Summary
Dette arbeidet beskriver bruken av CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknologi for å slå ned endogene genet OsABCG15 etterfulgt av en modifisert Agrobacterium-medierttransformasjonsprotokoll for å produsere en stabil mannssteril linje i ris.
Abstract
Mannlig sterilitet er en viktig agronomisk egenskap for hybrid frøproduksjon som vanligvis er preget av funksjonelle defekter i mannlige reproduktive organer / gametes. Nylige fremskritt innen CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknologi gir høy redigeringseffekt og tidsbesparende knockoutmutasjoner av endogene kandidatgener på bestemte steder. I tillegg er Agrobacterium-mediert genetisk transformasjon av ris også en viktig metode for genmodifisering, som har blitt mye vedtatt av mange offentlige og private laboratorier. I denne studien brukte vi CRISPR-Cas9 genomredigeringsverktøy og genererte vellykket tre mannlige sterile mutantlinjer ved målrettet genomredigering av OsABCG15 i en japonica-sort. Vi brukte en modifisert Agrobacterium-mediert ris transformasjon metode som kan gi gode midler for genetisk emasculation for hybrid frø produksjon i ris. Transgene planter kan oppnås innen 2–3 måneder, og homozygøse transformanter ble screenet ved å genotyping ved hjelp av PCR-forsterkning og Sanger-sekvensering. Grunnleggende fenotypisk karakterisering av den mannlige sterile homozygous linjen ble utført ved mikroskopisk observasjon av ris mannlige reproduktive organer, pollen levedyktighet analyse av jod kaliumjodid (I2-KI) farging semi-tynn tverrsnitt av utviklende anthers.
Introduction
Ris er den viktigste matavlingen, spesielt i utviklingsland, og representerer en stiftmat for over halvparten av verdens befolkning. Samlet sett øker etterspørselen etter riskorn og forventes å øke 50% innen 2030 og 100% innen 20501,,2. Fremtidige forbedringer i risutbyttet må kapitalisere på ulike molekylære og genetiske ressurser som gjør ris til en utmerket modell for monocotyledonous planteforskning. Disse inkluderer et effektivt transformasjonssystem, avansert molekylært kart og offentlig tilgjengelig database med uttrykte sekvenskoder, som har blitt generert over mangeår 3,,4. En strategi for å forbedre avlingsutbyttet er hybridfrøproduksjon 5,et sentralt element som er evnen til å manipulere mannlig fruktbarhet. Forstå molekylær kontroll av mannlig fruktbarhet i kornavlinger kan bidra til å oversette viktig kunnskap til praktiske teknikker for å forbedre hybrid frø produksjon og forbedre avling produktivitet6,,7.
Genetisk transformasjon er et viktig verktøy for grunnleggende forskning og kommersielt landbruk siden det muliggjør innføring av fremmede gener eller manipulering av endogene gener i avlingsplanter, og resulterer i generering av genmodifiserte linjer. En passende transformasjonsprotokoll kan bidra til å akselerere genetiske og molekylærbiologistudier for grunnleggende forståelse av genregulering8. I bakterier foregår genetisk transformasjon naturlig; men i planter utføres det kunstig ved hjelp av molekylærbiologiteknikker 9,10. Agrobacterium tumefaciens er en jordbåren, Gram-negativ bakterie som forårsaker krone gallesykdom i planter ved å overføre T-DNA, en region av sin Ti plasmid, inn i plantecellen via et type IV sekresjonssystem11,12. I planter anses A. tumefaciens-mediert transformasjon som en utbredt metode for genmodifisering fordi det fører til stabil og lav kopinummerintegrasjon av T-DNA i vertsgenomet13. Transgen ris ble først generert gjennom Agrobacterium-mediert gentransformasjon på midten av 1990-tallet i japonica sorti14. Ved hjelp av denne protokollen ble flere transgene linjer oppnådd i løpet av en periode på 4 måneder med en transformasjonseffektivitet på 10%-30%. Studien indikerte at det er to kritiske skritt for vellykket transformasjon: en er induksjon av embryogen callus fra modne frø og en annen er tillegg av acetosyringone, en fenolisk forbindelse, til bakteriekulturen under samtidig dyrking, noe som gir høyere transformasjonseffektivitet iplanter 14,15. Denne protokollen har blitt mye brukt med mindre endringer i japonica16,,17,,18,,19 samt andre sorter som indica20,,21,,22,,23 og tropisk japonica24,25. Faktisk bruker over 80% av artiklene som beskriver ristransformasjon Agrobacterium-mediert gentransformasjon som et verktøy13. Til dags dato har flere genetiske transformasjonsprotokoller blitt utviklet ved hjelp av risfrø som startmateriale for callus induksjon16,17,18,19. Imidlertid er svært lite kjent om unge blomsterstand som explants for callus produksjon. Samlet sett er det viktig å etablere en rask, reproduserbar og effektiv gentransformasjons- og regenereringsprotokoll for funksjonell genomikk og studier på avlingsforbedring.
