Summary
Этот протокол описывает удаление эндогенных липидов из аллергенов и их замену указанными пользователем лигандами посредством обратнофазной ВЭЖХ в сочетании с термическим отжигом. 31 31 P-ЯМР и круговой дихроизм позволяют быстро подтвердить удаление/нагрузку лиганда и восстановление нативной структуры аллергена.
Abstract
Многие основные аллергены связываются с гидрофобными липидоподобными молекулами, включая Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 и Fel d 1. Эти лиганды сильно сохраняются и могут влиять на процесс сенсибилизации либо путем прямой стимуляции иммунной системы, либо путем изменения биофизических свойств аллергенного белка. Для контроля этих переменных требуются методы удаления эндогенно связанных лигандов и, при необходимости, замещения липидами известного состава. Аллерген таракана Bla g 1 заключает в себе большую гидрофобную полость, которая связывает гетерогенную смесь эндогенных липидов при очистке с использованием традиционных методов. Здесь мы описываем способ, с помощью которого эти липиды удаляются с использованием обратнофазной ВЭЖХ с последующим термическим отжигом с получением Bla g 1 в его Апо-форме или перезагружается пользовательской смесью жирных кислот или фосфолипидных грузов. Соединение этого протокола с биохимическими анализами показывает, что грузы жирных кислот значительно изменяют термостабильность и протеолитическую устойчивость Bla g 1, что имеет последующие последствия для скорости генерации эпитопа Т-клеток и аллергенности. Эти результаты подчеркивают важность протоколов удаления/перезагрузки липидов, таких как описанный в настоящем описании, при изучении аллергенов как из рекомбинантных, так и из природных источников. Протокол обобщается на другие семейства аллергенов, включая липокалины (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) и Утероглобин (Fel d 1), обеспечивая ценный инструмент для изучения роли липидов в аллергической реакции.
Introduction
Исследование базы данных аллергенов показывает, что аллергены встречаются только в 2% всех известных семейств белков, предполагая, что общие функциональные и биофизические свойства способствуют аллергенности1. Из этих свойств способность связывать липидные грузы, по-видимому, сильно перепредставлена среди аллергенов, что позволяет предположить, что эти грузы могут влиять на процесс сенсибилизации1. Действительно, было показано, что аллерген бразильского ореха Ber e 1 требует совместного введения с его эндогенным липидом для реализации его полного сенсибилизирующего потенциала2. Эти липиды могут потенциально стимулировать иммунную систему непосредственно, как показано аллергенами клеща Der p 2 и Der p 7, оба из которых имеют сильную структурную гомологию с LPS-связывающими белками3,4,5. На основе этого наблюдения было высказано предположение, что Derp 2 и Der p 7 могут связывать бактериальные липиды и непосредственно стимулировать иммунную систему хозяина посредством TLR4-опосредования сигнализации, облегчая процесс сенсибилизации5,6. Также возможно, что эндогенно связанные липиды могут изменять биофизические свойства самих аллергенных белков. Например, способность Sin a 2 (горчица) и Ara h 1 (арахис) взаимодействовать с фосфолипидными везикулами значительно усилила их устойчивость к желудочной и эндосомальной деградации7,в то время как связывание лигандов с основным аллергеном пыльцы березы Bet v 1 изменяло как скорость эндосомальной обработки, так и разнообразие полученныхпептидов 8. Это особенно актуально для аллергенности, учитывая корреляцию, которая наблюдалась между стабильностью, генерацией эпитопа Т-клеток и аллергенностью для белков, таких как Bet v 1 и Bla g 1; последний из которых будет предметом настоящей работы9,10.
Bla g 1 представляет собой прототип члена семейства белков основных аллергенов насекомых (MA) и обладает уникальной структурой, состоящей из 12 амфипатических альфа-хеликул, которые заключают аномально большую гидрофобную полость9,11. Доступная рентгеновская кристаллическая структура Bla g 1 показывает электронную плотность в этой полости, согласуемую со связанными фосфолипидными или жирными кислотными лигандами; гипотеза, подтвержденная 31П-ЯМР и масс-спектрометрией. Эти грузы были неоднородными по своей природе, и их состав сильно зависел от источника аллергена, причем различные липидные профили наблюдались для рекомбинантного Bla g 1, выраженного у E. coli и P. pastoris. Любопытно, что Bla g 1, очищенный от своего естественного источника аллергена (таракан фрасс), содержал преимущественно жирные кислоты в своем месте связывания, причем смесь пальмитата, олеата и стеарата была идентифицирована как его «естественные» лиганды9,11. Способность Bla g 1 удерживать липиды и жирные кислоты после нескольких этапов очистки препятствует усилиям по изучению белка в изоляции. И наоборот, было высказано предположение, что естественные пальмитатные, стеаратные и олеатные лиганды Bla g 1 (далее именуемые nMix) играют ключевую роль как в его аллергенности, так и в нативной биологической функции9. Однако эти лиганды отсутствуют в Bla g 1, полученном из рекомбинантных источников, что затрудняет оценку этой гипотезы. Аналогичные проблемы наблюдались для других аллергенов, связывающих липиды, таких как Bet v1 12,13. Чтобы облегчить систематическое изучение липидно-аллергенных взаимодействий, мы разработали протокол, с помощью которого аллергены могут быть количественно лишены своих эндогенно связанных липидов и восстановлены либо в Апо-форме, либо загружены специфическими лигандами.
