Summary
As nanopartículas de óxido de ferro são sintetizadas através de um procedimento de gel sol não diatéico e revestidas com moléculas curtas aniônicas ou polímeros. O uso de magnetometria para monitorar a incorporação e biotransformações de nanopartículas magnéticas dentro de células-tronco humanas é demonstrado usando um magnetômetro de amostra vibração (VSM).
Abstract
As nanopartículas magnéticas, feitas de óxido de ferro, apresentam um interesse peculiar para uma ampla gama de aplicações biomédicas para as quais são frequentemente internalizadas nas células e depois deixadas dentro. Um desafio é avaliar seu destino no ambiente intracelular com metodologias confiáveis e precisas. Aqui, introduzimos o uso do magnetômetro de amostra vibração (VSM) para quantificar precisamente a integridade das nanopartículas magnéticas dentro das células medindo seu momento magnético. As células-tronco são rotuladas pela primeira vez com dois tipos de nanopartículas magnéticas; as nanopartículas têm o mesmo núcleo produzido através de uma síntese de gel sol não diagênea rápida e eficiente e diferem em seu revestimento: a molécula de ácido cítrico comumente usada é comparada ao ácido poliacrílico. A formação de esferoides de células 3D é então alcançada através da centrifugação e o momento magnético desses esferoides é medido em diferentes momentos com o VSM. O momento obtido é uma impressão digital direta da integridade das nanopartículas, com valores decrescentes indicativos de uma degradação de nanopartículas. Para ambas as nanopartículas, o momento magnético diminui ao longo do tempo cultural revelando sua biodegradação. Um efeito protetor do revestimento de ácido poliacrílico também é mostrado, quando comparado ao ácido cítrico.
Introduction
Há um aumento do interesse nas características magnéticas das nanopartículas de óxido de ferro para uma ampla gama de aplicações biomédicas. Sua resposta à ressonância magnética torna-os agentes de contraste confiáveis para ressonância magnética (RM), uma vantagem na medicina regenerativa onde células rotuladas com nanopartículas magnéticas podem ser rastreadas in vivo após a implantação1. Usando campos magnéticos, as células também podem ser guiadas à distância; dessa forma, os esferoides celulares2,3, anéis4ou folhas5 podem ser projetados magneticamente e também remotamente estimulados6, um ativo no desenvolvimento de tecidos livres de andaimes. A gama de possibilidades para essas nanopartículas também inclui sistemas de entrega de medicamentos7,8 e tratamento hipertérmico magnético e fotoinduzido para matar células cancerosas9,10,11. Para todas essas aplicações, as nanopartículas são integradas no ambiente biológico por injeção intravenosa ou por internalização direta nas células e são então deixadas dentro, o que coloca em questão seu destino intracelular.
As análises in vivo transmitiram uma compreensão geral do destino das nanopartículas no organismo: após a injeção na corrente sanguínea, elas são capturadas principalmente pelos macrófagos do fígado (células kupffer), baço e medula óssea, são progressivamente degradadas, e se juntam à piscina de ferro do organismo12,13,14,15,16,17,18,19. Observações qualitativas só são possíveis devido à circulação das nanopartículas em todo o organismo. Normalmente, a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) pode ser usada para observar diretamente as nanopartículas e a presença de ferro nos órgãos pode ser determinada através da dosagem. Mais recentemente, seu destino foi avaliado diretamente em uma piscina de células, ou seja, em circuito próximo sem fuga de ferro, permitindo uma medição quantitativa de suas biotransformações no nível celular20,21,22. Tais medidas são possíveis através da análise das propriedades magnéticas das nanopartículas que estão fortemente ligadas à sua integridade estrutural. A magnetometria da amostra vibratória (VSM) é uma técnica onde a amostra é vibrada periodicamente de modo que a medição da bobina do fluxo induzido fornece o momento magnético da amostra no campo magnético aplicado. Tal detecção síncron sua permite uma medição rápida, que é um trunfo para determinar os momentos magnéticos de um grande número de amostras20,21,22,23. A assinatura magnética macroscópica recuperada pela VSM dá então uma visão geral quantitativa de toda a amostra biológica diretamente correlacionada com o tamanho e estrutura das nanopartículas. Em particular, fornece o momento magnético na saturação (expresso em emu) das amostras, que é uma quantificação direta do número de nanopartículas magnéticas presentes na amostra, respectivamente para suas propriedades magnéticas específicas.
