Summary
Dette arbejde beskriver brugen af CRISPR-Cas9 genom redigering teknologi til knockout endogene gen OsABCG15 efterfulgt af en modificeret Agrobacterium-medierettransformation protokol til at producere en stabil mand-steril linje i ris.
Abstract
Mandlig sterilitet er et vigtigt agronomisk træk for hybrid frøproduktion, der normalt er karakteriseret ved funktionelle defekter i mandlige kønsorganer / gameter. De seneste fremskridt inden for CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknologi giver mulighed for høj redigeringseffekt og tidsbesparende knockout-mutationer af endogene kandidatgener på bestemte steder. Derudover er Agrobacterium-medieretgenetisk transformation af ris også en vigtig metode til genændring, som er blevet bredt vedtaget af mange offentlige og private laboratorier. I denne undersøgelse anvendte vi CRISPR-Cas9 genomredigeringsværktøjer og genererede med succes tre sterile hanegenterlinjer ved målrettet genomredigering af OsABCG15 i en japonicasortiment. Vi brugte en modificeret Agrobacterium-medieretris transformation metode, der kunne give fremragende midler til genetisk emasculation for hybrid frøproduktion i ris. Transgene planter kan fås inden for 2-3 måneder og homozygot transformanter blev screenet ved genotypebestemmelse ved hjælp af PCR forstærkning og Sanger sekventering. Grundlæggende fæotypisk karakterisering af den mandlige sterile homozygot linje blev udført ved mikroskopisk observation af ris mandlige kønsorganer, pollen levedygtighed analyse af jod kalium iodid (I2-KI) farvning semi-tynde tværsnit af udvikle anthers.
Introduction
Ris er den vigtigste fødevareafgrøde, især i udviklingslandene, og udgør en basisfødevare til over halvdelen af verdens befolkning. Samlet set vokser efterspørgslen efter riskorn og forventes at stige med 50 % i 2030 og 100 % i 20501,2. Fremtidige forbedringer i ris udbytte bliver nødt til at udnytte forskellige molekylære og genetiske ressourcer, der gør ris en glimrende model for monocotyledonous plante forskning. Disse omfatter et effektivt transformationssystem, avanceret molekylærkort og offentligt tilgængelig database over udtrykte sekvenskoder, som er blevet genereret over mangeår 3,,4. En strategi for at forbedre høstudbyttet er hybridfrøproduktion 5, et centralt element, som er evnen til at manipulere mandlige frugtbarhed. En forståelse af den molekylære kontrol af mænds frugtbarhed i kornafgrøder kan bidrage til at omsætte vigtig viden til praktiske teknikker til at forbedre produktionen af hybridfrø og øgeafgrødeproduktiviteten 6,7.
Genetisk transformation er et vigtigt redskab for grundforskning og kommercielt landbrug, da det muliggør indførelse af fremmede gener eller manipulation af endogene gener i afgrøder, og resulterer i generering af genetisk modificerede linjer. En passende transformationsprotokol kan bidrage til at fremskynde genetiske og molekylære biologiundersøgelser med henblik på grundlæggende forståelse afgenregulering 8. I bakterier, genetisk transformation finder sted naturligt; men i planter, det udføres kunstigt ved hjælp af molekylærbiologiteknikker 9,10. Agrobacterium tumefaciens er en jordbåren, Gram-negativ bakterie, der forårsager kronen galdesygdom i planter ved at overføre T-DNA, en region af sin Ti plasmid, i plantecellen via en type IV sekretion system11,12. I planter, A. tumefaciens-medierettransformation betragtes som en udbredt metode til gen modifikation, fordi det fører til stabil og lav kopi nummer integration af T-DNA i værten genom13. Transgene ris blev først genereret gennem Agrobacterium-medieretgen transformation i midten af 1990'erne i japonica sorten14. Ved hjælp af denne protokol blev flere transgene linjer opnået inden for en periode på 4 måneder med en transformationseffektivitet på 10-30 %. Undersøgelsen viste, at der er to kritiske skridt for en vellykket transformation: den ene er induktion af embryogene callus fra modne frø og en anden er tilsætning af acetosyringone, en phenolforbindelse, til bakteriekultur under co-dyrkning, som giver mulighed for højere transformation effektivitet iplanterne 14,,15. Denne protokol er blevet flittigt anvendt med mindre ændringer i japonica16,17,18,19 samt andre sorter såsom indica20,21,22,23 og tropiske japonica24,25. Faktisk over 80% af de artikler, der beskriver ris transformation bruge Agrobacterium-medieretgen transformation som et værktøj13. Til dato er der udviklet flere genetiske transformationsprotokoller ved hjælp af risfrø som udgangsmateriale til kalustiluktion16,17,18,19. Men meget lidt er kendt om unge blomsterstand som explants for callus produktion. Samlet set er det vigtigt at etablere en hurtig, reproducerbar og effektiv gentransformings- og regenereringsprotokol for funktionel genomforskning og undersøgelser af afgrødeforbedring.