Аллергены чаще всего очищают от их естественных или рекомбинантных источников с использованием аффинной хроматографии и/или хроматографии с исключением размера. Здесь мы вводим дополнительную стадию очистки в виде высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонки C18 обратной фазы, из которой аллерген элюируется в органический растворитель, аналогичный протоколам, разработанным для белков14 связыванияжирных кислот. Полученный белок затем подвергают термическому отжигу в отсутствие или присутствие жирных кислот и/или фосфолипидов. В дополнение к восстановлению нативного Bla g 1 раза, повышенные температуры увеличивают растворимость и доступность липидных грузов, давая Bla g 1 либо в Апо-форме, либо равномерно загруженный желаемым гидрофобным лигандом. 31 31 Очищенные таким образом P-ЯМР спектры Bla g 1 подтвердили полное удаление эндогенно связанных лигандов и равномерное замещение желаемыми соединениями, в то время как круговой дихроизм подтвердил успешное восстановление Bla g 1 раза. Полезность этого метода подчеркивается в недавней работе, в которой было обнаружено, что связывание груза усиливает термостабильность Bla g 1 и протеолитическую резистентность, изменяя кинетику генерации эпитопов Т-клеток с потенциальными последствиями для сенсибилизации и аллергенности9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bla g 1 клонирование
- Получают ген таракана аллерген Bla g 1.0101 (остатки 34-216), представляющий собой единый повтор домена МА. Для простоты Bla g 1 будет использоваться на протяжении всей работы, чтобы представить этот единственный повтор, а не всю стенограмму Bla g 1.0101.
- Субклон ген Bla g 1 в нужный вектор. В этом исследовании ген, содержащий N-концевую метку глутатион-S-трансферазы (GST), связанную с участком расщепления протеазы вируса травли табака (TEV), был вставлен в вектор pGEX для экспрессии, как описаноранее 11.
- Преобразуйте вектор Bla g 1 pGEX в ячейки BL21 DE3 E. coli.
- Подготовьте запас нужного вектора 10 нг/мкл.
- Объедините 1 мкл 10 нг/мкл ДНК с 50 мкл клеток BL21 DE3, как это предусмотрено производителем.
- Инкубировать смесь BL21 DE3-ДНК в течение 30 мин на льду. Переложить на водяную баню при 42 °C в течение 1 мин, затем сразу же вернуть на лед для дополнительной инкубации 1 мин.
- Добавьте 200 мкл среды LB к клеткам и инкубируют в течение дополнительного 1 ч при 37 °C.
- Накладывайте трансформированные клетки на пластины LB-agar, содержащие 100 мг/л ампициллина, и растут при 37 °C в течение ночи.
2. Первоначальное выражение и очищение
- Инокулируют 1 л LB-среды, содержащей 100 мг/л ампициллина, одной колонией клеток BL21 DE3, преобразованных вектором Bla g 1, как описано в 1.3. Растут при 37 °C в течение ночи.
- На следующий день собирают клетки (OD600 ~ 1,5) путем центрифугирования при 6000 х г в течение 10 мин и повторно суспендировать в 2 л среды 2x YT, содержащей 100 мг / л ампициллина. Дайте клеткам расти в течение дополнительного 1 ч при 37 °C до OD600 > 0,6.
- Индуцируют экспрессию белка путем добавления 0,5 мМ IPTG. Перенесите клетки до 18 °C и высиживают в течение ночи.
- На следующий день собирают клетки, как описано в 2.2. Полученную ячейку гранулы можно заморозить и хранить при -20 °C.
- Гранулу повторного суспенда получают из 1 л культуры в 50 мл лизизного буфера (50 мМ Tris-HCl pH 8,5, 100 мМ NaCl), содержащего 1 таблетку ингибитора протеазы (или эквивалент) и 1 мкл нуклеазы бензоназы.
- Ячейки Lyse с помощью зондового ультразвукового аппарата (500 Вт, 20 кГц) настроены на мощность 30–50% в течение 4 мин с рабочим циклом 50%. Храните лисат в ледяной ванне во время ультразвуковой области.
- Центрифуга лисата при 45 000 х г в течение 20 мин. Отбросьте нерастворимую фракцию (гранулу).
- Удалить 28 мкл растворимого белка. Объедините с 7 мкл 5-кратного буфера SDS-PAGE и сохраните для анализа SDS-PAGE. Повторите этот шаг для фракций проточной, промывки и элюирования колонны GST до и после инкубации с TEV.
- Нанесите растворимые белки (супернатант) на колонку глутатионной смолы (~ 10 мл общего объема слоя), уравновешиваемую в PBS pH 7,4.