Foi demonstrado que o processamento intracelular de nanopartículas magnéticas está fortemente ligado às suas características estruturais20. Esses recursos podem ser controlados através de protocolos de síntese ideais. Cada protocolo apresenta vantagens e limitações. As nanopartículas de óxido de ferro são comumente sintetizadas em soluções aquosas por meio da coprecipitação dos íons de ferro24. Para superar as limitações da polidispersidade do tamanho das nanopartículas, outros métodos de síntese, como métodos de sol-gel mediados por poliol, foram desenvolvidos25. Abordagens não diatéacas por decomposição térmica leva à produção de nanopartículas de óxido de ferro muito bem calibradas26. No entanto, o uso de grandes quantidades de surfactantes como oleylamina ou ácido oleico complica sua funcionalização e transferência de água para aplicações biomédicas. Por essa razão, sintetizamos tais nanopartículas magnéticas através de uma rota de gel sol não diatéramos que leva à alta cristalina, pureza e reprodutibilidade27. Este protocolo produz nanopartículas de tamanho bem controlada que podem ser ajustadas através da variação de temperatura28. No entanto, a rota sol-gel não aquosa assistida por micro-ondas tem um limite de tamanho superior das nanopartículas obtidas de cerca de 12 nm. Este procedimento não seria adaptado para aplicações usando partículas ferromagnéticas à temperatura ambiente. Além da síntese do núcleo, outra característica principal a ser considerada é o revestimento. Deitado na superfície da nanopartícula, o revestimento age como uma molécula de ancoragem, ajudando a internalização direcionada das nanopartículas, ou pode proteger a nanopartícula da degradação. Uma vez que o álcool benzílico age como uma fonte de oxigênio e um ligante ao mesmo tempo, nanopartículas nuas são produzidas sem a necessidade de surfactantes adicionais ou ligantes. As nanopartículas são facilmente funcionalizadas após a síntese sem um processo de troca de surfactantes.
Nesse caso, são avaliados dois tipos de nanopartículas que possuem o mesmo núcleo e diferem no revestimento. O núcleo é sintetizado usando uma técnica baseada em micro-ondas rápida e altamente eficiente. Os dois revestimentos comparados consistem em ácido cítrico, um dos mais utilizados como agente de revestimento em aplicações biomédicas29,30e ácido poliacrílico (PAA), um revestimento polimérico com alto número de funções de quesquente. As medidas de magnetometria VSM são então usadas primeiro para quantificar a absorção de nanopartículas pelas células e, em seguida, como uma avaliação direta da integridade estrutural da nanopartícula após a internalização em células-tronco. Os resultados demonstram que a concentração de incubação impacta a absorção de nanopartículas e que o revestimento influencia sua degradação, com o grande número de moléculas de ancoragem de PAA protegendo o núcleo da degradação.
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Protocol
1. Síntese de nanopartículas magnéticas
- Síntese do núcleo – assistida por micro-ondas
- Dissolver 400 mg de acetilado de ferro (>99,9%) em 10 mL de álcool benzílico (BA, 99,8%) dentro de um frasco de vidro monowave de 30 mL.
- Aumente a temperatura da suspensão de 25 a 250 °C em 20 minutos (a uma taxa de 11,25 °C/min) e mantenha-a em 250 °C por 30 min usando um reator de micro-ondas.