I de senere år har udviklingen af CRISPR-Cas9-teknologien resulteret i en præcis genomredigeringsmekanisme til at forstå genfunktionen og levere agronomisk vigtige forbedringer tilplanteavl 26,27. CRISPR giver også et betydeligt løfte om manipulation af mandlig reproduktiv udvikling og hybridproduktion. I denne undersøgelse anvendte vi et gen knockout system ved hjælp af CRISPR-Cas9 teknologi og koblet det til en effektiv ris gen transformation protokol ved hjælp af unge blomsterstande som explants, og dermed skabe stabile mandlige sterile linjer til studiet af reproduktiv udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA-CAS9 planteudtryk vektor konstruktion og Agrobacterium-medierettransformation
- Målret mod et sterilt hanegenOsABCG15 i ris i henhold til den offentliggjorte litteratur28.
- Design sgRNA for det målrettede sted placeret mellem 106-125 bp i den anden exon af OsABCG15 (Figur 1).
- Brug T4 polynukleotid kinase til at syntetisere sgRNA oligos (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' og 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGATGCTT').
- Brug endonuclease BbsI til at fordøje PSGR-Cas9 rygradsvektoren29.
- Ligate den syntetiserede sgRNA oligos med lineariseret PSGR-Cas9 rygrad ved hjælp af T4 ligase efter producentens protokol.
- Ved hjælp af HindIII/EcoRI skal du fordøje sgRNA-kassetten fra trin 1.5 og subclone til hindiii/ecori-stedet for pCAMBIA1300 binær vektor til stabil omdannelse29.
- Bekræft den konstruerede plasmid ved enzymfordøjelse og sekvensering. Senere omdanne den binære konstruktion i Agrobacterium tumefaciens stamme EHA105 og dyrke dem på Kan / Rif udvælgelse plader ved 28 °C i 2-3 dage.
2. Ris genetisk transformation og plantevæv kultur
- Callus induktion og regenerering
BEMÆRK: Brug friske unge ris blomsterstande som udgangsmateriale til at fremkalde callus (Figur 2).- Indsamle de unge blomsterstande fra uafskallet felt eller grønt hus på meiose fase, bestemt af floret længde på 1,6-4,8 mm (Figur 2A)29. Sørg for, at ris blomsterstande er dækket med blad kappe. Tør hver blomsterstand med en 70% alkohol podning og lad det tørre før skæring.
- Bring blomsterstanden til en ren steril bænk. Skær det i små stykker (jo mindre jo bedre) med steriliseret saks og derefter overføre stiklinger til en petriplade, der indeholder NBD2 medium (Figur 2B, Tabel 1).
- Pladen inkuberes i mørke ved 26 °C i ca. 10-14 dage for at fremkalde ringus (Figur 3A).
BEMÆRK: Brug den nydannede callus til Agrobacterium infiltration (trin 2.2.7) direkte eller istandsættelse endnu en gang i frisk NBD2 medium for at få mere callus. Overfør callus til det nye NBD2-medie hver 8-10 dage.
- Omdannelse og samdyrkning
- Brug A. tumefaciens bakterier, der indeholder den binære plasmid fra trin 1.6 til transformation. A. tumefaciensstammerne opbevares i YEB-medium (tabel 1) med 50 % glycerol ved -80 °C til videre brug.