- Вымывайте любые несвязанные белки, используя 50 мл PBS.
- Elute GST-Bla g 1 с использованием 50 мл PBS, содержащего 10 мМ восстановленного глутатиона.
- Инкубировать элюированный белок с протеазой TEV 0,2 кЕД в течение ночи при 4 °C или комнатной температуре в течение 6 ч для удаления метки GST.
3. Эндогенное удаление липидов с помощью ВЭЖХ обратной фазы
- Соберите расщепленный Bla g 1 и сконцентрируйте его до ~2 мл с помощью центробежного фильтрующего блока с отсечкой молекулярной массы <10 кДа.
- Добавьте пробу <12 мл в верхнюю часть концентратора и открутите при 5000 х г в течение 10–15 мин в роторе с поворотным ковшом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем образца и скорость отжима будут варьироваться в зависимости от конкретного фильтра и типа используемого ротора. Перед использованием ознакомьтесь с документацией производителя.
- Добавьте пробу <12 мл в верхнюю часть концентратора и открутите при 5000 х г в течение 10–15 мин в роторе с поворотным ковшом.
- Загрузите концентрат в систему ВЭЖХ 250 x 10 мм, оснащенную реверсивной хроматографической колонкой C18, уравновешенной 97% буфером A (вода, 0,1% трифторуксусной кислоты) и 3% буфером B (ацетонитрил, 0,1% трифторуксусной кислоты).
ПРИМЕЧАНИЕ: Могут использоваться меньшие колонки, но белок, возможно, придется загружать и элюировать с использованием нескольких циклов, чтобы приспособиться к сниженной способности связывания. При выборе колонки убедитесь, что шарики смолы имеют размер частиц < 5 мкм и размер пор >200 Å, чтобы обеспечить эффективное разделение молекул размером с белок.
ВНИМАНИЕ: Трифторуксусная кислота является высококоррозионной и должна дозироваться в вытяжном капюшоне с использованием соответствующих СИЗ (т.е. нитриловых перчаток, лабораторного халата и защитных плат). Ацетонитрил является умеренно токсичным, летучим и легковоспламеняющимся, его следует использовать и дозировать в вытяжном капюшоне с использованием соответствующих СИЗ (т. Е. Нитриловых перчаток, лабораторного халата и защитных платков). - Elute Bla g 1 с использованием протокола, показанного в таблице 1 при скорости потока 1,5–4,0 мл/мин. Контролируйте процесс элюированием, используя флуоресцентное поглощение при 280 нм.
- Соберите и смешайте Bla g 1 фракции. Bla g 1 обычно элюируется при >74% буфера B, или ~34–40 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время элюирования будет немного варьироваться в зависимости от скорости потока или размера столбца. Собирайте фракции на основе A280 для достижения наилучших результатов.
- Соберите и смешайте Bla g 1 фракции. Bla g 1 обычно элюируется при >74% буфера B, или ~34–40 мин.
| Время (мин) | Буфер A (%) | Буфер B (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
Таблица 1: Протокол элюции для Bla g 1. Таблица, иллюстрирующая градиент элюирования, используемый при выделении Bla g 1 с помощью столбца C18 ВЭЖХ.
- Аликвотирование образца в стеклянные пробирки, заполняя пробирки более чем наполовину (~4 мл). Накройте трубки парафиновой пленкой и процедийте покрытие двумя отверстиями, чтобы обеспечить вентиляцию.
- Приготовьте отдельную аликвоту 1 мл (тестовую аликвоту). Это будет использоваться для определения ожидаемой урожайности.
- Заморозьте образцы и протестируйте аликвоту, поместив их в морозильную камеру при -80 °C на 1 ч или погружая в жидкий азот. В случае с более поздним, трубка должна поворачиваться непрерывно, чтобы избежать поломки пробирки из-за расширения жидкой фазы при замерзании.
- Высушите полученные делипидированные образцы белка с помощью лиофилизатора. Высушенный белок может храниться при 4 °C в течение нескольких месяцев в герметичном контейнере.
4. Восстановление Апо- и грузового Bla g 1
- Определите ожидаемый выход Bla g 1.
- Ресуспендированная лиофилизированная, делипидированная (пост-ВЭЖХ) тестовая аликвота в 5 мл буфера рефолдирования (50 мМ HEPES pH 7,4, 100 мМ NaCl, 2% DMSO).
- Нагрейте смесь на водяной бане (500 мл с 250 мл воды и перемешайте бар над конфоркой) до 95 °C. Вихревые растворы периодически и инкубируют при 95 °С в течение 0,5–1 ч.
- Отведите тепло и медленно дайте водяной бане выравняться до комнатной температуры (~1 ч). Отожженный белок может храниться в этой форме в течение ночи при 4 °C, если это необходимо.
- Пропустите отожженную смесь Bla g 1-липидов через шприцевой фильтр 0,22 мкМ для удаления твердых частиц.
- Буферный обмен фильтрованного белка 3x на PBS pH 7,4 с помощью центробежного фильтра с отсечкой 10 кДа, как описано в 3.1, для удаления остаточных свободных жирных кислот и органического растворителя.
