど、代替磁気測定法のアプローチも存在する。単一セルレベルの磁気はこのように得ることができます。ただし、追加のナノ粒子の特徴は特定できません。さらに、サンプル磁気に比例した信号を提供する小型磁気センサが、同様のセルスフェロイドモデルで最近使用されています。この磁気センサは、磁気ナノ粒子の生分解をリアルタイムで、連続的に、7日間35日にわたって追跡することを可能にした。しかし、この磁気センサの信号は、ナノ粒子の大きさに依存するので、磁気モーメントに直接変換することはできません。このため、各ナノ粒子設計に対してキャリブレーション曲線を実行する必要があるが、VSMを用いて実現できるカーブである。
ここで行うVSMで行われた測定は、磁気の減少によって示される、細胞環境における磁気ナノ粒子の進行性分解を示す。彼らはまた、異なる分子でコーティングされた同じコアがコーティングに応じて様々な速度で分解されることを証明する。PAAとクエン酸塩コーティングを比較すると、PAAは、おそらく磁気コア20への強いアンカーのために、劣化に対するコア保護の高さにつながります。細胞内環境における磁気ナノ粒子の運命は、細胞回転楕円体で評価される。ただし、この方法は、このメソッドに限定されません。実際に、ナノ粒子22の運命に対する幹細胞分化の効果を評価するために既に使用されている細胞懸濁液に外挿することができる。分化経路によっては、磁気ナノ粒子が細胞によって異なる方法で処理され、場合によっては、その溶解時に鉄の新結晶化が行われていることが明らかになった。VSM磁気測定は、ナノ粒子と細胞の両方の特徴が酸化鉄ナノオブジェクトの細胞内処理に及ぼす影響をさらに探求するのに有用なツールです。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作業は、欧州連合(EU)(ERC-2014-CoGプロジェクトMaTissE#648779によってサポートされました)。著者らは、パリ大学13のCNanoMat物理化学的特徴付けプラットフォームを認めたいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
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