Summary
IJzeroxide nanodeeltjes worden gesynthetiseerd via een nonaqueous sol gel procedure en bedekt met anionische korte moleculen of polymeer. Het gebruik van magnetometrie voor het monitoren van de integratie en biotransformaties van magnetische nanodeeltjes in menselijke stamcellen wordt aangetoond met behulp van een trillende monstermagnetometer (VSM).
Abstract
Magnetische nanodeeltjes, gemaakt van ijzeroxide, vormen een eigenaardige interesse voor een breed scala aan biomedische toepassingen waarvoor ze vaak in cellen worden geïnternaliseerd en vervolgens binnen worden gelaten. Een uitdaging is om hun lot in de intracellulaire omgeving te beoordelen met betrouwbare en nauwkeurige methodologieën. Hierin introduceren we het gebruik van de vibrerende monstermagnetometer (VSM) om de integriteit van magnetische nanodeeltjes in cellen nauwkeurig te kwantificeren door hun magnetische moment te meten. Stamcellen worden eerst geëtiketteerd met twee soorten magnetische nanodeeltjes; de nanodeeltjes hebben dezelfde kern geproduceerd via een snelle en efficiënte nonaqueous sol gel synthese in de magnetron en verschillen in hun coating: het veelgebruikte citroenzuurmolecuul wordt vergeleken met polyacrylzuur. De vorming van 3D-cel-sferoïden wordt vervolgens bereikt via centrifugatie en het magnetische moment van deze sferoïden wordt op verschillende tijdstippen gemeten met de VSM. Het verkregen moment is een directe vingerafdruk van de integriteit van de nanodeeltjes, met afnemende waarden die wijzen op een afbraak van nanodeeltjes. Voor beide nanodeeltjes neemt het magnetische moment in de loop van de cultuurtijd af en onthult hun biologische afbraak. Een beschermend effect van de polyacrylzuurcoating wordt ook getoond, in vergelijking met citroenzuur.
Introduction
Er is een toegenomen interesse in de magnetische kenmerken van ijzeroxide nanodeeltjes voor een breed scala aan biomedische toepassingen. Hun reactie op magnetische resonantie maakt ze betrouwbare contrastmiddelen voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI), een voordeel in de regeneratieve geneeskunde waar cellen met het label magnetische nanodeeltjes kunnen worden gevolgd in vivo na implantatie1. Met behulp van magnetische velden kunnen cellen ook op afstand worden geleid; op deze manier kunnen cellulaire sferoïden2,3,ringen 4ofvellen 5 magnetisch worden ontworpen en ook op afstand worden gestimuleerd6, een aanwinst in de ontwikkeling van steigervrije weefsels. Het scala aan mogelijkheden voor deze nanodeeltjes omvat ook toedieningssystemen voor geneesmiddelen7,8 en magnetische en foto-geïnduceerde hyperthermische behandeling om kankercellen te doden9,10,11. Voor al deze toepassingen worden de nanodeeltjes geïntegreerd in de biologische omgeving, hetzij door intraveneuze injectie, hetzij door directe internalisatie in cellen en worden ze vervolgens binnengelaten, wat hun intracellulaire lot in twijfel brengt.
