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Immunology and Infection

न्यूजीलैंड व्हाइट रैबिट्स(ओरेक्टोलागस क्यूनिकुलस)में मातृ प्रतिरक्षण के अध्ययन में इंट्रानासल प्रतिरक्षण और दुग्ध संग्रह

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

यह लेख इंट्रानासल टीकों के प्रशासन और स्तनपान कराने वाले खरगोशों(ओरिक्टोलगस क्यूनिकुलस)से दूध के संग्रह को मातृ प्रतिरक्षण के एक अनुवादीय उपयुक्त मॉडल में म्यूकोसल प्रतिरक्षा का आकलन करने के साधन के रूप में दर्शाता है।

Abstract

मनुष्यों के साथ अपरा और एंटीबॉडी हस्तांतरण में समानताओं के कारण, खरगोश मातृ प्रतिरक्षण का एक उत्कृष्ट मॉडल हैं। इस शोध मॉडल के अतिरिक्त लाभ प्रजनन और नमूना संग्रह, अपेक्षाकृत कम गर्भावधि, और बड़े कूड़े के आकार में आसानी है। प्रतिरक्षण के आमतौर पर मूल्यांकन मार्गों में चमड़े के नीचे, इंट्रामस्कुलर, इंट्रानसल और इंट्राडरमल शामिल हैं। इन प्रतिरक्षण के लिए इम्यूनोलॉजिक प्रतिक्रियाओं का कालक्रम का पता लगाने के लिए गैर-सूक्ष्म नमूना संग्रह में बांधों और किट दोनों से रक्त का संग्रह और स्तनपान कराने वाले दूध शामिल हैं। इस लेख में, हम उन तकनीकों को प्रदर्शित करेंगे जो हमारी प्रयोगशाला ने न्यूजीलैंड व्हाइट खरगोशों(ओरेक्टोलागस क्यूनिकुलस)में मातृ प्रतिरक्षण के अध्ययन में उपयोग किया है, जिसमें इंट्रानासाल प्रतिरक्षण और दुग्ध संग्रह शामिल हैं।

Introduction

मातृ प्रतिरक्षण और एंटीबॉडी हस्तांतरण के अध्ययन कई कारणों से अमूल्य हैं, क्योंकि यह प्रतिरक्षा हस्तांतरण और नवजात शिशुओं और शिशुओं में रोगजनकों और रोगों से बाद में सुरक्षा का प्रारंभिक मार्ग है । मातृ प्रतिरक्षण में इस कमजोर अवधि केदौरानकुछ रोगजनकों से जुड़ी रुग्णता और मृत्यु दर को कम करके वैश्विक स्तर पर मातृ और शिशु / बाल स्वास्थ्य दोनों को सकारात्मक रूप से प्रभावित करने की क्षमता है । इस रणनीति का मुख्य लक्ष्य गर्भावस्था के दौरान विशिष्ट मातृ एंटीबॉडी के स्तर को बढ़ाना है। इसके बाद इन एंटीबॉडी को नवजात शिशु और शिशु को संक्रमण से बचाने के लिए पर्याप्त स्तर पर स्थानांतरित किया जा सकता है , जब तक कि उनकी प्रतिरक्षा प्रणाली पर्याप्त रूप से परिपक्व न हो जाए कि वे चुनौतियों का पर्याप्त रूप से जवाब दे सकें1,2,3. पिछले काम ने दिखा दिया है कि जन्म के समय उच्च एंटीबॉडी टाइटर्स या तो पूर्ण सुरक्षा या देरी से शुरू होने वाले और नवजात शिशु में कई विभिन्न संक्रामक रोगों की कम गंभीरता से जुड़े होते हैं, जिनमें टिटनेस, पर्टुसिस, श्वसन सिंक्टियल वायरस (आरएसवी), इन्फ्लूएंजा और ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकोकल संक्रमण1,2,3शामिल हैं।