- Transfira as nanopartículas resultantes suspensas em álcool benzílico para um frasco de vidro e separe as nanopartículas usando um ímã de neodímio por 30 minutos.
- Lave o precipitado no frasco de vidro anterior de 100 mL com 10 mL de diclorometano, hidróxido de sódio de 1 M, etanol, pH 7 água (três vezes) usando um ímã de neodímio por 5 min cada passo para pelotizar nanopartículas e remover o supernatante.
- Ajuste a suspensão da nanopartícula em água para pH 2 usando ácido clorídrico de 1 M e, em seguida, centrífuga em filtros ultracentrifugal de 100 kDa a 2.200 x g por 10 min.
- Remova o filtrado, adicione 12 mL de ácido clorídrico de10 a 2 M à solução de nanopartículas e centrífuga em filtros ultracentrifugal de 100 kDa a 2.200 x g por 10 minutos (três vezes). Em seguida, diluir a solução de nanopartículas dentro de 10 mL de 10-2 M de ácido clorídrico antes de revestir.
- Revestimento
- Diluir 175 mg de ácido cítrico e ácido poliacrílico na água em pH 2 em um frasco de vidro de 100 mL e ajustar o pH para 2 com uma solução de ácido clorídrico de 1 M.
- Adicione as nanopartículas de 10 mL dispersão aquosa à solução de molécula de revestimento, correspondendo a uma razão de massa de 5 entre a molécula de revestimento e as nanopartículas. Agitar por 2 h sob agitação magnética à temperatura ambiente.
- Após a reação, ajuste o pH para 7 com hidróxido de sódio de 1 M.
- Centrifugar a solução de nanopartículas 3 vezes com água deionizada (DI) em filtros ultracentrifugal de 100 kDa a 2.200 x g por 10 min; remover o filtrado e diluir a solução de nanopartículas em 12 mL de água DI.
2. Cultura e rotulagem magnética de células-tronco
- Cultura células-tronco mesenquimais humanas (MSC) em meio de crescimento completo de células-tronco mesenquimais (MSCGM) a 37 °C e 5% DE CO2. Quando as células estiverem com 90% de confluência, adicione 10 mL de trypsin-EDTA pré-aquecido a 37°C por frasco de 150 cm² e deixe por 2-3 minutos para desacoplar as células.
- Para saber quando as células são separadas, observe-as com um microscópio de campo brilhante. Resuspenque as células separadas no MSCGM e divida-as em quatro frascos de 150 cm². Amplie as células desta forma até a passagem 4 a 5.
- Prepare a solução de nanopartículas magnéticas para rotulagem celular: disperse a concentração escolhida de nanopartículas de óxido de ferro no meio do Instituto Memorial roswell park livre de soro (RMPI-1640) sem glutamina. O RPMI é usado para incubação de nanopartículas (e as etapas de lavagem relacionadas), pois tem uma resistência iônica menor do que o DMEM e melhor evita eventos de agregação de nanopartículas.
- Quando as células estiverem na passagem 4 ou 5 e 90% confluentes, remova o meio MSCGM, enxague as células com RPMI livre de soro (sem glutamina) e adicione 10 mL de solução de nanopartículas de óxido de ferro por frasco de cultura de 150 cm2, que é o volume mínimo necessário para cobrir todas as células.
- Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 30 min e depois descartar a solução de nanopartículas. Lave uma vez com RPMI-1640 livre de soro (sem glutamina) e incubar com o Médio Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (25 mL por frasco de 150 cm2) durante a noite a 37 °C e 5% de CO2 para permitir uma internalização completa das nanopartículas.
3. Formação de células-tronco-esferóides
- Prepare-se recentemente o meio de cultura celular-esferóide composto de DMEM alta glicose com L-glutamina suplementada com ácido L-ascórbico 2-fosfato, 0,1 μM dexametasona, 1 mM piruvato de sódio, 0,35 mM L-proline e 1% suplemento de cultura universal contendo insulina, transferrina humana e ácido selenous (ITS-Premix).