- Streak A. tumefaciens fra en -80 °C glycerol bestand til YEB agar medium indeholdende selektive antibiotika (Tabel 1) og vokse ved 25-28 °C i 48-72 h, at tillade kolonier at forekomme.
- Inokuler en enkelt koloni fra YEB-pladen med selektive antibiotika til 5 ml flydende YEB-medium, der indeholder de samme selektive antibiotika (tabel 1), i et 50 ml konisk sterilt reagensglas. Ryst på en orbital shaker ved 250 x g, ved 25-28 °C, indtil bakterierne vokser til en OD600 på 0,5.
- Der tilsættes 1 ml bakteriel suspension til 100 ml YEB-medium (tabel 1) med samme selektive antibiotika i en konisk kolbe på 250 ml, og der rystes på en orbitalshaker ved 250 x gved 28 °C i 4 timer.
- Centrifuge ved 4.000 x g i 10 min ved stuetemperatur for at indsamle bakterier. Kassér supernatanten.
- Opsaltning af bakteriepellet med AAM-AS-medium (Tabel 1) og fortynde suspensionen til en OD600 = 0,4.
BEMÆRK: Den perfekte OD af bakteriel suspension er afgørende for effektiv transformation. Det hjælper med at fjerne overskydende bakterievækst på callus. - Saml omkring 150 sunde voksende lys-gule skrøbelige embryogene calli fra trin 2.1.3 i en 150 ml steril kolbe. Tilsæt 50-75 ml bakteriel celle suspension fra trin 2.2.6 i den sterile kolbe, og derefter tilføje nogle 10-25 ml frisk AAM-AS medium til at nedsænke calli i 10-20 min, omrystning lejlighedsvis.
- Hæld bakteriesuspensionen ud af kolben omhyggeligt, og tør den overskydende bakteriesuspension fra calluset ved hjælp af sterilt filterpapir #1 eller silkepapir. Læg dem derefter på en petriskål med NBD-AS medium (Tabel 1) dækket med et sterilt filterpapir #1. Inkuber ved 25-28 °C i mørke i 3 dage og kontroller for bakterieovervækst.
- Valg for resistent callus
- Efter 3 dages co-dyrkning, overføre calli til en steril Petri fad med en steril filterpapir.
- Lufttørre calli i 2 timer på en ren bænk. Sørg for, at opkaldet ikke overholdes filterpapiret.
- Calli overføres jævnt ved hjælp af steril pincet til det primære udvælgelsesmedie NBD2 (med 40 mg/L hygromycin og 250 mg/L timentin) (tabel 1). Kultur calli i 2 uger ved 25-28 °C i mørke.
- Efter 2 uger overføres calli jævnt til en ny plade, der indeholder friskt valgmedium NBD2 (med 40 mg/L hygromycin og 250 mg/L timentin) (tabel 1). Kultur calli i yderligere 2 uger ved 25-28 °C i mørke.
- Kaldusdifferentiering
- Overfør callus til frisk MS Medium (med 25 mg/L hygromycin og 150 mg/l timentin) (tabel 1). Kultur under lyset ved 25-28 °C i ca. 2 uger.
- Gentag trin 2.4.1 en gang til.
- Overfør skydeknopperne til det nye MS-medie (med 10 mg/L hygromycin) for at formere flere skud.
- Rod induktion
- Overfør de nye skud i 1/2 MS-mediet (tabel 1). Kultur under lyset ved 25 °C - 28 °C. De transformerede planter producerer rødder inden for 2 uger.
- Efter 1 uge, overføre planterne til at rense potter, der dækker anlægget for at forhindre dehydrering.
3. Identifikation af genotype
- Unge blade indsamles fra nygenererede planter til total DNA-ekstraktion ved hjælp af cetyltrimethyl ammoniumbromid (CTAB)metode 31.
- Ved hjælp af det genomiske DNA som skabelon skal du vælge primere (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATT 3' og Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3' beliggende i Hygromycin-regionen) for at udføre polymerasekædereaktion (PCR) for at validere transgeneintegrationen og frekvenserne (figur 4). Følgende PCR-betingelser: 94 °C i 5 min. 36 cyklusser (94 °C i 30 s; 56 °C i 30 s; 72 °C i 1 min. ) 72 °C i 7 min. Vellykkede PCR-reaktioner giver en 604 bp amplicon.
