Удаление и замена эндогенных лигандов из липид-связанных белков и аллергенов

Summary

Этот протокол описывает удаление эндогенных липидов из аллергенов и их замену указанными пользователем лигандами посредством обратнофазной ВЭЖХ в сочетании с термическим отжигом. ^{31 31} P-ЯМР и круговой дихроизм позволяют быстро подтвердить удаление/нагрузку лиганда и восстановление нативной структуры аллергена.

Abstract

Многие основные аллергены связываются с гидрофобными липидоподобными молекулами, включая Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 и Fel d 1. Эти лиганды сильно сохраняются и могут влиять на процесс сенсибилизации либо путем прямой стимуляции иммунной системы, либо путем изменения биофизических свойств аллергенного белка. Для контроля этих переменных требуются методы удаления эндогенно связанных лигандов и, при необходимости, замещения липидами известного состава. Аллерген таракана Bla g 1 заключает в себе большую гидрофобную полость, которая связывает гетерогенную смесь эндогенных липидов при очистке с использованием традиционных методов. Здесь мы описываем способ, с помощью которого эти липиды удаляются с использованием обратнофазной ВЭЖХ с последующим термическим отжигом с получением Bla g 1 в его Апо-форме или перезагружается пользовательской смесью жирных кислот или фосфолипидных грузов. Соединение этого протокола с биохимическими анализами показывает, что грузы жирных кислот значительно изменяют термостабильность и протеолитическую устойчивость Bla g 1, что имеет последующие последствия для скорости генерации эпитопа Т-клеток и аллергенности. Эти результаты подчеркивают важность протоколов удаления/перезагрузки липидов, таких как описанный в настоящем описании, при изучении аллергенов как из рекомбинантных, так и из природных источников. Протокол обобщается на другие семейства аллергенов, включая липокалины (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) и Утероглобин (Fel d 1), обеспечивая ценный инструмент для изучения роли липидов в аллергической реакции.

Introduction

Исследование базы данных аллергенов показывает, что аллергены встречаются только в 2% всех известных семейств белков, предполагая, что общие функциональные и биофизические свойства способствуют аллергенности^1. Из этих свойств способность связывать липидные грузы, по-видимому, сильно перепредставлена среди аллергенов, что позволяет предположить, что эти грузы могут влиять на процесс сенсибилизации^1. Действительно, было показано, что аллерген бразильского ореха Ber e 1 требует совместного введения с его эндогенным липидом для реализации его полного сенсибилизирующего потенциала^2. Эти липиды могут по....

Protocol

1. Bla g 1 клонирование

1. Получают ген таракана аллерген Bla g 1.0101 (остатки 34-216), представляющий собой единый повтор домена МА. Для простоты Bla g 1 будет использоваться на протяжении всей работы, чтобы представить этот единственный повтор, а не всю стенограмму Bla g 1.0101.
2. Субклон ген Bla g 1 в нужный вектор. В этом исследовании ген, содержащий N-концевую метку глутатион-S-трансферазы (GST), связанную с участком расщепления протеазы вируса травли табака (TEV), был вставлен в вектор pGEX для экспрессии, как описано^{ранее 11.}
3. Преобразуйте вектор Bla g 1 pGEX в ячейки BL21 DE3 E. coli.

Results

Используя аффинную хроматографию, рекомбинантный GST-Bla g 1 легко изолировали до высокого уровня чистоты(Рисунок 1A),получая выход ~ 2-4 мг / л клеточной культуры. Ночной инкубации с протеазой TEV при 4 °C достаточно для удаления метки GST, в результате получения конечного продукта при ~24 кДа. Обратите внимание, что в этом случае в проточной и промывной фракциях имеется значительное количество GST-Bla g 1, что говорит о превышении связующей способности смолы глутатиона. Использование большего количеств.......

Discussion

Протокол, описанный в данной работе, был успешно применен для систематического изучения липидсвязывающих свойств Bla g 1. Это выявило корреляцию между связыванием груза, термостабильностью и эндосомальной обработкой, последняя из которых коррелировала со снижением генерации известного эпитопа Т-клеток с потенциальными последствиями для иммуногенности^9,18. В дополнение к Bla g1, было показано, что другие аллергены, такие как Pru p 3 и Bet v 1, сохраняют свои эндог.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bla g 1 Gene	Genescript	N/a	Пользовательский сервис синтеза генов. GenBank Accession no AF072219 Остатки 34-216
Affinity очищенный натуральный Bla g 1 (nBla g 1)	Внутренние биотехнологии	Н/д Индивидуальный	заказ
Agilent 1100 Series HPLC System	Agilent	G1315B, G1311A, G1322A	УФ-детектор, насос и дегазатор
Agilent DD2 600 МГц спектрометр	Agilent	N/a
Amicon Ultra-15 Центробежный фильтрующий блок	Amicon	UFC-1008
Ампициллин	Fisher Scientific	BP1760-5
Бензоназа	Sigma-Aldrich	E1014-5KU
Широкополосный 5 мм Z-градиентный зонд	Varian	N/a
ChemStation для LC (Программное обеспечение)	Agilent	N/a
cOmplete Mini Ингибитор протеазы Коктейль	Roche	11836153001
Дистеароилфосфатидилхолин (18:0 шт)	Avanti Polar Lipids	850365C
E. Coli BL21 DE3 Cells	New England Biolabs	C2530H
Freezone 4.5 Система сублимационной сушки	Labconco	7750000
Глутатион смола		Genescript L00206
Глутатион, сниженный	научный	BP25211
ФишераИзопропил-&бета;-D-тиогалактопиранизид (IPTG)	Fisher Scientific	34060
Jasco  CD спектрополяриметр	Jasco	J-815
Millex Шприцевой фильтрующий блок	EMD Millipore	SLGS033SS
NMRПипе (программное обеспечение)	Delaglio et al.	N/a	Delaglio, F. et al. Nmrpipe - многомерная система спектральной обработки на основе Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277– 293 (1995).
NMRViewJ (Программное обеспечение)	Johnson et al.	Н/а	Джонсон, Б. А. и Блевинс, Р. А. ЯМР Взгляд: Компьютерная программа для визуализации и анализа данных ЯМР. J. Biomol. NMR 4, 603– 614 (1994).
Олеиновая кислота	Sigma-Aldrich	O1008
Пирс BCA Анализ белка	Sigma-Aldrich	BCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10,0 мм Колонка ВЭЖХ	Agilent	Артикул: A2000250X100
SD-200 Вакуумный насос	Varian	VP-195
Гидрат холата натрия	Sigma-Aldrich	C6445
Пальмитат	натрияSigma-Aldrich	P9767
Стеарат натрия	Sigma-Aldrich	S3381
vnmrJ (программное обеспечение)	Varian	N/a