In vivo analyses brachten een algemeen begrip van het lot van de nanodeeltjes in het organisme over: bij injectie in de bloedstroom worden ze voor het eerst meestal gevangen door de macrofagen van de lever (Kupffer-cellen), milt en beenmerg, geleidelijk afgebroken en sluiten ze zich aan bij de ijzeren pool van het organisme12,13,14,15,16,17,18,19. Kwalitatieve waarnemingen zijn alleen mogelijk vanwege de circulatie van de nanodeeltjes in het hele organisme. Meestal kan transmissie elektronische microscopie (TEM) worden gebruikt om de nanodeeltjes direct te observeren en kan de aanwezigheid van ijzer in de organen worden bepaald via de dosering. Meer recentelijk is hun lot rechtstreeks beoordeeld op een pool van cellen, wat betekent dat ze in een nauw circuit zonder ijzeren ontsnapping, waardoor een kwantitatieve meting van hun biotransformaties op celniveau20,21,22mogelijk is . Dergelijke metingen zijn mogelijk door de analyse van de magnetische eigenschappen van de nanodeeltjes die nauw verbonden zijn met hun structurele integriteit. Vibrerende monstermagnetometrie (VSM) is een techniek waarbij het monster periodiek wordt getrild, zodat de spoelmeting van de geïnduceerde flux het magnetische moment van het monster op het toegepaste magnetische veld biedt. Een dergelijke synchrone detectie maakt een snelle meting mogelijk , wat een aanwinst is voor het bepalen van de magnetische momenten van een groot aantal monsters20,21,22,23. De macroscopische magnetische signatuur die door VSM wordt opgehaald, geeft vervolgens een kwantitatief overzicht van het volledige biologische monster dat rechtstreeks is gecorreleerd met de grootte en structuur van de nanodeeltjes. Het biedt met name het magnetische moment bij verzadiging (uitgedrukt in emu) van de monsters, wat een directe kwantificering is van het aantal magnetische nanodeeltjes dat in het monster aanwezig is, respectievelijk aan hun specifieke magnetische eigenschappen.
Het is aangetoond dat de intracellulaire verwerking van magnetische nanodeeltjes nauw verbonden is met hun structurele kenmerken20. Deze functies kunnen worden bestuurd via optimale syntheseprotocollen. Elk protocol biedt voordelen en beperkingen. IJzeroxide nanodeeltjes worden gewoonlijk gesynthetiseerd in waterige oplossingen via coprecipatie van ijzerionen24. Om de beperkingen van polydispersiteit van nanodeeltjesgrootte te overwinnen, zijn andere synthesemethoden ontwikkeld, zoals polyolgemedieerde sol-gel-methoden25. Nonaqueous benaderingen door thermische ontbinding leidt tot de productie van zeer goed gekalibreerde ijzeroxide nanodeeltjes26. Het gebruik van enorme hoeveelheden oppervlakteactieve stoffen zoals oleylamine of oliezuur bemoeilijkt echter hun functionalisatie en wateroverdracht voor biomedische toepassingen. Om deze reden synthetiseren we dergelijke magnetische nanodeeltjes via een nonaqueous sol gel-route die leidt tot een hoge kristalliniteit, zuiverheid en reproduceerbaarheid27. Dit protocol produceert goed gecontroleerde grootte nanodeeltjes die kunnen worden afgestemd door middel van temperatuurvariatie28. Niettemin heeft de niet-waterige sol-gelroute in de magnetron een bovengrens van de verkregen nanodeeltjes van ongeveer 12 nm. Deze procedure zou niet worden aangepast voor toepassingen met ferromagnetische deeltjes bij kamertemperatuur. Naast de kernsynthese is een ander belangrijk kenmerk dat in overweging moet worden genomen de coating. Liggend aan het oppervlak van het nanodeeltje fungeert de coating als een verankeringsmolecuul, dat de gerichte internalisatie van de nanodeeltjes helpt, of het kan het nanodeeltje beschermen tegen afbraak. Omdat benzylalcohol tegelijkertijd als zuurstofbron en ligand fungeert, worden kale nanodeeltjes geproduceerd zonder dat er extra oppervlakteactieve stoffen of liganden nodig zijn. De nanodeeltjes worden dan gemakkelijk gefunctionaliseerd na synthese zonder een oppervlakteactieve uitwisselingsproces.