मनुष्यों में, मातृ एंटीबॉडी अपरा भर में निष्क्रिय रूप से स्थानांतरित कर रहे है और यह भी नर्सिंग के माध्यम से स्तन दूध के माध्यम से स्थानांतरित कर रहे हैं । पिछले काम से पता चला है कि वायरस से संक्रमित माताओं से मानव स्तन के दूध में एचआईवी विशिष्ट IgA स्तर वायरस के कम प्रसवोत्तर संचरण के साथ जुड़े थे, स्तन दूध विरोधी एचआईवी IgA4के लिए एक सुरक्षात्मक भूमिका का सुझाव । अमानवीय वानरों के अध्ययनों से पता चला है कि एचआईवी के खिलाफ प्रतिरक्षण स्तन के दूध में एक महत्वपूर्ण एंटीबॉडी प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकता है, और हालांकि इसी तरह के सीरम आईजीजी प्रतिक्रियाओं को प्रणालीगत बनाम म्यूकोसल प्रतिरक्षण के बाद प्रेरित किया गया था, म्यूकोसल प्रतिरक्षण ने दूध5,6केभीतर काफी अधिक आईजीए प्रतिक्रिया को प्रेरित किया।

इन अध्ययनों के लिए एक अनुवाद उपयुक्त पशु मॉडल की पहचान करने के लिए निष्क्रिय एंटीबॉडी हस्तांतरण के अपरा प्रकार और तंत्र को ध्यान में रखना चाहिए, साथ ही स्तन के दूध के माध्यम से एंटीबॉडी का हस्तांतरण करना चाहिए। मातृत्व-भ्रूण इंटरफेस पर ऊतक प्रकार और परतों के आधार पर स्तनधारियों में तीन मुख्य प्रकार के अपराकरण होते हैं, जिनमें हीमोकोरियल (वानरों, कृंतक और खरगोश), एंडोथेलियोपोरियल (मांसाहारी), और एपिथेलियोकोरियल (घोड़े, सूअर और जुगाली) शामिल हैं। हीमोकोरियल प्लेसेंटा सबसे आक्रामक प्रकार है, जो मातृ रक्त आपूर्ति और कोरियोन, या सबसे बाहरी भ्रूण झिल्ली के बीच सीधे संचार की अनुमति देता है। ट्रोफोब्लास्ट परतों की संख्या के आधार पर, हेमोकोपोरियल प्लेंटेशन के कई रूप हैं, जिनमें वानरों में पाए जाने वाले हीमोमोनोकोरियल प्लेसेंटा, खरगोशों में हीमोडिकोरियल प्लेसेंटा, और चूहों और चूहों में मनाया जाने वाला हीमोट्रिकोरियल प्लेसेंटाशामिलहै। मातृ रक्त की आपूर्ति और कोरियोन के बीच यह सीधा संपर्क गर्भ के दौरान प्लेसेंटा में एंटीबॉडी के निष्क्रिय हस्तांतरण के लिए अनुमति देता है। आईजीजी एकमात्र एंटीबॉडी वर्ग है जो मानव नाल8को काफी हद तक पार करता है , जबकि आईजीए मानव स्तन केदूधमें पाए जाने वाले आईजी का प्रमुख वर्ग है । वैज्ञानिक रूप से प्रासंगिक मॉडलों में से, केवल वानरों (मनुष्यों सहित), खरगोश, और गिनी सूअर दूध10, 11 में गर्भाशय और आईजीए में आईजीजी स्थानांतरित करतेहैं। इसलिए, खरगोश मॉडल में मनुष्यों के उन कारकों के बराबर कारक शामिल हैं जो आईजीआई के ट्रांसप्लेसेंटल हस्तांतरण और आईजीए के स्तनपानल हस्तांतरण को नियंत्रित करते हैं।