- Retire os MSCs magnéticos adicionando 10 mL de 0,05% trypsin-EDTA pré-aquecido a 37 °C por 150 cm2 frasco por 2-3 minutos. Quando as células forem separadas, inative imediatamente a trippsina adicionando 1/3 do volume de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina pré-aquecida a 37 °C.
- Centrifugar as células dissociadas a 260 x g por 5 min, aspirar a mídia e suspender as células em um pequeno volume (menos de 1 mL por frasco de 150 cm²) de meio de cultura esferoide celular, como ter 200.000 células em cerca de 50 μL de meio. Conte o número da célula usando um hemócito e ajuste o volume se necessário.
- Adicione 1 mL de cultura esféide celular recém-preparada em um tubo de centrífuga cônica estéril de 15 mL e adicione o volume de solução resuspended correspondente a 200.000 células.
- Centrifugar essas células magneticamente rotuladas a 180 x g por 3 min, como formar uma pelota celular na parte inferior do tubo e manter o supernasce, que é o meio de cultura celular.
- Abra ligeiramente os tubos para permitir a troca de ar e incubar a 37 °C com 5% de CO2 por até 21 dias, tempo de cultura ao longo do qual as células formam uma estrutura 3D coesa que resulta em um esferoide totalmente formado. Troque o meio duas vezes por semana.
- Em determinados dias, lave os esferoides duas vezes com tampão de cacodilato feito de 0,2 M de cacodilato diluído em água desmineralizada e fixe-os usando 2% glutaraldeído em 0,1 M tampão de cacodilato diluído em água destilada por 30 min à temperatura ambiente. Armazene os esferoides fixos em PBS até ser usado para medição VSM ou imagem TEM. Essa etapa de fixação interrompe todos os processos biológicos e permite a conservação a longo prazo.
4. Quantificação de nanopartículas magnéticas na solução e em celulose usando um magnetômetro de amostra vibratória (VSM)
- Coloque um determinado volume de solução de nanopartícula magnética (máximo de 10 μL) ou um único esferoide celular no suporte de amostra especificamente projetado para caber no VSM.
- Insira a amostra no VSM e escaneie para deslocamento da amostra. Coloque a amostra na posição correspondente ao máximo de magnetização.
- Realize a primeira medição em um campo magnético baixo (entre -1500 Oe e +1500 Oe) com uma taxa de 20 Oe/s.
- Realize uma segunda medição em um campo magnético alto (entre -30 000 Oe e +30 000 Oe) com uma taxa de 200 Oe/s.
5. Análise de Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
- Para as soluções de nanopartículas, deposite 10 μL da solução aquosa em uma rede de cobre revestida de carbono e deixe-a secar à temperatura ambiente.
- Para as nanopartículas internalizadas nas células, contraste os esferoides de células fixas com Extrato de Chá Oolong (OTE) a 0,5% diluídos em tampão de cacodilato de 0,1 M, pós-correção com 1% de tetroxida de ósmio contendo 1,5% de cianoferato de potássio e depois desidratado em banhos de etanol de grau, incluído em Epon. Corte ultras seções de 70 nm e deposite-as em grades de cooper.
- Faça imagens usando um microscópio eletrônico a 80 kV com uma ampliação de 1k para a observação de células inteiras a 40k para a observação de compartimentos endossomais.
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Representative Results
Utilizando a síntese assistida por micro-ondas, nanopartículas magnéticas com um monodisperse 8,8 ± tamanho do núcleo de 2,5 nm são produzidas e revestidas com citrato ou PAA(Figura 1A). As células-tronco são então incubadas com essas nanopartículas dispersas em meio de cultura em uma determinada concentração por 30 minutos, resultando em sua endocitose e confinamento dentro dos endosários celulares(Figura 1B). As células-tronco magnéticas são então suspensas em média, centrífugas, e a pelota celular formada é cultivada por até 21 dias(Figura 1C). Os esferoides obtidos são fixos, como a parada de processos biológicos, e mantidos na PBS até serem medidos via VSM.