- Udfør en anden PCR for at forstærke den genomiske region omkring CRISPR-målwebstederne ved hjælp af specifikke primere (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3' og OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAAACATTGCTAT 3') for at identificere transformanternes genotype. PCR-betingelserne er de samme som i trin 3.2.
- Brug PCR fragmenter fra trin 3.3 direkte til Sanger sekventering til at identificere mutationer.
4. Overhold den mutante
- Forbered I2-KI-opløsningen: 2 g KI (kaliumdodid) opløses i 10 ml destilleret vand, og der tilsættes derefter 0,2 g I2 (genindsået jod) i den. Efter blanding bringes det samlede volumen op på 100 ml med destilleret vand.
- Forbered FAA-opløsningen (63% vandfri ethanol, 5% glacial eddikesyre, 5% formaldehyd og 27% vand) og bland før brug.
- 0,5% Toluidinblå farvningsopløsning: 0,5 g Toluidinblå opløses i 100 ml destilleret vand.
- Udfør vegetativ fænoypisk observation, ved at billedre hele planterne med et digitalt kamera.
- Udfør reproduktiv fænotype observation, fjerne palea og lemma fra buketten. Tag billeder af hele anthers under et stereomikroskop.
- Overhold pollen levedygtighed ved jod farvning.
- Pick modne ris småknuder før blomsten antese, fjerne palea og lemma at frigive anthers.
- Tag 6 anthers og læg dem på et glas dias. Tilsæt 1 dråbe destilleret vand, knuse anther godt med pincet til at frigive pollen korn, og derefter tilføje 2-3 dråber I2-KI opløsning. Dæk med dækslet.
- Overhold under et mikroskop med lav forstørrelse. Pollen korn farvet sort viser mere energisk levedygtighed, ingen farve eller gul-brun farvet er forkrøblede eller degenereret.
- Udfør en semi-tynd del af ris anther
- Fix ris blomster fra forskellige udviklingsstadier i en FAA løsning. Støvsug materialerne ved 4 °C (normalt 15 min) for at gøre det muligt for fikseringsstoffer at trænge ind i vævene, indtil materialet synker til bunden af opsamlingsflasken.
- Udskift med en ny FAA-løsning næste dag. Når materialet synker til bunden, erstattes med 70% ethanol og opbevares ved 4 °C til langvarig brug.
- Dehydrer materialerne med forskellige gradienter af ethanol (70%, 80%, 95% hver gang i 30 min, 100% ethanol i 2 timer, 100% ethanol, der indeholder lidt Safranin farvestof i 2 timer).
BEMÆRK: Tilføj lidt af Safranin farvestof i den anden 100% ethanol til at farve anthers for lettere trækning bagefter. - Udfør integrering ved at følge producentens anvisninger (Materialetabel). Derefter bages i en ovn ved 60 °C i 48 timer før trækning.
- Sektion prøven til en tykkelse på 2 μm ved hjælp af en mikrotom. Tilsæt en dråbe vand på glasrutsjebanen. Derefter afhente de tynde sektioner, der indeholder anther blokke af snævler og læg dem på overfladen af vanddråbe på dias.
- Ansvar objektglassene på vandbadet ved 50 °C for at sprede sektionerne fuldstændigt, så det sidder fast på rutsjebanen.
- Brug 0,5% toluidin blå opløsning pletter dias i 30 min. Skyl derefter med vand og tør i røghætten. Seal med neutral trælim. Læg forsigtigt en dækslæd på rutsjebanen og tør i røghætten.
- Overhold og foto prøven under et mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Demonstreret her er brugen af genredigering teknologi til at skabe en mandlig steril linje for fremtidig forskning af Agrobacterium-medieretgenetisk transformation i ris. For at skabe den mandlige sterile linje osabcg15, CRISPR-CAS9-medieret mutagenese blev brugt til binær vektor konstruktion. SgRNA var drevet af OsU3 promotor, mens udtrykket kassette af hSpCas9 var drevet af den dobbelte 35S promotor, og den midterste vektor blev samlet i en enkelt binær vektor pCAMBIA1300 designet til Agrobacterium-medieretstabil transformation af ris. En grafisk gengivelse af konstruktionen , der blev anvendt til CRISPR/Cas9-medieret mutagenese af ris, findes i figur 1A.