Hierin worden twee soorten nanodeeltjes beoordeeld die dezelfde kern bezitten en verschillen in de coating. De kern wordt gesynthetiseerd met behulp van een snelle en zeer efficiënte techniek op basis van de magnetron. De twee vergeleken coatings bestaan uit citroenzuur, een van de meest gebruikte als coatingmiddel in biomedische toepassingen29,30, en polyacrylzuur (PAA), een polymere coating met een groot aantal chelaatfuncties. VSM-magnetometriemetingen worden vervolgens eerst gebruikt om de opname van nanodeeltjes door de cellen te kwantificeren en vervolgens als een directe beoordeling van de structurele integriteit van het nanodeeltje bij internalisatie in stamcellen. De resultaten tonen aan dat de incubatieconcentratie van invloed is op de opname van nanodeeltjes en dat de coating hun afbraak beïnvloedt, waarbij het grote aantal verankeringsmoleculen van PAA de kern beschermt tegen afbraak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese van magnetische nanodeeltjes
- Kernsynthese – microgolfondersteund
- Los 400 mg ijzer(III) acetylacetonate op (>99,9%) in 10 ml benzylalcohol (BA, 99,8%) binnen een monogolfglasflacon van 30 ml.
- Verhoog de temperatuur van de suspensie van 25 tot 250 °C in 20 min (met een snelheid van 11,25 °C/min) en houd deze gedurende 30 minuten op 250 °C met behulp van een microgolfreactor.
- Breng de resulterende nanodeeltjes opgehangen in benzylalcohol over in een glazen flacon en scheid de nanodeeltjes gedurende 30 minuten met behulp van een neodymiummagneet.
- Was het neerslag in de vorige glazen flacon van 100 ml met 10 ml dichloormethaan, 1 M natriumhydroxide, ethanol, pH 7-water (drie keer) met behulp van een neodymiummagneet gedurende 5 minuten elke stap om nanodeeltjes te pelletiseren en het supernatant te verwijderen.
- Stel de nanodeeltjessuspensie in water in op pH 2 met 1 M zoutzuur en centrifugeer vervolgens in 100 kDa ultracentrifugaalfilters op 2.200 x g gedurende 10 minuten.
- Verwijder het filtraat, voeg 12 ml zoutzuur van10 -2 M toe aan de nanodeeltjesoplossing en centrifugeer in 100 kDa ultracentrifugaalfilters bij 2.200 x g gedurende 10 minuten (drie keer). Verdun vervolgens de nanodeeltjesoplossing binnen 10 ml zoutzuur van 10-2 M voordat u het coat.
- Coating
- Verdun 175 mg citroenzuur en polyacrylzuur in water bij pH 2 in een glazen flacon van 100 ml en verstel de pH op 2 met een zoutzuuroplossing van 1 M.
- Voeg de 10 ml nanodeeltjes waterige dispersie toe aan de coatingmolecuuloplossing, overeenkomend met een massaverhouding van 5 tussen het coatingmolecuul en de nanodeeltjes. Roer gedurende 2 uur onder magnetisch roeren bij kamertemperatuur.
- Stel na de reactie de pH in op 7 met 1 M natriumhydroxide.
- Centrifugeer de nanodeeltjesoplossing 3 keer met gedeïensioniseerd (DI) water in 100 kDa ultracentrifugaalfilters bij 2.200 x g gedurende 10 minuten; verwijder het filtraat en verdun de nanodeeltjesoplossing in 12 ml DI-water.
2. Cultuur en magnetische etikettering van stamcellen
- Kweek menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) in compleet Mesenchymaal Stamcel GroeiMedium (MSCGM) bij 37 °C en 5% CO2. Wanneer de cellen op 90% samenvloeiing staan, voeg dan 10 ml trypsine-EDTA toe die voorverwarmd is bij 37 °C per 150 cm² kolf en laat 2-3 minuten staan om de cellen los te maken.
- Om te weten wanneer de cellen zijn losgemaakt, observeer ze met een helderveldmicroscoop. Resuspendeer de losgemaakte cellen in MSCGM en verdeel ze in vier kolven van 150 cm². Versterk de cellen op deze manier tot passage 4 tot 5.