De siste årene har utviklingen av CRISPR-Cas9-teknologi resultert i en presis genomredigeringsmekanisme for å forstå genfunksjonen og levere agronomisk viktige forbedringer forplanteavl 26,27. CRISPR gir også et betydelig løfte om manipulering av mannlig reproduktiv utvikling og hybridproduksjon. I denne studien benyttet vi et genutslagssystem ved hjelp av CRISPR-Cas9-teknologi og opprettet det til en effektiv risgentransformasjonsprotokoll ved hjelp av unge blomsterstander som explants, og dermed skape stabile mannlige sterile linjer for studiet av reproduktiv utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA-CAS9 plante uttrykk vektor konstruksjon og Agrobacterium-mediert transformasjon
- Målrett mot et mannlig sterilt gen OsABCG15 i ris i henhold til publisert litteratur28.
- Design sgRNA for det målrettede området som ligger mellom 106-125 bp i den andre exon av OsABCG15 (Figur 1).
- Bruk T4 polynukleotid kinase å syntetisere sgRNA oligos (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' og 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCCCTTGAGGATGTGCTT').
- Bruk endonuclease BbsI å fordøye psgR-Cas9 ryggraden vektor29.
- Ligate syntetisert sgRNA oligos med lineærisert PSGR-Cas9 ryggrad ved hjelp av T4 ligase etter produsentens protokoll.
- Bruk HindIII/EcoRI til å fordøye sgRNA-kassetten fra trinn 1.5 og underlukk til HindIII/EcoRI-området til pCAMBIA1300 binær vektor for stabil transformasjon29.
- Bekreft konstruert plasmid ved enzymfordøyelse og sekvensering. Senere, forvandle binære konstruksjonen til Agrobacterium tumefaciens stamme EHA105 og vokse dem på Kan/Rif utvalg plater ved 28 °C for 2–3 dager.
2. Ris genetisk transformasjon og plantevev kultur
- Callus induksjon og regenerering
MERK: Bruk friske unge risflorescences som startmateriale for å indusere callus (figur 2).- Samle de unge blomsterstandene fra rismarken eller det grønne huset på meiosis stadium, bestemt av floret lengde på 1,6-4,8 mm (Figur 2A)29. Sørg for at risbøylene er dekket med bladhylse. Tørk hver blomsterstand med en 70% spritserviett og la den tørke før du kutter.
- Ta blomsterstanden til en ren steril benk. Skjær den i små biter (jo mindre jo bedre) med sterilisert saks og overfør deretter stiklinger til en Petri-plate som inneholder NBD2 medium (figur 2B, tabell 1).
- Inkuber platen i mørket ved 26 °C i ca. 10-14 dager for å indusere callus (figur 3A).
MERK: Bruk den nyopprettede callus for Agrobacterium infiltrasjon (trinn 2.2.7) direkte eller rekondisjonering en gang til i friskt NBD2-medium for å få mer callus. Overfør callusen til det nye NBD2-mediet hver 8–10.
- Transformasjon og co-dyrking
- Bruk A. tumefaciens bakterier som inneholder binære plasmid fra trinn 1.6 for transformasjon. Oppbevar A. tumefaciens-stammene i YEB medium (tabell 1) med 50 % glyserol ved -80 °C for videre bruk.
- Strek A. tumefaciens fra en -80 °C glyserol lager til YEB agar medium som inneholder selektive antibiotika (Tabell 1) og vokse ved 25–28 °C i 48–72 timer, slik at kolonier vises.