मातृ प्रतिरक्षा और टीका विकास के लिए एक असाधारण मॉडल के रूप में सेवा करने के अलावा, खरगोश और मानव नाक गुहाओं के बीच समानताएं उन्हें इंट्रानासाल प्रतिरक्षण के लिए एक उपयुक्त मॉडल बनाती हैं। खरगोश नाक गुहा की मात्रा12के सापेक्ष शरीर द्रव्यमान के आधार पर कृंतक मॉडल की तुलना में मनुष्यों के समान है । इसके अतिरिक्त, कास्टेलियन एट अल 12 ने दिखाया कि नाक से जुड़े लिम्फोइड ऊतक (NALT) कृंतक की तुलना में खरगोश में अधिक मोटा है। एनएएलटी मुख्य रूप से वेंट्रल नाक मीटस के वेंट्रल और वेंट्रोमेडियल पहलू पर और खरगोशों में नासोफेरिंजियल मीटस के पार्श्व और डोरसोलेटरल पहलू पर स्थित है, जबकि कृंतक में, लिम्फोइड ऊतक केवल नासोफेरिंजियल मीटस12के वेंट्रल पहलू के साथ मौजूद है। खरगोशों में, इंट्रापिथेलियल और लैमिना प्रोप्रिया लिम्फोसाइट्स की संरचना और स्थान, साथ ही अलग लिम्फोइड रोम, मनुष्यों के समान हैं12।

मातृ और म्यूकोसल प्रतिरक्षा के लिए एक मॉडल के रूप में खरगोश का उपयोग करने के अतिरिक्त लाभों में उनकी उच्च मलखंभ और अपेक्षाकृत कम गर्भावधि शामिल है। बड़े ऑरिकुलर रक्त वाहिकाएं धारावाहिक संग्रह के लिए रक्त की बड़ी मात्रा तक अपेक्षाकृत आसान पहुंच की अनुमति देती हैं। एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रिया परख के लिए विभिन्न प्रकार के म्यूकोसल नमूने एकत्र किए जा सकते हैं, जिसमें स्तन का दूध13 (स्तनपान करते समय), म्यूकोसल स्राव या वॉश (जैसे, मौखिक14, 15,16,ब्रोनचोलवेलर लावगे13,17,18,19,योनि20, 21,22)और मल20,23,24,25शामिल हैं । एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की उपस्थिति का आकलन करने के लिए स्तनपान के दौरान दूध के नमूनों को आसानी से एकत्र किया जा सकता है। हालांकि मनुष्यों और चूहों के लिए प्रचुर मात्रा में नहीं है, लेकिन खरगोश-विशिष्ट अध्ययनों और परखों के लिए विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक अभिकरने वाले उपलब्ध हैं। इस लेख में, हम न्यूजीलैंड व्हाइट खरगोशों(ओरेक्टोलागस cuniculus)में इंट्रानासाल प्रतिरक्षण और दूध संग्रह का वर्णन और प्रदर्शन करेंगे।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी और ड्यूक विश्वविद्यालय IACUC नीतियों के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