- Оцените концентрацию белка с помощью анализа BCA или другого предпочтительного метода, такого как поглощение ультрафиолетовым излучением. Используйте это для определения ожидаемого выхода для оставшихся аликвот Bla g 1.
- Восстановленный Апо- или грузовой Bla g 1
- Resuspend Bla g 1 aliquots в буфере переворачивания, как описано в 4.1.1.
- Чтобы получить Apo-Bla g 1, повторите шаги 4.1.2–4.1.6 для получения желаемого выхода.
- Для загрузки Bla g 1 жирными кислотами готовят 20 мМ запаса растворов нужного груза жирных кислот в метаноле или ДМСО. Затем перейдите к шагу 4.2.5.
- Для загрузки Bla g 1 фосфолипидами подготовьте 10 мг/мл нужного груза в хлороформе внутри стеклянной пробирки.
- Выпарить хлороформ с получением липидной пленки. Добавьте PBS в пробирку для получения конечной концентрации фосфолипида 20 мМ.
ВНИМАНИЕ: Хлороформ вреден при вдыхании или проглатывании. Используйте в химическом вытяжном вытяжке или используйте респиратор, если имеется недостаточная вентиляция. Используйте нитриловые перчатки, лабораторное покрытие и очки при обращении. Перед использованием проконсультируйтесь с MSDS. - Регидратировать липидную пленку, нагревая ее выше температуры фазового перехода липидного груза и вихря до тех пор, пока раствор не станет мутным. Обратите внимание, что обработка ультразвуком может потребоваться для полного повторного суспендирования и регидратации некоторых грузов.
- Если требуется обработка ультразвуком, поместите пробирку в ультразвуковой аппарат для ванны (100 Вт, 42 кГц) и обжажайте ультразвуком на максимальной мощности до тех пор, пока груз не будет повторно суспендирован. Альтернативно, зондовый ультразвуковой аппарат (описанный в 2.6) может использовать мощность 10-20% с рабочим циклом 50%.
ВНИМАНИЕ: Ультразвук использует высокочастотные звуковые волны, которые могут повредить слух. Используйте шумоподавляющие СИЗ (беруши или глушители). Если возможно, поместите ультразвуковой аппарат внутрь звукопоглощающего шкафа или камеры.
- Выпарить хлороформ с получением липидной пленки. Добавьте PBS в пробирку для получения конечной концентрации фосфолипида 20 мМ.
- Добавьте желаемую жирную кислоту или фосфолипидный груз для получения 20-кратного молярного избытка лигандов по отношению к Bla g 1 на основе ожидаемого выхода, определенного в 4.1. Общий объем органического растворителя, добавленного на этой ступени, не должен превышать 2%. Вихрь для смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1 л Bl21 DE3 клеток обычно дает ~0,25–0,4 нмоль белка, что соответствует ~400 мкМ лиганда на трубку. - Отжиг белка, как описано в 4.1.
5. Подтверждение вывоза/погрузки фосфолипидного груза с помощью 31П-ЯМР
- Концентрировать образцы Апо- или грузового Bla g 1 до >100 мкМ с использованием центробежного фильтрующего блока, как описано в 3.1.
- Регидрат эталонного фосфолипида в буфере PBS до конечных концентраций 2, 1,5, 1, 0,5 и 0,25 мМ.
- Разбавлять образцы 1:1 холатным буфером (100 мМ Tris pH 8,0, 100 мМ NaCl, 10% мас./об.холата) до общего объема ~600 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Холат используется на этом этапе для полного извлечения и солюбилизации липидов из гидрофобной полости Bla g 1. Это гарантирует, что химическая среда, окружающая головные группы фосфолипида, согласуется между различными образцами, что позволяет проводить ее количественную оценку с использованием 31P-ЯМР. Применение холата может быть заменено хлороформом/метанолом, как описаноранее 15. - Получение 1D 31P-ЯМР спектров холат-солюбилизированных образцов Bla g 1 и эталонных стандартов фосфолипида с помощью широкополосного зонда.
ПРИМЕЧАНИЕ: 31P-ЯМР спектр, представленный в этой работе, был получен с использованием спектрометра 600 МГц. Однако предыдущие исследования, использующие аналогичные методы, показывают, что приемлемая чувствительность может быть достигнута при силе полей до 150-200МГц 15. - Обрабатывайте полученные данные с помощью соответствующего программного обеспечения16.
- Получение пиковой интенсивности с помощью предпочтительного программного обеспечения для просмотра ЯМР17.
- Сравните спектры Bla g 1 31P-ЯМР с спектрами, полученными для эталонных образцов фосфолипида, чтобы подтвердить удаление эндогенно связанных лигандов и/или связывание желаемых лигандов на основе химических сдвигов видимых пиков (или их отсутствия).
- Подтвердите полную стехиометрию связывания, сравнив пиковую интенсивность спектра Bla g 1 с эталонами фосфолипида.