- Inokuler en enkelt koloni fra YEB-platen med selektive antibiotika til 5 ml flytende YEB-medium som inneholder samme selektive antibiotika (tabell 1), i et konisk sterilt reagensrør på 50 ml. Rist på en orbital shaker ved 250 x g, ved 25–28 °C til bakteriene vokser til od600 av 0,5.
- Tilsett 1 ml bakteriell suspensjon til 100 ml YEB medium (Tabell 1) med samme selektive antibiotika i en konisk 250 ml konisk kolbe og rist på en orbital shaker ved 250 x g, ved 28 ° C i 4 timer.
- Sentrifuge ved 4000 x g i 10 min ved romtemperatur for å samle bakterier. Kast det overnaturlige.
- Resuspend bakteriepellet med AAM-AS medium (tabell 1) og fortynne suspensjonen til en OD600 = 0,4.
MERK: Den perfekte OD av bakteriell suspensjon er avgjørende for effektiv transformasjon. Det hjelper i å eliminere overflødig bakteriell vekst på callus. - Samle rundt 150 sunn voksende lys-gul skjøre embryogene calli fra trinn 2.1.3 inn i en 150 ml steril kolbe. Tilsett 50–75 ml bakteriell cellesuspensjon fra trinn 2.2.6 i den sterile kolben, og tilsett deretter et friskt AAM-AS-medium på 10–25 ml for å senke callien i 10–20 minutter, og rist av og til.
- Hell ut bakteriesuspensjonen fra kolben forsiktig og tørk overflødig bakteriell suspensjon fra callus ved hjelp av sterilt filterpapir #1 eller vevpapir. Plasser dem deretter på en petriskål med NBD-AS medium (tabell 1) dekket med et sterilt filterpapir #1. Inkuber ved 25–28 °C i mørket i 3 dager og se etter bakteriell overvekst.
- Valg for resistent callus
- Etter 3 dager med co-dyrking, overføre calli til en steril Petri skål med et sterilt filterpapir.
- Lufttørk callien i 2 timer på en ren benk. Kontroller at callus ikke følges filterpapiret.
- Overfør calli jevnt med steril pinsett til det primære utvalgsmediet NBD2 (med 40 mg/l hygromycin og 250 mg/l timentin) (tabell 1). Kultur calli i 2 uker ved 25–28 °C i mørket.
- Etter 2 uker overføres calli jevnt til en ny plate som inneholder ferskt utvalgsmedium NBD2 (med 40 mg/l hygromycin og 250 mg/l timentin) (tabell 1). Kultur calli for en annen 2 uker ved 25-28 °C i mørket.
- Callus differensiering
- Overfør callus til frisk MS Medium (med 25 mg/l hygromycin og 150 mg/l timentin) (tabell 1). Kultur under lys ved 25–28 °C i ca. 2 uker.
- Gjenta trinn 2.4.1 en gang til.
- Overfør skuddknoppene til det nye MS-mediet (med 10 mg/l hygromycin) for å spre flere skudd.
- Root induksjon
- Overfør de nye skuddene til 1/2 MS medium (Tabell 1). Kultur under lys ved 25 °C - 28 °C. De forvandlede plantene produserer røtter innen 2 uker.
- Etter 1 uke, overfør plantene til rene potter som dekker planten for å forhindre dehydrering.
3. Identifikasjon av genotype
- Samle unge blader fra nygenererte planter for total DNA ekstraksjon ved hjelp av cetyltrimetyl ammoniumbromid (CTAB) metode31.
- Bruk genomisk DNA som mal, velg primerne (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATT 3' og Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3' som ligger i Hygromycin-regionen) for å utføre polymerasekjedereaksjon (PCR) for å validere transgeneintegrasjon og frekvenser (figur 4). Følgende PCR-forhold: 94 °C i 5 min; 36 sykluser (94 °C for 30 s; 56 °C i 30 s; 72 °C i 1 min); 72 °C i 7 min. Vellykkede PCR reaksjoner gir en 604 bp amplicon.