नोट: आवश्यक सामग्री सामग्री की तालिकामें प्रदान की जाती हैं ।

1. खरगोश सेशन और संज्ञाहरण

  1. मादा खरगोश (यौन परिपक्व; लगभग 5-30 महीने पुराना) 1 मिलीग्राम/किलो की खुराक पर एसेप्रोमाजिन इंट्रामस्क्युलरली (आईएम) का प्रशासन करके बेहोश करें । जानवर के आकार के आधार पर, 25 जी सुई के साथ 1 या 3 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। एपेक्सियल मांसपेशियां इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन की पसंदीदा साइट हैं।
    नोट: Acepromazine भी चमड़े के नीचे प्रशासित किया जा सकता है, लेकिन आईएम प्रयोगशाला द्वारा पसंद किया जाता है, क्योंकि यह अधिक तेजी से कार्य करता है और त्वचा के घावों की घटनाओं को कम कर देता है ।
  2. एसेप्रोमाज़ीन को प्रभावी होने की अनुमति देने के लिए 10-15 मिनट प्रतीक्षा करें।
  3. जानवर की नाक के ऊपर जुड़े नाक शंकु रखकर आइसोफ्लुन के साथ खरगोश को एनेस्थेटाइज करें। वाष्पीकरण को 4 लीटर/मिनट ऑक्सीजन के साथ संयुक्त 4% आइसोफ्लारेन तक समायोजित करें। खरगोशों में आइसोफ्लुरेन के लिए एक उच्च घृणा होती है, इसलिए जानवर को मास्क करते समय पर्याप्त संयम आवश्यक है।
  4. एक बार पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड, जैसा कि पिन्ना, पेडल, और/या पालपेब्रल पलटा द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, तो आंखों के सूखने और बाद में कॉर्नियल अल्सर को रोकने के लिए प्रत्येक आंख पर नेत्र स्नेहक लागू करें ।
  5. एनेस्थीसिया के दौरान लगातार सजगता और सांस लेने की निगरानी करें, और एनेस्थीसिया के पर्याप्त विमान तक पहुंच जाने के बाद आइसोफ्लुन दर को 1-2% तक कम कर दें।

2. इंट्रानासाल प्रतिरक्षण

  1. पशु हैंडलिंग से पहले प्रतिरक्षण समाधान तैयार करें।
  2. खरगोश को ऊपर वर्णित के रूप में बेहोश करें।
  3. एक बार जब प्रयोगशाला सदस्य वैक्सीन को प्रशासित करने के लिए तैयार हो जाता है और खरगोश संज्ञाहरण के पर्याप्त विमान में होता है, तो आइसोफ्लुन और ऑक्सीजन बंद कर दें और नाक शंकु को हटा दें।
  4. खरगोश को पृष्ठीय प्रतिनवता में रखें, और गर्दन और सिर को लगभग 45 डिग्री कोण पर सहारा दें जो वैक्सीन का प्रशासन करने वाले प्रयोगशाला सदस्य द्वारा दोनों नार्स की आसान पहुंच और दृश्य की अनुमति देता है।
  5. पिपेट को वैक्सीन समाधान के 100 से अधिक माइक्रोल के साथ लोड करें, और प्रत्येक नथुने में समाधान को जल्दी से प्रशासित करें। पिपेट को लगभग 45 डिग्री कोण पर आयोजित किया जाना चाहिए, जो नाक मार्ग के मध्यीय पहलू की ओर कोण में है।
    नोट: प्रतिरक्षण का लक्ष्य नार्स की म्यूकोसल झिल्ली से संपर्क करने के समाधान के लिए है, इसलिए टिप को नार्स के भीतर नहीं रखा जाना चाहिए, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप म्यूकोसल ऊतकों का घर्षण या जलन हो सकती है और संभावित रूप से एनसैली-प्रशासित वैक्सीन की इम्यूनोजेनिसिटी को प्रभावित किया जा सकता है। टीका जल्दी से प्रशासित किया जाना चाहिए और दूसरे नार्क में एक ही तरीके से किया जाना चाहिए।
  6. दोनों नाक मार्ग में प्रशासन के बाद, टीका समाधान के रिसाव को कम करने के लिए 30 सेकंड के लिए पृष्ठीय प्रतिनंदन में खरगोश को बनाए रखें।
    नोट: प्रयोगशाला आम तौर पर एक समय में नथुने प्रति १०० μL से अधिक नहीं प्रशासन होगा । यदि एक बड़ी मात्रा प्रशासित किया जाना है, ५०० μL की अधिकतम कुल के साथ, टीका प्रतिरक्षण के बीच एक 30 सेकंड आराम अवधि के साथ १०० μL aliquots में दिया जा सकता है, और टीके के अतिरिक्त प्रशासन दोहराया, प्रत्येक प्रशासन के बीच आराम के 30 सेकंड के साथ, जब तक कुल वैक्सीन की मात्रा दिया जाता है ।
  7. प्रतिरक्षण के बाद, खरगोश को वसूली के लिए वेंड्रम पर रखें और जानवर की बारीकी से निगरानी करें जब तक कि यह स्टर्नल रेक्यूम्बेंसी बनाए नहीं रख सके।