6. Подтверждение складывания Bla g 1
- Подготовьте 0,5 мкМ образцов Bla g 1 в cd-буфере (100 мМ KH2PO4,буферный рН 7,5). Загрузите 2 мл образца в 10-миллиметровую CD-кювету с магнитной перемешиной.
- Измерите CD-спектр Bla g 1 для подтверждения восстановления вторичной структуры. Убедитесь, что напряжение фотоумножителя (PMT) не превышает рекомендаций производителя (обычно 1 кВ).
- Измерение сигнала CD от 260–200 нм при 25 °C с шагом данных 0,2 нм и скоростью сканирования 20 нм/с при времени интеграции данных 1 с.
- Увеличьте температуру в cd-ячейке с 25 °C до 95 °C со скоростью 0,5 °C/мин. Активируйте магнитный перемешивной стерженок, чтобы обеспечить равномерное повышение температуры по всему образцу.
- Монитор CD при 222 нм, снимая показания каждые 2 °C.
- Подгонка полученных данных к 2-стейтовой кривой Больцмана для определения температуры плавления. Из-за высокой стабильности Bla g 1 температура плавления (MT25)была определена как температура, при которой белок потерял 25% своего исходного CD при 222 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя аффинную хроматографию, рекомбинантный GST-Bla g 1 легко изолировали до высокого уровня чистоты(Рисунок 1A),получая выход ~ 2-4 мг / л клеточной культуры. Ночной инкубации с протеазой TEV при 4 °C достаточно для удаления метки GST, в результате получения конечного продукта при ~24 кДа. Обратите внимание, что в этом случае в проточной и промывной фракциях имеется значительное количество GST-Bla g 1, что говорит о превышении связующей способности смолы глутатиона. Использование большего количества смолы или нескольких циклов загрузки и элюдения образцов может обеспечить решение этой проблемы.
Применение Bla g 1 к столбцу C18 обратной фазы дает отличительный профиль элюирования(рисунок 1B)с двумя большими пиками при ~50% буфере B и вторым большим пиком при ~75% буфере B. Анализ полученных фракций SDS-PAGE предполагает, что первые соответствуют расщепленному тегу GST, в то время как последний соответствует Bla g 1. Иногда третий, меньший пик будет происходить в середине, соответствующий остаточному, нерасщепленным GST-Bla g 1. Присутствие этого нерасщепленного продукта может быть устранено путем увеличения количества TEV, используемого в реакции расщепления, или увеличения времени инкубации. В то время как неполное расщепление снизит выход, разделение, полученное на колонне C18, является достаточным для обеспечения чистоты конечного продукта Bla g 1 остается бескомпромиссной. Следствием обратнофазной ВЭЖХ является то, что конечный белковый продукт элюируется в среду органического растворителя. Хотя это облегчает удаление любых гидрофобных лигандов, требуется удаление этого растворителя путем лиофилизации, в результате которого дается пушистый белый порошок(рисунок 1C).
Отжиг белка требуется для воссоздания нативного Bla g 1 раза и может проводиться как при отсутствии, так и при наличии липидного груза. Добавление DMSO к высушенным грузам Bla g 1 и фосфолипидов перед буфером повторного свораживания облегчает процесс солюбилизации, хотя некоторые более длинные цепные липидные грузы не будут полностью растворяться даже при повышенных температурах. Однако это не повлияло на эффективность нагрузки среди липидов, протестированных в наших исследованиях(рисунок 1C). Аналогичным образом, избыток липидов часто выпадает в осадок из раствора или образует большие везикулы при охлаждении, что приводит к мутнечному виду после отжига(рисунок 1C). Это также не повлияло на эффективность загрузки, и любые агрегаты легко удаляются через этапы фильтрации и последующего буферного обмена, чтобы получить четкое, прозрачное решение. Несмотря на суровые условия, термолиза для Bla g 1 не наблюдалось.