- Bereid de oplossing van magnetische nanodeeltjes voor celetikettering: verspreid de gekozen concentratie ijzeroxide nanodeeltjes in serumvrij Roswell Park Memorial Institute medium (RMPI-1640) zonder glutamine. RPMI wordt gebruikt voor nanodeeltjes incubatie (en de bijbehorende spoelstappen) omdat het een lagere ionische sterkte heeft dan DMEM en beter voorkomt dat nanodeeltjes aggregatie gebeurtenissen.
- Wanneer de cellen zich op passage 4 of 5 en 90% samenvloeien, verwijdert u het MSCGM-medium, spoelt u de cellen af met serumvrije RPMI (zonder glutamine) en voegt u 10 ml ijzeroxide nanodeeltjesoplossing toe per 150 cm2 kweekkolf, wat het minimale volume is dat nodig is om alle cellen te bedekken.
- Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 minuten en gooi vervolgens de nanodeeltjesoplossing weg. Was eenmaal met serumvrije RPMI-1640 (geen glutamine) en incubeer met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (25 ml per 150 cm2 kolf) 's nachts bij 37 °C en 5% CO2 om een volledige internalisatie van de nanodeeltjes mogelijk te maken.
3. Vorming van stamcel-sferoïden
- Vers bereid cel-sferoïde kweekmedium bestaande uit DMEM hoge glucose met L-glutamine aangevuld met 50 μM L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 0,1 μM dexamethason, 1 mM natriumpyruvaat, 0,35 mM L-proline en 1% universeel kweeksupplement met insuline, humaan transferrine en seleneuszuur (ITS-Premix).
- Maak de magnetische MSC's los door 10 ml van 0,05% trypsine-EDTA voorverwarmd op 37 °C per 150 cm2 kolf gedurende 2-3 minuten toe te voegen. Wanneer de cellen worden losgemaakt, onmiddellijk de trypsine inactiveren door 1/3 van het volume DMEM toe te voegen aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine voorverwarmd bij 37 °C.
- Centrifugeer de gescheiden cellen gedurende 5 minuten op 260 x g, aspireer het medium en schort de cellen opnieuw op in een klein volume (minder dan 1 ml per 150 cm² kolf) cel-sferoïde kweekmedium, zoals 200.000 cellen in ongeveer 50 μL medium. Tel het celnummer met behulp van een hemocytometer en pas indien nodig het volume aan.
- Voeg 1 ml vers bereid cel-sferoïde kweekmedium toe in een steriele conische centrifugebuis van 15 ml en voeg het volume geresuspendeerde oplossing toe dat overeenkomt met 200.000 cellen.
- Centrifugeer deze magnetisch gelabelde cellen gedurende 3 minuten op 180 x g, zoals het vormen van een celpellet aan de onderkant van de buis en het houden van het supernatant, het celkweekmedium.
- Open de buizen lichtjes om luchtuitwisseling mogelijk te maken en te incuberen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende maximaal 21 dagen, kweektijd waarlangs de cellen een samenhangende 3D-structuur vormen die resulteert in een volledig gevormde sferoïde. Verander het medium twee keer per week.
- Was de sferoïden op bepaalde dagen tweemaal met cacodylaatbuffer gemaakt van 0,2 M cacodylaat verdund in gedemineraliseerd water en bevestig ze met 2% glutaraldehyde in 0,1 M cacodylaatbuffer verdund in gedestilleerd water gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar de vaste sferoïden in PBS totdat ze worden gebruikt voor VSM-meting of TEM-beeldvorming. Deze fixatiestap stopt alle biologische processen en maakt behoud op lange termijn mogelijk.
4. Kwantificering van magnetische nanodeeltjes in oplossing en in cellulose met behulp van een trilmonstermagnetometer (VSM)
- Plaats een bepaald volume magnetische nanodeeltjesoplossing (maximaal 10 μL) of een enkelcellige sferoïde in de monsterhouder die speciaal is ontworpen om in de VSM te passen.