Primeiro, o momento magnético da solução de nanopartículas é medido usando o VSM: 10 μL da dispersão aquosa nanopartícula contendo 7 μg de ferro é medido, e a curva obtida é exibida na Figura 2A. Devido à presença de água nesta solução, e ao suporte da amostra, um sinal diamagnético é capturado, além do sinal superparamagnetic das nanopartículas. Uma constante diamagnética (Mdia) correspondente à inclinação da segunda parte da curva pode ser medida, como mostrado na Figura 2A, e essa constante pode ser subtraída, como a obtenção do momento magnético apenas das nanopartículas(amostra M = M - Mdia). A magnetização da saturação das nanopartículas (Ms)pode então ser extraída; corresponde a 518 μemu para a dispersão aquosa, o que significa que a solução está em 74 emu/g de ferro (Fe) correspondente a 52 emu/g de nanopartículas (Fe3O4).
O momento magnético dos esferoides celulares pode ser obtido da mesma forma. Neste caso, um esferoide celular (feito de 200.000 células) é inserido no suporte da amostra, colocado no VSM, e medido(Figura 2B). Os valores de momento magnético obtidos estão aqui muito inferiores aos da solução inicial de nanopartículas; no entanto, eles permanecem dentro do intervalo de detecção. A magnetização da saturação desta amostra em particular é de 69 μemu. Além disso, este esferoide contém 1,3 μg de nanopartículas (6,7 pg de nanopartículas por célula), consistente com o valor de saturação em 52 emu/gFe3O4. Esse valor pode, assim, ser usado para determinar a quantidade de nanopartículas em amostras celulares. Na Figura 2C,esferoides correspondentes a células rotuladas com três concentrações de nanopartículas revestidas de citrato são medidas um dia após a rotulagem. Os resultados mostram claramente que a absorção das nanopartículas depende da concentração de incubação, com concentrações de 0,125, 0,25 e 0,5 mM levando a captações de 0,3, 0,7 e 1,3 μg de ferro perpheroid, o que significa 1,3, 3,3 e 6,7 pg de ferro por célula, respectivamente.
Chamou a atenção a importância do revestimento superficial, que interage diretamente com o ambiente biológico20. Foram produzidos dois revestimentos: um revestimento citrato, comumente usado para aplicações biomédicas, e um revestimento PAA, com maior número de funções de quesquente. As células-tronco são rotuladas com esses dois tipos de nanopartículas e centrífugas, como a formação de uma pelota celular que então se torna um esferoide de células coesa(Figura 3A). O magnetismo desses esferoides celulares é medido via VSM no dia 1 e dia 21 (Figura 3B e Figura 3C). Os resultados demonstram uma diminuição do magnetismo nos 21 dias de cultura, indicando a biodegradação das nanopartículas, sendo essa degradação mais importante para as nanopartículas revestidas de citrato(Figura 3B)do que as revestidas de PAA(Figura 3C). As imagens TEM confirmam a degradação das nanopartículas e mostram o aparecimento de pontos cinzentos claros menores (6 nm em tamanho), típicos da ferritina carregada com ferro. Algumas nanopartículas permanecem intactas também podem ser observadas, particularmente com o revestimento paa.