Рисунок 1: Начальная очистка Bla g 1. (A)SDS-PAGE, показывающий растворимую белковую фракцию после начального лизиса (S); проточные (FT), промывки (W) и элюдение из глутатион-сефарозной колонны (E); и конечный продукт Bla g 1 после расщепления TEV метки GST (TEV). Профиль элюирования ВЭЖХ полученного продукта Bla g 1 после расщепления TEV показан в(B). A280 показан синим цветом, а градиент элюдации (% Buffer B) — зеленым. Фракции, соответствующие расщепленной метке GST (H1, H2), остаточной нерасщепленной GST-Bla g 1 (H3) и очищенной Bla g 1 (H4), обозначены красными стрелками при ~50%, ~65% и ~74% буфера B соответственно. SDS-PAGE анализ фракций H1-H4 показан в (A) и помечен соответствующим образом. (C)Репрезентативные изображения, показывающие Bla g 1 на различных этапах процесса отжига. Обратите внимание, что точность и степень образования осадков, как показано во ii и iii, зависит от типа используемого липидного груза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
31 31 P-ЯМР-спектры Apo-Bla g 1, очищенные таким образом, не показывают обнаруживаемых фосфолипидов ни с помощью ЯМР(рисунок 2А),ни с помощью тонкослойной хромотографии (данные не показаны). Напротив, аналогичные спектры, полученные для Bla g 1, нагруженного дистеароилфосфатидилхолином (DSPC) фосфолипидом, показывают сильный пик, соответствующий головной группе фосфатидилхолина. Для сравнения, репрезентативный 31P-ЯМР спектр Bla g 1, очищенный от рекомбинантной E. coli без использования протокола удаления/отжига липидов, описанного в настоящем описании (ecBla g 1), показывает гетерогенную смесь эндогенных липидов, извлеченных из рекомбинантной системы экспрессии(фиг.2B). Используя преимущества количественного характера ЯМР, стандартная кривая может быть получена с использованием эталонных образцов известных концентраций DSPC(рисунок 2C). Сравнение интенсивности сигнала 31P, полученного из DSPC-Bla g 1, с этой стандартной кривой дает стехиометрию связывания 4,7 ± 0,5 липидов на белок; значение, выгодное для сравнения с предсказанным стехиометрией полного связывания, полученной из исследований in silico и структурного анализа9. Обратите внимание, что этот метод будет обнаруживать только лиганды, которые содержат ядро 31P, такие как фосфолипиды, лизофосфолипиды, липополисахариды и т. Д. Однако этот протокол может быть легко адаптирован для анализа 13С-ЯМР. В этом случаеметил-13С, меченые жирными кислотами, будут рекомендованы из-за его благоприятных свойств релаксации ЯМР. Ограничение изотопной маркировки одним участком также облегчает спектральную интерпретацию, поскольку ожидается только один пик, одновременно снижая стоимость по сравнению с однородными 13аналогами, маркируемыми C. Альтернативным подходом было бы использование масс-спецификации для идентификации связанных лигандов, как показано в предыдущем исследовании, которое идентифицировало смесь жирных кислот как природный груз Bla g 1, выделенный из таракана frass (nBla g 1)9. Однако ограниченные количественные возможности массовой спецификации исключали точное измерение стехиометрии связывания без достаточных стандартов.
Рисунок 2: Проверка удаления липидов и загрузки Bla g 1. (A) 31P-ЯМР спектров Apo- (черного) или DSPC-нагруженного Bla g 1 (красный), приготовленный с использованием протокола отжига, описанного в этой работе, демонстрирующего полное удаление липидов в первом и однородную нагрузку фосфатидилхолиновых (PC) липидов, достигнутую во второй. Напротив, Bla g 1, очищенный от рекомбинантной E. coli без липидного удаления и отжига (ecBla g 1), показывает гетерогенную смесь эндогенного фосфатидилэтаноламина (PE) и фосфатидилглицерина (PG) липидов при анализе с использованием этого метода(B). Репрезентативная стандартная кривая, полученная из эталонных образцов DSPC известных концентраций, показана в(C),из которой может быть получена стехиометрия связывания Bla g 1. Рисунки адаптированы из Foo et al. (2019) и представлены под лицензией Creative Commons CC BYLicense 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Кристаллические структуры Bla g 1 выявляют уникальную складку, состоящую из 12 амфипатических альфа-хеликсов. Круговой дихроизм представляет собой быстрый и удобный метод оценки того, была ли эта складка успешно восстановлена после процесса отжига. Спектры CD для Apo- и липидных (nMix)-нагруженных Bla g 1 показывают минимумы ~220 и 210 нм, указывающие на преимущественно альфа-спиральную структуру(рисунок 3A). Этот спектр чрезвычайно похож на спектр, полученный для ecBla g 1 и nBla g 1, что является дополнительным доказательством того, что нативная структура Bla g 1 успешно восстановлена. Это было дополнительно подтверждено использованием 19F и 1H-15 N раствора-ЯМР, полное обсуждение которого доступно в другом месте9. Анализы тепловой денатурации на основе CD показывают кооперативную потерю альфа-спиральной вторичной структуры, указывая на складчатый шаровидный домен(рисунок 3B). Анализ результирующих температур плавления(рисунок 3C)показывает значительное увеличение при связывании лигандов nMix. Эта повышенная термостабильность соответствует той, которая рассчитана для nBla g 1, что указывает на то, что мы способны полностью воспроизвести естественное состояние Bla g 1. Обратите внимание, что ecBla g 1 также показывает аналогичное, если не большее усиление термостабильности, иллюстрируя потенциал остаточных эндогенно связанных липидов для вмешательства в биофизическую характеристику аллергенов, очищенных с использованием традиционных подходов, основанных на FPLC. Напротив, способность количественно удалять и перегружать гидрофобные грузы из аллергенов, таких как Bla g 1, обеспечивает уникальный способ изучения роли липидов в аллергической реакции. Здесь мы описываем метод изучения влияния липидных грузов на структуру, стабильность и эндосомальную обработку самих аллергенных белков, хотя можно рассмотреть и другие направления исследования.