- Voeg het monster in de VSM in en scan op monsterverschuiving. Plaats het monster op de positie die overeenkomt met het magnetiseringsmaximum.
- Voer de eerste meting uit bij een laag magnetisch veld (tussen -1500 Oe en +1500 Oe) met een snelheid van 20 Oe/s.
- Voer een tweede meting uit bij een hoog magnetisch veld (tussen -30 000 Oe en +30 000 Oe) met een snelheid van 200 Oe/s.
5. Transmission Electron Microscopy (TEM) analyse
- Voor de nanodeeltjesoplossingen deponeer 10 μL van de waterige oplossing op een met koolstof bedekt koperen rooster en laat het drogen bij kamertemperatuur.
- Voor de nanodeeltjes geïnternaliseerd in cellen, contrasteren de vaste cel-sferoïden met Oolong Tea Extract (OTE) op 0,5% verdund in 0,1 M cacodylaatbuffer, postfix met 1% osmiumtetroxide met 1,5% kaliumcyanoferraat en drogen vervolgens uit in gesorteerde ethanolbaden, opgenomen in Epon. Snijd ultrasecties van 70 nm en deponeer ze op cooperrasters.
- Maak foto's met behulp van een elektronenmicroscoop op 80 kV met een vergroting van 1k voor de observatie van hele cellen tot 40k voor de observatie van endosomale compartimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de microgolfgeassisteerde synthese worden magnetische nanodeeltjes met een monodisperse 8,8 ± kerngrootte van 2,5 nm geproduceerd en bedekt met citraat of PAA (figuur 1A). Stamcellen worden vervolgens geïncubeerd met deze nanodeeltjes verspreid in kweekmedium in een bepaalde concentratie gedurende 30 minuten, wat resulteert in hun endocytose en opsluiting in de cellulaire endosomen (figuur 1B). De magnetische stamcellen worden vervolgens opgehangen in medium, gecentrifugeerd en de gevormde celpellet wordt tot 21 dagen gekweekt (figuur 1C). De verkregen sferoïden zijn vast, zoals het stoppen van biologische processen, en bewaard in PBS totdat ze via VSM worden gemeten.
Ten eerste wordt het magnetische moment van de nanodeeltjesoplossing gemeten met behulp van de VSM: 10 μL van de geascheidende waterige dispersie met 7 μg ijzer wordt gemeten en de verkregen curve wordt weergegeven in figuur 2A. Vanwege de aanwezigheid van water in deze oplossing en de monsterhouder wordt een diamagnetisch signaal opgevangen naast het superparamagnetische signaal van de nanodeeltjes. Een diamagnetische constante (Mdia) die overeenkomt met de helling van het tweede deel van de curve kan worden gemeten, zoals weergegeven in figuur 2A, endeze constante kan worden afgetrokken, zoals het verkrijgen van het magnetische moment van de nanodeeltjes alleen(M-monster = M - M dia ). De verzadigingsmamisering van de nanodeeltjes (Ms)kan vervolgens worden geëxtraheerd; het komt overeen met 518 μemu voor de waterige dispersie, wat betekent dat de oplossing zich op 74 emu/g ijzer (Fe) bevindt die overeenkomt met 52 emu/g nanodeeltjes (Fe3O4).