Figura 1: Síntese assistida por micro-ondas de nanopartículas de óxido de ferro (Fe3O4), sua internalização em células-tronco e a cultura subsequente das células como esferoides. (A) Esquema dos vários passos da síntese de nanopartículas. Primeiro, o núcleo é sintetizado através de um procedimento de gel sol não aquoso. A molécula de revestimento, citrato (Cit) ou ácido poliacrílico (PAA), é então enxertado na superfície do núcleo de óxido de ferro. Uma imagem tem representativa mostra as nanopartículas sintetizadas com um revestimento citrato. (B) Esquema da internalização das nanopartículas dentro das células-tronco, mostrando as nanopartículas confinadas nos endósmosos após a internalização. As imagens representativas do TEM também mostram as nanopartículas revestidas de citrato e PAA dentro das células, confinadas nos endossários. (C) Esquema de formação de células-tronco-esferóides. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Medição do momento magnético das amostras via VSM. (A) 10 μL de nanopartículas dispersas em uma solução aquosa são medidas através do VSM. O sinal obtido representa o momento magnético desta solução de nanopartículas em função do campo magnético (B). O diamagnetismo proveniente da presença de água e do porta-amostras pode então ser medido, pois corresponde à inclinação da segunda parte da curva e subtraído, como a obtenção do momento magnético apenas das nanopartículas. O momento magnético na saturação (Ms)pode então ser determinado. (B) O momento magnético dos esferoides celulares pode ser obtido da mesma forma; Neste caso, um único esferoide celular é medido em um determinado período de tempo. (C) Curvas de esferoides correspondentes a células rotuladas com nanopartículas revestidas de citrato em três concentrações independentes de 0,125 mM (laranja), 0,25 mM (cinza) e 0,5 mM (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação da degradação da nanopartícula magnética no celulose via VSM. (A) Após a rotulagem celular com nanopartículas magnéticas, uma pelota celular é formada por centrifugação (dia 0). As células então formam uma estrutura coesa resultando em um fácil manuseio de esferoide celular que pode ser mantido na cultura sem perda celular por longos períodos de tempo (meses). (B, C) Nela, dois tipos de nanopartículas magnéticas, revestidas com citrato(B) ou PAA(C),são internalizadas em células-tronco e as células são cultivadas como esferoides por até 21 dias. Magnetismo de esferoides cultivados por 1 dia (curvas laranja) e 21 dias (curvas cinzentas) são medidos com o VSM, com uma diminuição no magnetismo indicando uma degradação das nanopartículas. Imagens representativas do TEM tiradas no dia 21 mostram pontos cinzentos claros de cerca de 6 nm é tamanho dentro dos endosmos e o citoplasma das células, tamanho típico e forma de ferritina, a proteína de armazenamento de ferro (setas pretas). Algumas nanopartículas intactas também podem ser observadas, principalmente para as nanopartículas revestidas de PAA (seta marrom). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Usando uma síntese rápida e eficiente baseada em micro-ondas, as nanopartículas magnéticas podem ser facilmente sintetizadas, com tamanho controlado e ainda revestidas com moléculas dadas. Um passo crítico é estocar o sal de ferro e o álcool benzílico sob vácuo para manter uma pequena dispersão de tamanho. O álcool benzílico atua tanto como solvente quanto ligante ao mesmo tempo permitindo obter diretamente óxido de ferro descalço sem a necessidade de ligantes adicionais. Após a transferência de nanopartículas na água, as nanopartículas magnéticas nuas podem ser facilmente revestidas com uma grande variedade de ligantes. Este revestimento confere propriedades inter-nanopartículas e nanopartículas que podem influenciar sua internalização celular, um parâmetro que precisa ser rigorosamente controlado, pois uma internalização mínima é necessária para aplicações biomédicas, enquanto uma internalização muito alta pode ser prejudicial às células e eventos citotóxicos potencialmente originários31. A magnetometria é uma ferramenta poderosa para avaliar essa internalização, bem como o destino das nanopartículas magnéticas no celulose. Após a incorporação de nanopartículas magnéticas em células-tronco, os spheroids podem ser formados através de uma simples centrifugação seguida pela cultura em um meio que impede a proliferação das células e impulsiona a produção de matrizes extracelulares. As células se tornam altamente coesas e começam a criar um tecido. Os esferoides são então muito fáceis de manusear e podem ser cultivados por longos períodos de tempo (meses) que permite o rastreamento a longo prazo do destino das nanopartículas magnéticas em um ambiente biológico. Ao parar a divisão celular, não há diluição das nanopartículas de célula mãe para filha; além disso, verificou-se que, com este modelo de esferoide celular, não há fuga de ferro ao longo de um mês de cultura21,22,23. Como consequência, a diminuição dos valores do magnetismo só pode corresponder a uma degradação das nanopartículas e não ao ferro sendo exportado para fora das células.