Рисунок 3: Подтверждение успешного восстановления Bla g 1 раз. (A)CD-спектры Апо- (черного) или nMix-нагруженного (красного) Bla g 1 очищены и отожжены с использованием протокола, описанного в настоящем описании, с минимумами при ~220 и 210 нм, указывающими на преимущественно альфа-спиральную структуру, согласующуюся с имеющейся структурой рентгеновского кристалла. Спектры Bla g 1 с апо- и nMix-нагрузкой чрезвычайно похожи на спектры, полученные для Bla g1, очищенные от рекомбинантной E. coli (ecBla g 1, зеленый) или от ее естественного аллергенной источника (nBla g 1, синий) без протокола удаления и отжига липидов, что дополнительно поддерживает успешное восстановление нативной структуры в первом. (B)Репрезентативные тепловые профили для апо- (черный) и nMix-нагруженный (красный) Bla g 1, показывающие сигмоидальную кривую, индикативное кооперативное развертывание. nBla g 1 (синий) и ecBla g 1 (зеленый) показаны в качестве ссылки. Расчетные температуры плавления (МТ25)Bla g 1 показаны в (C). Связывание лигандов nMix (красный) приводит к значительному увеличению термостабильности относительно Apo-Bla g 1 (черный). Это отражает тенденцию, наблюдаемую для nBla g 1 (синий), предполагая, что мы можем успешно восстановить собственное состояние. Еще большая стабильность, наблюдаемая для ecBla g 1, подчеркивает потенциал эндогенно связанных липидов вмешиваться в биофизическую характеристику аллергенов. Значения MT25, представленные в C, представляют собой среднее значение, полученное по меньшей мере в трех независимых испытаниях. Полосы погрешности представляют соответствующие значения стандартного отклонения. Рисунки адаптированы из Foo et al. (2019) и представлены под лицензией Creative Commons CC BYLicense 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный в данной работе, был успешно применен для систематического изучения липидсвязывающих свойств Bla g 1. Это выявило корреляцию между связыванием груза, термостабильностью и эндосомальной обработкой, последняя из которых коррелировала со снижением генерации известного эпитопа Т-клеток с потенциальными последствиями для иммуногенности9,18. В дополнение к Bla g1, было показано, что другие аллергены, такие как Pru p 3 и Bet v 1, сохраняют свои эндогенно связанные грузы при очистке с использованием стандартных методов аффинности и размерно-эксклюзисной хроматографии13,19,20,21,22. Эти нежелательные гости могут аналогичным образом изменить биофизические и иммунологические свойства этих белков, подчеркивая необходимость методов обеспечения полной делипидации, таких как представленный здесь.
В то время как использование обратнофазной ВЭЖХ в очистке аллергенов было описаноранее 2,соединение его с протоколом термического отжига предоставляет довольно необычную возможность воссоздания аллергенов с помощью ряда природных и ненатуральных лигандов, позволяя пользователям исследовать липидно-аллергенные взаимодействия. Было установлено, что этот этап термической денатурации необходим для двух основных целей. Во-первых, термическая денатурация необходима для облегчения доступа лигандов к их связующим полостям, которые из-за их гидрофобной природы часто погребены вдали от водного растворителя9,22. Во-вторых, гидрофобные лиганды, такие как жирные кислоты и фосфолипиды, часто образуют более крупные супрамолекулярные структуры, такие как мицеллы или везикулы при помещении в водную среду. Концентрация мономерных, или «свободных» лигандов, доступных для связывания с белками, может быть аппроксимирована с использованием критической концентрации мицелл (CMC). DSPC и другие длинноцепочечные фосфолипиды имеют значения CMC в диапазоне nM, что указывает на то, что для связывания Bla g 1 практически нет свободных лигандов. Даже короткоцепочечные липиды и жирные кислоты имеют CMC в диапазоне от низких мкм до мМ, что указывает на то, что большая часть этих лигандов остается в мицеллярной или двухслойной фазе23. Однако высокие температуры, используемые в нашем протоколе денатурации, рассеивают эти более крупные агрегаты, облегчая связывание. Предыдущие исследования обычно использовали длительные инкубационные периоды для облегчения этого процесса. Однако отсутствие процесса термической денатурации/отжига вызывает сомнения в эффективности нагрузки. Например, инкубация аллергена клеща Der p 5 с флуоресцентной жирной кислотой аналогом 11-(Данзиламино)ундеканоевой кислотой (DAUDA) дала стехиометрию связывания 0,66, несмотря на обладание большой гидрофобной полостью наравне с Bla g 124. Аналогичным образом, было обнаружено, что специфичность связывания и стехиометрия нсТМП растений сильно варьируются в зависимости от того, солюбилизируются ли липиды и белок в метаноле до добавления водного буфера, что указывает на то, что доступность лиганда и/или сайта связывания была ограничивающим фактором25.