- Utfør en annen PCR for å forsterke det genomiske området rundt CRISPR-målstedene ved hjelp av spesifikke primere (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3' og OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAAACATTGCTAT 3') for å identifisere genotypen til transformantene. PCR-betingelsene er de samme som i trinn 3.2.
- Bruk PCR-fragmenter fra trinn 3.3 direkte for Sanger-sekvensering for å identifisere mutasjoner.
4. Vær oppmerksom på den grunnleggende fenotypen til muterten
- Forbered I2-KI-løsningen: oppløs 2 g KI (kaliumjodid) i 10 ml destillert vann og tilsett deretter 0,2 g I2 (resublimert jod) i den. Etter blanding, bringe det totale volumet til 100 ml med destillert vann.
- Forbered FAA-løsningen (63 % vannfri etanol, 5 % isetdiksyre, 5 % formaldehyd og 27 % vann) og bland før bruk.
- Forbered den 0,5 % toluinblå fargeløsningen: oppløs 0,5 g Toluidinblå i 100 ml destillert vann.
- Utfør vegetativ fenotypisk observasjon, ved å forestille hele plantene med et digitalt kamera.
- Utfør reproduktiv fenotypeobservasjon, fjern palea og lemma fra floreten. Ta bilder av hele anthers under et stereomikroskop.
- Vær oppmerksom på pollen levedyktigheten ved jodfarging.
- Velg modne rispigger før blomsterbedøvelsen, fjern palea og lemma for å frigjøre anthers.
- Ta 6 anthers og plasser dem på et glass lysbilde. Tilsett 1 dråpe destillert vann, knus anther-brønnen med pinsett for å frigjøre pollenkornene, og tilsett deretter 2–3 dråper I2-KI-løsning. Dekk med dekkslippen.
- Vær oppmerksom på et mikroskop med lav forstørrelse. Pollen korn farget svart viser mer kraftig levedyktighet, ingen farge eller gul-brun farget er forkrøplet eller degenerert.
- Utfør en semitynn del av ris anther
- Fest risblomstene fra forskjellige utviklingsstadier til en FAA-løsning. Støvsug materialene ved 4 °C (vanligvis 15 min) slik at fikseringen må trenge inn i vevet til materialet synker til bunnen av oppsamlingsflasken.
- Erstatt med en ny FAA-løsning neste dag. Når materialet synker til bunnen, erstattes med 70% etanol og oppbevares ved 4 °C til langvarig bruk.
- Dehydrere materialene med forskjellige gradienter av etanol (70%, 80%, 95% hver gang i 30 min, 100% etanol i 2 timer, 100% etanol som inneholder litt Safranin fargestoff i 2 timer).
MERK: Legg til litt Safranin fargestoff i den andre 100% etanol for å farge anthers for enklere snitting etterpå. - Utfør innebygging ved å følge produsentens instruksjon (Materials tabell). Deretter stekes i ovnen ved 60 °C i 48 timer før snitting.
- Del prøven til en tykkelse på 2 μm ved hjelp av en mikrotom. Tilsett en dråpe vann på glasssklien. Deretter plukker du opp de tynne delene som inneholder anther blokker ved tang og legger dem på overflaten av vanndråpen på lysbildene.
- Plasser lysbildene på vannbadet ved 50 °C for å spre delene helt slik at den sitter godt fast i sklien.
- Bruk 0,5% toluidin blå oppløsning flekk lysbildene i 30 min. Skyll deretter med vann og tørk i røykhetten. Forsegle med nøytralt trelim. Plasser forsiktig en dekkslips på lysbildet og tørk i røykhetten.
- Observer og fotografer prøven under et mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Demonstrert her er bruk av genredigeringsteknologi for å skape en mannlig steril linje for fremtidig forskning av Agrobacterium-mediert genetisk transformasjon i ris. For å lage den mannlige sterile linjen av osabcg15,ble CRISPR-CAS9-mediert mutagenese brukt til binær vektorkonstruksjon. SgRNA ble drevet av OsU3-promotoren, mens uttrykkskassetten til hSpCas9 ble drevet av den doble 35S-promotoren, og den midterste vektoren ble satt sammen i en enkelt binær vektor pCAMBIA1300 designet for Agrobacterium-mediert stabil transformasjon av ris. En grafisk representasjon av konstruksjonen som ble brukt til CRISPR/Cas9-mediert mutagenese av ris er gitt i figur 1A.