3. दुग्ध संग्रह

  1. स्तनपान कराने वाले खरगोश को ऊपर वर्णित रूप से बेहोश करें।
  2. शराब झाड़ू/पोंछ के साथ सीमांत कान नस पर त्वचा को साफ करें ।
  3. 1 एमएल सिरिंज और 25 ग्राम सुई का उपयोग करके, दूध अपमान को प्रेरित करने के लिए सीमांत कान नस के माध्यम से ऑक्सीटोसिन के लगभग 1-2 आईयू को नसों के माध्यम से प्रशासित करें।
    नोट: चिकनी मांसपेशियों में छूट के कारण, खरगोश के लिए ऑक्सीटोसिन के प्रशासन के बाद पेशाब या शौच करना आम बात है।
  4. ऑक्सीटोसिन प्रशासन के बाद, धुंध के टुकड़े के साथ इंजेक्शन साइट पर दबाव लागू करें।
  5. खरगोश की नाक पर संज्ञाहरण मुखौटा बनाए रखते हुए, खरगोश को अपने हिंदक्वार्टर पर सहारा दें।
    नोट: दूध संग्रह भी पार्श्व recumbency में जानवर के साथ किया जा सकता है, लेकिन प्रयोगशाला पाता है कि संग्रह आसान है जब खरगोश एक सहायक संज्ञाहरण मुखौटा के साथ खरगोश सीधे पकड़े के साथ अपने दुम पर खड़ा है ।
  6. दूध संग्रह के लिए तैयार करने और स्तन ऊतक और संबद्ध टीट्स का पता लगाने के लिए बाँझ ट्यूब खोलें। टीट्स आम तौर पर हाल ही में नर्सिंग से गीले फर से घिरे होते हैं, और दूध से भरे होने पर स्तन ऊतक आसानी से स्पष्ट हो जाता है।
  7. अंगूठे और तर्जनी के बीच एक टीट से जुड़े स्तन ऊतक को पकड़ें और टीट की दिशा में ग्रंथि ऊतक के लिए एक सौम्य, मालिश दबाव लागू करें। व्यक्त दूध इकट्ठा करने के लिए सागौन के ऊपर संग्रह ट्यूब रखें।
    नोट: यह कभी कभी ऑक्सीटोसिन प्रभावी होने के लिए कई मिनट लग सकते हैं, और दूध उत्पादन स्तन ग्रंथियों के बीच बदलती प्रतीत होता है। यदि दूध की अभिव्यक्ति सफल नहीं होती है, तो कई मिनट प्रतीक्षा करें या अतिरिक्त स्तन ग्रंथियों के चारों ओर घुमाएं। सभी टीट्स से दूध एक ही शीशी में एकत्र किया जा सकता है। आमतौर पर, दूध के कई मिलीलीटर आसानी से एक स्तनपान कराने वाले डो से एकत्र किया जा सकता है।
  8. दूध संग्रह के बाद, आइसोफ्लुरेन और ऑक्सीजन को बंद कर दें, और खरगोश को तब तक बारीकी से निगरानी करते हुए ठीक होने की अनुमति दें जब तक कि जानवर स्टर्नल रेक्यूम्बेंसी को बनाए रखने में सक्षम न हो जाए।