В дополнение к Bla g 1, мы успешно применили ту же стратегию к нескольким другим белкам домена MA от тараканов и комаров(A. aegypti),а также Der p 2 (данные не показаны). Мы отметили, что и гомологи Bla g 1, и Der p 2 элюируются в разное время, чем Bla g 1 из столбца C18 (шаг 3.3). Градиенты элюдения на этом этапе, возможно, потребуется оптимизировать для других белков. Альтернативно, могут использоваться колонны ВЭЖХ с менее гидрофобной стационарной фазой (например, C8), хотя в случае Bla g1 повышенная гидрофобность колонны C18 была необходима для полного удаления диацилфосфолипидных загрязнителей из ecBla g 1. Несмотря на различия в биофизических и биохимических свойствах, мы обнаружили, что этот протокол чрезвычайно надежен и может быть легко применен к другим аллергенным белкам. В то время как суровые условия могут представлять потенциальное ограничение, повышенная устойчивость, наблюдаемая для многих аллергенов, снижает его воздействие26,27. Действительно, было замечено, что некоторые пищевые и ингаляционные аллергены, такие как Der p 2, Ber e 1, Ara a 6 и Lep w 1, восстанавливают свою структуру и иммуногенность после термической денатурации, хотя оптимизация буферных условий может потребоваться28,29,30,31,32,33; например, обратимая денатурация nsLTP (Cor a 8) и тауматинов (Mal d 2 и Act d 2) наблюдается только в кислых (рН <4) условиях28,30,31. Кроме того, следует отметить, что авторы не пытались оптимизировать ни сроки, ни температуры, используемые в протоколе отжига. Возможно, что солюбилизация лигандов и сворачивание/развертывание белка могут быть достигнуты с использованием более низкой максимальной температуры, как это видно с Ber e 1, для которой обратимая денатурация достигается при 82 °C29. Ожидается, что использование таких мер расширит спектр аллергенов, к которым может применяться этот протокол.
Другим важным соображением при адаптации этого протокола к другим системам аллергенов является концентрация лигандов, необходимых в процессе отжига. В случае Bla g 1 ожидаемый выход составляет ~0,25–0,4 мкмоль белка на 1 л клеточной культуры. Учитывая продемонстрированную стехиометрию связывания 8 жирных кислот или 4 липидов диациловой цепи на аллерген, было использовано 20-40-кратное молярное превышение груза (5-10 мкмоль). Следует отметить, что липидсвязывающая способность Bla g 1 и его гомологов уникальна; например, nsLTP обычно связывают не более двух липидных лигандов25, в то время как липокалины имеют менее 1 стехиометрии34. Таким образом, полная загрузка этих типов аллергенов может быть выполнена с меньшим избытком лигандов. Последним соображением при адаптации этого протокола к другим системам аллергенов является наличие дисульфидных связей, которые могут быть проблематичными, если они не сформированы должным образом до денатурации. Одним из возможных подходов было бы проведение процесса отжига в присутствии восстановителя, такого как 2 мМ DTT. Нативные дисульфидные связи могут быть впоследствии повторно сформированы путем добавления восстановленного и окисленного глутатиона, как описано для фрагмента аллергена арахиса, изученного Aalberse et al.35. В этом случае восстановление правильной дисульфидной связи должно быть эмпирически оценено масс-спектрометрией35.
В этой работе мы описываем технику, с помощью которой аллергены могут быть делипидированы и повторно отожжены различными фосфолипидными и жирными кислотными грузами. Тем не менее, существует много других классов потенциально иммуногенных или адъювентизирующих лигандов, присутствующих в общих резервуарах аллергенов. Например, было предложено, чтобы аллергены кошек, собак и клещ связывали липополисахариды (ЛПС) и другие бактериальные липиды из домашней пыли36,в то время как Bet v 1, как было показано, извлекает сложные флавоноиды из пыльцевой матрицы13. Протокол, описанный в этой работе, может быть легко адаптирован для более подробного изучения роли этих липидов. В качестве доказательства концепции мы смогли продемонстрировать, что гидрофобная полость Bla g 1 способна связывать липотейхоевую кислоту (LTA) из клеточных стенок грамположительных бактерий, но исключает ЛПС из грамотрицательных видов, потенциально отражая большее количество ацильных цепей в последних9. Сделав еще один шаг вперед, можно использовать протокол термической денатурации / отжига для включения флуоресцентных зондов и других неестественных аналогов жирных кислот в белки аллергенов. Действительно, мы смогли загрузить гидрофобную полость гомолога комара Bla g 1 с помощью DAUDA, открыв дополнительные возможности для изучения влияния липидных лигандов на аллергенные заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Тома Кирби, Скотта Габеля и д-ра Роберта Лондона за их помощь и содействие на протяжении всей этой работы, а также д-ра Боба Петровича и Лори Эдвардс за использование их инструментов и их помощь в создании конструкций Bla g 1, используемых в этом исследовании. Мы благодарим Андреа Адамс за помощь в масс-спектрометрии и доктора Юджина ДеРоуза за помощь с приборами ЯМР. Это исследование было поддержано Программой внутренних исследований NIH, Национальным институтом наук о здоровье окружающей среды, Z01-ES102906 (GAM). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национального института наук о гигиене окружающей среды.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