Figur 2 og figur 3 representerer hele prosedyren for ristransgenproduksjon. De unge blomstringene ble valgt som explants (figur 2) og induserte den sprø embryogene callus (FEC) innen 14 dager etter inokulasjon på NBD2-mediet (figur 3A). Den embryogene calli ble direkte brukt for Agrobacterium-medierttransformasjon (Figur 3C) eller subkultur for spredning for å få mer calli for videre infeksjon (Figur 3B). Etter å ha dyrket i 48 timer på NBD2-AS medium under mørke forhold (figur 3D),ble callien flyttet til en andre runde med utvalgsmedium. Etter 10-14 dager viste forvandlet calli noen små nyopprettede microcalli i periferien til moren calli, mens fargen på uoverført calli ble til brun og døde til slutt (Figur 3E, F). Senere ble sunn og kremet farget calli overført til regenereringsmediet to ganger. På dette stadiet viste forvandlet calli gradvis grønne flekker (skyte knopper) (Figur 3G, H). Disse nygenererte grønne flekkene ble dyrket i en steril plastflaske som inneholder regenereringsmedium for å tillate skytevekst (figur 3I), og deretter flyttet (som friske skudd) inn i et 1/2 MS medium for å indusere røtter. Senere ble sunne og kraftig voksende skudd med velutviklede røtter høstet (figur 3J).
Totalt ble det oppnådd 21 regenererte frøplanter. PCR-forsterkning for hygromycinregionen viste at 18 av 21 kan forsterke det tilsvarende båndet, noe som indikerer at disse linjene er transgene (figur 4), og den tilsvarende transformasjonsfrekvensen er ca. 85,71 % (tabell 2). Transformantene ble genotypet for å identifisere mutasjonene på sgRNA-målstedet(e) ved hjelp av primere som strekker seg over målområdet ved PCR amplicon og Sanger sekvensering, blant 18 T0 transgene planter, åtte heterozygøse linjer og tre homozygøse linjer var CRISPR-Cas9 positive, med tilsvarende mutasjonsfrekvenser på 61,11% (figur 1B, tabell 2).
De homozygøse knockoutmutantene ble validert av grunnleggende mannlig reproduksjonsorganobservasjon (figur 5). Anthers av osabcg15 var mindre og blekere enn de av vill-type (Figur 5A, D), og manglet modne pollen korn ( Figur5B, E). Tverrgående snitting mikroskopi ble utført for å undersøke anther morfologiske defekter i osabcg15 sammenlignet med vill type. På trinn 10 ble wild-type mikrospores rund formet og vacuolated med mørk blå-farget exine (Figur 5C). Derimot kollapset osabcg15 mikrosporer og degraderes, bare rusk av degenerert mikrospor finnes i anther locule (Figur 5F).
Figur 1: Konstruer informasjon for CRISPR/Cas9-systemet og målrettet mutagenese av OsABCG15. (A)SgRNA ble drevet av OsU3-arrangøren, mens uttrykkskassetten til hSpCas9 ble drevet av den doble 35S-arrangøren; den midterste vektoren ble satt sammen i en enkelt binær vektor designet for Agrobacterium-mediert stabil transformasjon av ris. (B) Sekvensen (5'-AAGCACATCCTCAAGGGGAT-3') som ligger i den andre eksonen av OsABCG15-genet ble valgt som målstedet for sgRNA. Tre typer homozygøse mutasjonshendelser ble generert av CRISPR-Cas9 i japonica-sortianlegg 9522 bakgrunn, og Sanger sekvensering kromatrammer av CRISPR-Cas9 induserte mutasjonssteder er vist. Linje 9522osabcg15-1 har en enkelt-nukleotid (1-nt) 'A' innsetting; linje 9522osabcg15-2 har en enkelt-nukleotid (1-nt) 'G' innsetting; og linje 9522osabcg15-3 har en enkelt-nukleotid (1-nt) 'G' sletting. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Startmaterialer for å indusere callus. (A)Unge ris blomsterstander på meiosis scenen. (B)Dissekerte unge blomsterstander vokser på NBD2 medium. Bar = 2 cm tommer (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Prosedyre for produksjon av transgene linjer av Agrobacterium-mediert transformasjon. (A) Rice calli generert fra de unge blomsterstander. (B)Subkultur av calli. (C) Inkubasjon av calli med A. tumefaciens. (D) Co-dyrking av calli med A. tumefaciens. (E) Første valgsyklus av transformert calli i nærvær av Hygromycin (40 mg / L). (F)Andre valgsyklus av forvandlet calli i nærvær av Hygromycin (40 mg / L). (G)Første regenerering av forvandlet calli. (H)Den andre regenerering