Figur 2 og figur 3 repræsenterer hele proceduren for produktion af ristransgene. De unge blomsterstande blev valgt som eksplanter (figur 2) og inducerede den smuldrende embryogene callus (FEC) inden for 14 dage efter inokulering på NBD2-mediet (Figur 3A). Den embryogene calli blev direkte brugt til Agrobacterium-medierettransformation (Figur 3C) eller subkultur til spredning for at opnå mere calli for yderligere infektion (figur 3B). Efter co-dyrke i 48 timer på NBD2-AS medium i mørke forhold (Figur 3D), calli blev flyttet til en anden runde af udvælgelse medium. Efter 10-14 dage, forvandlet calli viste nogle små nydannede microcalli i periferien af moderen calli, mens farven på uoverformet calli forvandlet til brun og døde til sidst(Figur 3E, F). Senere, sund og cremet farvet calli blev overført til regenerering medium to gange. På dette stadium, forvandlet calli gradvist viste grønne pletter (skyde knopper) (Figur 3G, H). Disse nyligt genererede grønne pletter blev dyrket i en steril plastflaske indeholdende regenerering medium til at tillade skyde vækst(Figur 3I),og derefter flyttet (som friske skud) i en 1 / 2 MS medium til at fremkalde rødder. Senere, sunde og energisk voksende skud med veludviklede rødder blev høstet (Figur 3J).
I alt blev der opnået 21 regenererede planter. PCR-forstærkning for hygromycinregionen viste, at 18 ud af 21 kan forstærke det tilsvarende bånd, hvilket indikerer, at disse linjer er transgene (figur 4), og den tilsvarende transformationsfrekvens er ca. 85,71 % (tabel 2). Transformanterne blev genotypet for at identificere mutationerne på sgRNA-målstedet(-erne) ved hjælp af primere, der spænder over målregionen ved PCR-amplicon og Sanger-sekvensering, Blandt 18 T0 transgene planter var otte heterozygotlinjer og tre homozygotlinjer CRISPR-Cas9 positive med tilsvarende mutationsfrekvenser på 61,11% (Figur 1B, Tabel 2).
Homozygos knockout mutanter blev valideret ved grundlæggende mandlige reproduktive organ observation (Figur 5). Anthers af osabcg15 var mindre og lysere end dem af den vilde type (Figur 5A,D), og manglede modne pollen korn ( Figur5B,E). Der blev udført tværgående tværsnitsmikroskopi for at undersøge anthermorfologiske defekter i osabcg15 sammenlignet med den vilde type. På trin 10 blev mikrosporer af vildtypen rundformet og vakuoleret med mørkeblå-bejdsede eksin (Figur 5C). Derimod osabcg15 mikrosporer kollapsede og nedbrydes, kun rester af degenereret mikrospor findes i anther locule (Figur 5F).
Figur 1: Konstruere oplysninger om CRISPR/Cas9-systemet og målrettet mutagenese fra OsABCG15. (A) SgRNA var drevet af OsU3 promotor, mens udtrykket kassette af hSpCas9 var drevet af den dobbelte 35S promotor; den midterste vektor blev samlet i en enkelt binær vektor designet til Agrobacterium-medieretstabil transformation af ris. (B) Sekvensen (5'-AAGCACATCCTCAAGGGGAT-3') i den anden ekson af OsABCG15-genet blev valgt som målsted for sgRNA. Tre typer af homozygot mutation hændelser blev genereret af CRISPR-Cas9 i japonica kulti 9522 baggrund, og Sanger sekventering kromatogrammer af CRISPR-Cas9 induceret mutation steder er vist. Linje 9522osabcg15-1 har en enkelt-nukleotid (1-nt) 'A' indsættelse; linje 9522osabcg15-2 har en enkelt-nukleotid (1-nt) 'G' indsættelse; og linje 9522osabcg15-3 har en enkelt-nukleotid (1-nt) 'G' sletning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Udgangsmaterialer til inducerende callus. (A)Unge ris blomsterstande på meiose fase. BB) Dissekeret unge blomsterstande vokser på NBD2 medium. Bar = 2 cm i (A). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Procedure for fremstilling af transgene linjer ved agrobacteriummedierettransformation. (A)Ris calli genereret fra de unge blomsterstande. BB) Subkultur af calli. c) Inkubation af calli med A. tumefaciens. (D) Co-dyrkning af calli med A. tumefaciens. (E) Første udvælgelsescyklus af omdannet calli i nærværelse af Hygromycin (40 mg/L). (F) Anden udvælgelsescyklus af transformeret calli i nærværelse af Hygromycin (40 mg/l). (G) Første regenerering af omdannet calli. (H) Den anden regenerering af transformeret calli, der ler det grønne skydepunkt i kulturpladen. (I)Skyd induktion kultur. (J) Rod induktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Analyse af omdannelsesfrekvenser for regenererede risplanter. Forstærkede PCR-produkter, der viser et 604 bp fragment (1-8, 10-14, 16-20) efter 1,5% agarosegelelektrophoresis indikerer transgene positive linjer. Linjer, der mangler fragmentet, er ikketransformerede (9, 15, 21), svarende til wild-type (WT) kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Grundlæggende fænoopypisk observation af vildtypen (9522) og mutant 9522osabcg15-1. a) Vildblomst (9522) blomst og (D) 9522osabcg15-1 mutant blomst efter fjernelse af lemma og palea. gl, glume; fi, glødetråd; lo, lodicule; pi, støvveje; st, stamen. (B) I2-KI farvning af modne pollenkorn af vild type (9522) og (E) 9522osabcg15-1 linje. c) Analyse af anther udvikling i vildtype (9522) og (F) 9522osabcg15-1 mutant ved tværgående sektion observation. DMsp, degenererede mikrosporer; E, epidermis; En, endothecium; Msp, mikrospor; T, tapet. Stænger = 2 mm i (A) og (D), 100 μm i (B) og (E), 50 μm i (C) og (F). Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Mediesammensætninger for omdannelse af ris. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Transformations- og genredigeringseffektiviteten for mutanterne af OsABCG15 genereret af CRISPR-Cas9 i T0-generationen. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kunstige gengene mandlige sterile mutanter genereres traditionelt ved tilfældig fysisk, kemisk eller biologisk mutagenese. Selv om disse er kraftfulde teknikker, deres tilfældige karakter undlader at udnytte den enorme mængde af moderne genomisk viden, der har potentiale til at levere skræddersyede forbedringer i molekylæravl 32. CRISPR-Cas9-systemet har været meget udbredt i planter på grund af dets enkle og overkommelige midler til at manipulere og redigere DNA29,33; det har potentiale til at spare tid i forhold til traditionelle mutagenese metoder.
Her udviklede vi et praktisk Agrobacterium-medierettransformationssystem ved hjælp af unge blomsterstande som explants til callus induktion. Der er nogle trin i transgene procedure, der kan udelades for at spare tid. Brug af unge blomsterstande som udgangsmateriale er et godt valg for at minimere den samlede varighed af callus induktion sammenlignet med at bruge frø som explants. Desuden er celledifferentiering og regenereringskapacitet meget stærk i calli opnået fra unge blomsterstande. I denne proces, subkultur af ris calli kan undgås, hvilket i sidste ende sparer tid samt reducerer risikoen for bakteriel og svampe forurening. Desuden blev timentin brugt som antibiotikum i stedet for carbenicillin, hvilket er mere effektivt til at hæmme bakterier.
Undersøgelsen og den indførte protokol for grundlæggende fænotopypisk observation af mandlige reproduktive udvikling i ris er nyttig for bachelor-og kandidatstuderende, der er interesseret i plante reproduktiv biologi. Denne praktiske protokol bør være hurtig at gribe og reproduceres til brug i efterfølgende forskningsundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Xiaofei Chen for at give de unge ris blomsterstande og bistand til at gøre ris væv kultur medium. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31900611).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
- FAO. FAO statistical yearbook, World Food and Agriculture. Rome. ISBN 978-92-5-107396-4. , Available from: http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf (2013).
- FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges. Rome. ISBN 978-92-5-109551-5. , Available from: http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf 109551-109555 (2017).
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D.
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B.
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j, Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C.
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. iC. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