Het magnetische moment van celsferoïden kan op dezelfde manier worden verkregen. In dit geval wordt een cel-sferoïde (gemaakt van 200.000 cellen) in de monsterhouder geplaatst, in de VSM geplaatst en gemeten (figuur 2B). De verkregen magnetische momentwaarden zijn hier veel lager dan die van de initiële nanodeeltjesoplossing; ze blijven echter binnen het detectiebereik. De verzadigingsmagneetisering van dit specifieke monster is 69 μemu. Bovendien bevat deze sferoïde 1,3 μg nanodeeltjes (6,7 pg nanodeeltjes per cel), consistent met de verzadigingswaarde bij 52 emu/gFe3O4. Deze waarde kan dus worden gebruikt om de hoeveelheid nanodeeltjes in cellulaire monsters te bepalen. In figuur 2Cworden sferoïden die overeenkomen met cellen die zijn geëtiketteerd met drie concentraties nanodeeltjes met citraatcoating, één dag na de etikettering gemeten. De resultaten tonen duidelijk aan dat de opname van de nanodeeltjes afhangt van de incubatieconcentratie, met concentraties van 0,125, 0,25 en 0,5 mM die leiden tot opname van respectievelijk 0,3, 0,7 en 1,3 μg ijzer per sferoïde, wat respectievelijk 1,3, 3,3 en 6,7 pg ijzer per cel betekent.
Er is aandacht besteed aan het belang van de oppervlaktecoating, die rechtstreeks interageert met de biologische omgeving20. Hier zijn twee coatings geproduceerd: een citraatcoating, vaak gebruikt voor biomedische toepassingen, en een PAA-coating, met een hoger aantal chelaatfuncties. Stamcellen worden geëtiketteerd met deze twee soorten nanodeeltjes en gecentrifugeerd, zoals het vormen van een celpellet die vervolgens een samenhangende cel-sferoïde wordt (figuur 3A). Magnetisme van deze celsferoïden wordt gemeten via VSM op dag 1 en dag 21 (figuur 3B en figuur 3C). De resultaten tonen een afname van magnetisme op de 21 dagen van cultuur aan, wat wijst op de biologische afbraak van de nanodeeltjes, waarbij deze afbraak belangrijker is voor de met citraat bedekte nanodeeltjes (figuur 3B) dan de PAA-gecoate (figuur 3C). TEM-beelden bevestigen de afbraak van de nanodeeltjes en tonen het uiterlijk van kleinere (6 nm grote) lichtgrijze stippen, typisch voor ferritine geladen met ijzer. Sommige nanodeeltjes die intact blijven, kunnen ook worden waargenomen, vooral met de PAA-coating.
Figuur 1: Microgolfgeassisteerde synthese van ijzeroxide (Fe3O4) nanodeeltjes, hun internalisatie in stamcellen en de daaropvolgende cultuur van de cellen als sferoïden. (A) Schematisch van de verschillende stappen van de nanodeeltjessynthese. Ten eerste wordt de kern gesynthetiseerd via een niet-waterige sol gel-procedure. Het coatingmolecuul, ofwel Citraat (Cit) of polyacrylzuur (PAA), wordt vervolgens geënt aan het oppervlak van de ijzeroxidekern. Een representatieve TEM-afbeelding toont de gesynthetiseerde nanodeeltjes met een citraatcoating. (B) Schematische van de internalisatie van het nanodeeltje in stamcel, waaruit blijkt dat de nanodeeltjes bij internalisatie in de endosomen zijn opgesloten. Representatieve TEM-beelden tonen ook de citraat- en PAA-gecoate nanodeeltjes in de cellen, opgesloten in de endosomen. (C) Schematische vorming van stamcel-sferoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Meting van de monsters magnetisch moment via VSM. (A) 10 μL nanodeeltjes gedispergeerd in een waterige oplossing worden gemeten via de VSM. Het verkregen signaal vertegenwoordigt het magnetische moment van deze nanodeeltjesoplossing in functie van het magnetisch veld (B). Het diamagnetisme afkomstig van de aanwezigheid van water en de monsterhouder kan vervolgens worden gemeten omdat het overeenkomt met de helling van het tweede deel van de curve en afgetrokken, zoals het verkrijgen van het magnetische moment van de nanodeeltjes alleen. Het magnetische moment bij verzadiging (Ms)kan dan worden bepaald. (B) Het magnetische moment van celsferoïden kan op dezelfde manier worden verkregen; In dit geval wordt een enkele cel-sferoïde gemeten op een bepaalde periode. (C) Curven van sferoïden die overeenkomen met cellen die zijn geëtiketteerd met nanodeeltjes met citraatcoating in drie onafhankelijke concentraties van 0,125 mM (oranje), 0,25 mM (grijs) en 0,5 mM (blauw). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van magnetische nanodeeltjesdegradatie in cellulo via VSM. (A) Bij celetikettering met magnetische nanodeeltjes wordt een celpellet gevormd door centrifugatie (dag 0). De cellen vormen dan een samenhangende structuur die resulteert in een gemakkelijk te hanteren cel-sferoïde die gedurende langere tijd (maanden) in cultuur kan worden gehouden zonder celverlies. (B, C) Hierin worden twee soorten magnetische nanodeeltjes, bedekt met citraat (B) of PAA (C), geïnternaliseerd in stamcellen en worden de cellen tot 21 dagen gekweekt als sferoïden. Magnetisme van sferoïden gekweekt gedurende 1 dag (oranje curven) en 21 dagen (grijze krommen) worden gemeten met de VSM, met een afname van magnetisme die wijst op een afbraak van de nanodeeltjes. Representatieve TEM-beelden die op dag 21 zijn gemaakt, tonen lichtgrijze stippen van ongeveer 6 nm is grootte binnen de endosomen en het cytoplasma van de cellen, typische grootte en vorm van ferritine, het ijzeropslageiwit (zwarte pijlen). Sommige intacte nanodeeltjes kunnen ook worden waargenomen, meestal voor de PAA-gecoate nanodeeltjes (bruine pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van een snelle en efficiënte microgolfsynthese kunnen magnetische nanodeeltjes gemakkelijk worden gesynthetiseerd, met gecontroleerde grootte en verder worden bedekt met bepaalde moleculen. Een cruciale stap is om het ijzerzout en de benzylalcohol onder vacuüm op te slaan om een kleine dispersie in grootte te houden. De benzylalcohol werkt zowel als oplosmiddel als ligand en maakt het mogelijk om direct gekalibreerd kaal ijzeroxide te verkrijgen zonder dat er extra liganden nodig zijn. Na de overdracht van nanodeeltjes in water kunnen de kale magnetische nanodeeltjes gemakkelijk worden bedekt met een grote verscheidenheid aan liganden. Deze coating verleent inter-nanodeeltjes- en nanodeeltjescelinterage-eigenschappen die hun cellulaire internalisatie kunnen beïnvloeden, een parameter die strak moet worden gecontroleerd omdat een minimale internalisatie vereist is voor biomedische toepassingen, terwijl een te hoge internalisatie schadelijk kan zijn voor de cellen en mogelijk cytotoxische gebeurtenissen kan ontstaan31. Magnetometrie is een krachtig hulpmiddel om deze internalisering en het lot van magnetische nanodeeltjes in cellulo te beoordelen. Bij de integratie van magnetische nanodeeltjes in stamcellen kunnen sferoïden worden gevormd via een eenvoudige centrifugatie gevolgd door cultuur in een medium dat de proliferatie van de cellen stopt en de productie van extracellulaire matrixen stimuleert. De cellen worden zeer samenhangend en beginnen een weefsel te creëren. De sferoïden zijn dan zeer gemakkelijk te hanteren en kunnen gedurende langere tijd (maanden) worden gekweekt, waardoor het lot van magnetische nanodeeltjes op lange termijn in een biologische omgeving kan worden gevolgd. Door de celdeling te stoppen, is er geen verdunning van de nanodeeltjes van moeder naar dochtercel; bovendien is geverifieerd dat er met dit cel-sferoïde model geen ijzeren ontsnapping is gedurende een maand cultuur21,22,23. Als gevolg hiervan kan een afname van magnetismewaarden alleen overeenkomen met een afbraak van de nanodeeltjes en niet met ijzer dat uit de cellen wordt geëxporteerd.