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Representative Results

एक ठेठ मातृ इंट्रानासाल प्रतिरक्षण अध्ययन डिजाइन का अवलोकन चित्र 1में चित्रित किया गया है, जिसमें प्रतिरक्षण, प्रजनन, जलाने, स्तनपान और एंटीबॉडी हस्तांतरण को शामिल किया गया है। हालांकि सचित्र नहीं है, रक्त बेसलाइन माप के लिए प्रारंभिक प्रतिरक्षण से पहले और नियमित अंतराल पर अध्ययन के शेष भर में एकत्र किया जाना चाहिए । हल्के सेडेशन और एक सामयिक एनाल्जेसिक एजेंट (जैसे, लिडोकेन 2.5% और प्रिलोकेन 2.5% क्रीम) के साथ केंद्रीय कान धमनी के माध्यम से रक्त आसानी से प्राप्त किया जाता है। इन नमूनों में एंटीजन-विशिष्ट आईजीजी स्तरों की उपस्थिति को मापा जा सकता है। महिला खरगोशों इंट्रानासल मार्ग के माध्यम से प्रतिरक्षित कर रहे हैं, के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है और वीडियो में प्रदर्शन किया । अध्ययन के आधार पर, वैक्सीन को बढ़ावा देने की आवश्यकता हो सकती है या एक अतिरिक्त मार्ग (जैसे, इंट्रामस्कुलर या चमड़े के नीचे) के माध्यम से दिए जाने की आवश्यकता हो सकती है। अध्ययन दीक्षा के बाद, खरगोश पैदा होते हैं; हम इन अध्ययनों के लिए एक उच्च गर्भावस्था दर सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने के लिए विक्रेताओं से सिद्ध प्रजनक खरीदना पसंद करते हैं। प्रतिरक्षण समय रेखा के आधार पर, खरगोशों को गर्भावस्था के दौरान अतिरिक्त प्रतिरक्षण प्राप्त हो सकता है। एंटीजन-विशिष्ट आईजीजी को किट में स्थानांतरित कर दिया जाता है, और प्रजनन के बाद लगभग 30-32 दिनों में, गर्भवती जलाना होगा। हम पहले कई दिनों के लिए किट की हैंडलिंग सीमित करने के लिए करता है से अस्वीकृति को कम करने की सलाह देते हैं । एंटीजन-विशिष्ट आईजीजी स्तरों का आकलन करने के लिए किट से रक्त नमूने एकत्र किए जा सकते हैं जिन्हें ट्रांसप्लेसेंटली(चित्रा 3)स्थानांतरित किया गया था। पोषक तत्वों की एक विस्तृत विविधता के अलावा, किट स्तनपान कराने वाले डो से आईजीए प्राप्त करते हैं, जबकि नर्सिंग । किट आम तौर पर 4-8 सप्ताह में प्रातः कर रहे हैं, लेकिन प्रातः से पहले, दूध आसानी से स्तनपान से एकत्र किया जा सकता है, के रूप में वीडियो में प्रदर्शन किया । एकत्र किए गए दूध के नमूनों को कुल और एंटीजन-विशिष्ट आईजीए स्तर(चित्रा 4)का पता लगाने के लिए संसाधित किया जा सकता है। अध्ययन के आधार पर, टीके (+/-बूस्ट) किट को प्रशासित किया जा सकता है, और सीरियल रक्त के नमूनों को पार्श्व सैफेनस नस का उपयोग करके बहुत कम उम्र में किट से एकत्र किया जा सकता है।

मातृ अध्ययन के लिए, जितनी जल्दी हो सके गर्भावस्था का निर्धारण अध्ययन डिजाइन के लिए उपयोगी है और यह सुनिश्चित करने के लिए डो को फिर से नस्ल की जरूरत नहीं है । प्रोजेस्टेरोन माप का उपयोग गर्भावस्था का पता लगाने के साधन के रूप में किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है, एक हिरन द्वारा संभोग के बाद भी गैर-गर्भवती खरगोशों की तुलना में गर्भवती खरगोशों में ऊंचा प्रोजेस्टेरोन स्तर का पता लगाया जा सकता है। गर्भावस्था का पता लगाने के लिए अतिरिक्त तरीके हैं, जिनमें मैनुअल टटोलना, अल्ट्रासाउंड और रेडियोग्राफ शामिल हैं; हालांकि, इन्हें अच्छी तरह से प्रशिक्षित व्यक्तिगत और उचित उपकरणों की आवश्यकता होती है।