O magnetismo dos esferoides celulares é aqui medido via VSM que fornece uma quantificação rápida e precisa. Outros métodos também foram explorados para medir o magnetismo celular, como o uso de um Dispositivo de Interface Supercondutor (SQUID), uma máquina tipicamente mais precisa que o VSM com uma sensibilidade em torno de 10-7 emu em comparação com 10-6 emu para o VSM, mas o custo operacional é maior32. A sensibilidade do VSM que permite medições de dose de ferro magnético inferior a 2 pg/célula na configuração experimental é aqui suficientemente precisa, pois as doses de ferro inferiores a 2 pg/célula seriam muito baixas para as aplicações visadas, como a atração celular em direção a um magnético para fins de orientação celular e engenharia de tecidos. Tanto a magnetometria VSM quanto a SQUID, além de permitir uma quantificação do magnetismo celular, podem dar detalhes adicionais sobre as características das nanopartículas. Pela análise do sinal obtido, o tamanho das nanopartículas pode ser deduzido22,23 e também a noção geral de suas características magnéticas pode ser obtida, a histerese e a coertividade de nanomateriais podem, por exemplo, ser reveladas. Também existem abordagens alternativas de magnetometria, como a magnetoforese que consiste em medir a velocidade das células individuais quando atraídas para um ímã e o magnetismo de células únicas é extrapolado33,34. O magnetismo no nível de célula única pode ser obtido dessa forma; no entanto, nenhuma característica adicional de nanopartículas pode ser determinada. Além disso, um pequeno sensor magnético que fornece um sinal proporcional ao magnetismo da amostra foi recentemente usado com um modelo esferoide celular semelhante. Este sensor magnético permitiu o rastreamento da biodegradação das nanopartículas magnéticas em tempo real, continuamente, ao longo de 7 dias35. No entanto, o sinal deste sensor magnético não pode ser traduzido diretamente em um momento magnético, pois depende do tamanho das nanopartículas. Por essa razão, uma curva de calibração precisa ser realizada para cada desenho de nanopartículas, curva que pode ser realizada usando o VSM.
As medições aqui realizadas com o VSM demonstram uma degradação progressiva das nanopartículas magnéticas no ambiente celular, indicadas por uma diminuição do magnetismo. Eles também evidenciam que um mesmo núcleo revestido com moléculas diferentes é degradado a taxas variadas, dependendo do revestimento. Ao comparar um PAA e um revestimento citrato, o PAA leva a uma maior proteção do núcleo à degradação, provavelmente devido à sua forte ancoragem ao núcleo magnético20. O destino das nanopartículas magnéticas no ambiente intracelular é avaliado em esferoides celulares; no entanto, o método não se limita a ele. De fato, pode ser extrapolado para suspensões celulares, que já foram utilizadas para avaliar o efeito da diferenciação de células-tronco sobre o destino das nanopartículas22. Revelou que, dependendo da via de diferenciação, as nanopartículas magnéticas são processadas de forma diferente pelas células, com, em alguns casos, a neo-cristalização do ferro sobre sua dissolução. A magnetometria VSM é, portanto, uma ferramenta útil para explorar ainda mais a influência das características nanopartículas e celulares no processamento intracelular de nanoí objetos de óxido de ferro.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela União Europeia (projeto ERC-2014-CoG MaTissE #648779). Os autores gostariam de reconhecer a plataforma de caracterizações físico-químicas CNanoMat da Universidade Paris 13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
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