av forvandlet calli, og noterer seg det grønne skytepunktet i kulturplaten. (I)Skyt induksjonskultur. (J)Root induksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av transformasjonsfrekvenser av regenererte risplanter. Forsterkede PCR-produkter som viser et 604 bp fragment (1–8, 10–14, 16–20) etter 1,5 % agarose gelelektroforese indikerer transgene positive linjer. Linjer som mangler fragmentet er uoverførte (9, 15, 21), på samme måte som wild-type (WT)-kontrollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Grunnleggende fenotypisk observasjon av villtype (9522) og mutant 9522osabcg15-1. (A) Wild-type (9522) blomst og (D) 9522osabcg15-1 mutant blomst etter fjerning av lemma og palea. gl, glume; fi, filament; lo, lodicule; pi, støvbærer; st, stamen. (B)Jeg2-KI farging av modne pollen korn fra vill-type (9522) og (E) 9522osabcg15-1 linje. (C) Analyse av anther utvikling i wild-type (9522) og (F) 9522osabcg15-1 mutant ved tverrgående seksjon observasjon. DMsp, Degenerert mikrospor; E, epidermis; En, endothecium; Msp, mikrospor; T, tapetum. Stolper = 2 mm tommer (A) og (D), 100 μm i (B) og (E), 50 μm i (C) og (F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Mediekomposisjoner for ristransformasjon. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Transformasjon og genredigeringseffektivitet for mutantene i OsABCG15 generert av CRISPR-Cas9 i T0-generasjonen. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kunstige geniske mannlige sterile mutanter genereres tradisjonelt av tilfeldig fysisk, kjemisk eller biologisk mutagenese. Selv om dette er kraftige teknikker, klarer deres tilfeldige natur ikke å kapitalisere på den enorme mengden moderne genomisk kunnskap som har potensial til å levere skreddersydde forbedringer i molekylær avl32. CRISPR-Cas9-systemet har blitt mye brukt i planter på grunn av sine enkle og rimelige midler for å manipulere og redigere DNA29,33; det har potensial til å spare tid sammenlignet med tradisjonelle mutagenesis metoder.
Her utviklet vi et praktisk Agrobacterium-medierttransformasjonssystem ved hjelp av unge blomsterstander som explants for callus induksjon. Det er noen trinn i transgene prosedyren som kan utelates for å spare tid. Bruk av unge blomsterstander som startmateriale er et godt valg for å minimere den generelle varigheten av callus induksjon sammenlignet med å bruke frø som explants. I tillegg er cellediensiasjonen og regenereringskapasiteten veldig sterk i calli oppnådd fra unge blomsterstander. I denne prosessen kan subkultur av ris calli unngås, noe som til slutt sparer tid, samt reduserer risikoen for bakteriell og soppforurensning. Videre ble timentin brukt som antibiotika i stedet for karbabinenicillin, som er mer effektiv i å hemme bakterier.
Studien og den introduserte protokollen for grunnleggende fenotypisk observasjon av mannlig reproduktiv utvikling i ris er nyttig for lavere og høyere studenter som er interessert i plante reproduktiv biologi. Denne praktiske protokollen bør være rask til å forstå og reproduserbar for bruk i senere forskningsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne Xiaofei Chen for å gi de unge ris blomsterstander og hjelp til å gjøre risvev kultur medium. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31900611).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
- FAO. FAO statistical yearbook, World Food and Agriculture. Rome. ISBN 978-92-5-107396-4. , Available from: http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf (2013).
- FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges. Rome. ISBN 978-92-5-109551-5. , Available from: http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf 109551-109555 (2017).
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D.
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B.
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j, Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C.
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. iC. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