Magnetisme van de celsferoïden wordt hier gemeten via VSM dat een snelle en nauwkeurige kwantificering biedt. Andere methoden zijn ook onderzocht om cellulair magnetisme te meten, zoals het gebruik van een Superconducting Interface Device (SQUID), een machine die doorgaans nauwkeuriger is dan de VSM met een gevoeligheid rond 10-7 emu in vergelijking met 10-6 emu voor de VSM, maar de operationele kosten zijn hoger32. De gevoeligheid van de VSM die metingen van magnetische ijzerdosis inferieur aan 2 pg/cel in de experimentele opstelling toestaat, is hierin voldoende nauwkeurig omdat ijzerdoses inferieur aan 2 pg/cel te laag zouden zijn voor de beoogde toepassingen, zoals celaantrekking naar een magnetische voor celbegeleiding en weefseltechnologie. Zowel VSM- als SQUID-magnetometrie kunnen, naast het toestaan van een kwantificering van celmagnetisme, aanvullende details geven over de kenmerken van de nanodeeltjes. Door analyse van het verkregen signaal kan de grootte van de nanodeeltjes22,23 worden afgetrokken en kan ook een algemeen begrip van hun magnetische kenmerken worden verkregen, hysterese en dwang van nanomaterialen kunnen bijvoorbeeld worden onthuld. Er bestaan ook alternatieve magnetometriebenaderingen, zoals magnetoforese die bestaat uit het meten van de snelheid van individuele cellen wanneer deze naar een magneet worden aangetrokken en het magnetisme van afzonderlijke cellen wordt geëxtrapoleerd33,34. Het magnetisme op eencellig niveau kan op deze manier worden verkregen; er kunnen echter geen extra nanodeeltjeskenmerken worden bepaald. Bovendien is onlangs een kleine magnetische sensor gebruikt die een signaal biedt dat evenredig is met het monstermagnetisme met een vergelijkbaar celsferoïdmodel. Deze magnetische sensor maakte het mogelijk om de biologische afbraak van magnetische nanodeeltjes in realtime, continu, gedurende 7 dagen35te volgen. Het signaal van deze magnetische sensor kan echter niet direct worden vertaald in een magnetisch moment, omdat het afhangt van de grootte van de nanodeeltjes. Om deze reden moet voor elk nanodeeltjeontwerp een kalibratiecurve worden uitgevoerd, een curve die kan worden gerealiseerd met behulp van de VSM.
Metingen die hierin met de VSM worden uitgevoerd, tonen een progressieve afbraak van de magnetische nanodeeltjes in de cellulaire omgeving aan, wat wordt aangegeven door een afname van magnetisme. Ze bewijzen ook dat dezelfde kern bedekt met verschillende moleculen met verschillende snelheden wordt afgebroken, afhankelijk van de coating. Bij het vergelijken van een PAA en een citraatcoating leidt PAA tot een hogere kernbescherming tot degradatie, waarschijnlijk vanwege de sterke verankering aan de magnetische kern20. Het lot van magnetische nanodeeltjes in de intracellulaire omgeving wordt beoordeeld op celsferoïden; de methode is er echter niet beperkt toe. Het kan inderdaad worden geëxtrapoleerd naar celsuspensies, die al zijn gebruikt om het effect van stamcel differentiatie op het lot van de nanodeeltjes te beoordelen22. Het onthulde dat, afhankelijk van de differentiatieroute, de magnetische nanodeeltjes anders worden verwerkt door de cellen, met in sommige gevallen de neokristallisatie van ijzer bij de ontbinding ervan. VSM-magnetometrie is dus een nuttig hulpmiddel om de invloed van zowel nanodeeltjes als celkenmerken op de intracellulaire verwerking van ijzeroxide nano-objecten verder te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Europese Unie (ERC-2014-CoG project MaTissE #648779). De auteurs willen graag het CNanoMat fysisch-chemische karakteriseringsplatform van University Paris 13 erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), Deerfield Beach, Fla. 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al.
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles - The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