एंटीजन-विशिष्ट आईजीजी जिसे गर्भाशय में स्थानांतरित किया गया था, किट के सीरम में मापा जा सकता है। रक्त पर या जन्म के समय के पास किट की एक छोटी संख्या से एकत्र किया जा सकता है जल्दी एंटीजन विशिष्ट एंटीबॉडी के स्तर का आकलन है, लेकिन धारावाहिक रक्त संग्रह तकनीकी रूप से बहुत आसान है के रूप में किट उंर और वृद्धि आकार है । जैसा कि चित्र 3में दर्शाया गया है, किट में एंटीजन-विशिष्ट आईजीजी के सीरम स्तर को एलिसा द्वारा मापा जा सकता है और मातृ स्तरों की तुलना में। मातृ स्थानांतरित IgG स्तर जन्म के समय अधिक हो जाते है और समय के साथ कमी होती है ।

म्यूकोसल नमूने के एक प्रकार के रूप में, दूध को एकत्र किया जा सकता है और कुल या एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी स्तर को मापने के लिए संसाधित किया जा सकता है। जैसा कि चित्रा 4में दिखाया गया है, आईजीए स्तन के दूध के भीतर कुल एंटीबॉडी स्तर का एक महत्वपूर्ण हिस्सा बनाता है जिसे स्तनपान के माध्यम से किट में स्थानांतरित किया जा रहा है। हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि आईजीजी की तुलना में स्तन दूध आईजीए थोड़ा अधिक एलिसा सिग्नल (सापेक्ष प्रकाश इकाइयां, आरएलयू) पैदा करता है, और आईजीए और आईजीजी दोनों एक संकेत का उत्पादन करते हैं जो आईजीएम के लिए सिग्नल से बहुत अधिक है। ये परिणाम दूसरों के परिणामों से सहमत हैं जो यह सुझाते हैं कि खरगोश के दूध में लगभग 4.5 मिलीग्राम/एमएल आईजीए, 2.4 मिलीग्राम/एमएल आईजीजी, और 0.1 मिलीग्राम/एमएल आईजीएम26, 27शामिल हैं।

Figure 1
चित्रा 1। खरगोश(ओरिक्टोलगस क्यूनिकुलस)मॉडल में मातृ इंट्रानासाल प्रतिरक्षण अध्ययन डिजाइन के लिए नमूना समय रेखा। महिला खरगोशों इंट्रानासल मार्ग के माध्यम से प्रतिरक्षित कर रहे हैं, के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है और वीडियो में प्रदर्शन किया । अध्ययन के आधार पर, वैक्सीन को बढ़ावा देने की आवश्यकता हो सकती है या एक अतिरिक्त मार्ग (जैसे इंट्रामस्क्युलर या चमड़े के नीचे) के माध्यम से दिए जाने की आवश्यकता हो सकती है। खरगोश तो पैदा कर रहे हैं । एंटीजन-विशिष्ट आईजीजी को किट में स्थानांतरित कर दिया जाता है, और प्रजनन के बाद लगभग 30-32 दिनों में, गर्भवती जलाना होगा। आईजीए को नर्सिंग करते समय स्तनपान कराने वाले डो से किट तक पास की जाती है। प्रात: यनात करने से पहले, दूध आसानी से स्तनपान से एकत्र किया जा सकता है कुल और एंटीजन विशिष्ट IgA स्तर का आकलन करने के लिए करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। प्रजनन के बाद 3 सप्ताह में गर्भवती और गैर-गर्भवती खरगोशों में प्रोजेस्टेरोन का स्तर। प्रजनन के बाद 3 सप्ताह में खरगोशों से रक्त एकत्र किया गया था। खरगोशों को प्रजनन के बाद 30-32 दिनों में कूड़े को जलाने की क्षमता के आधार पर या तो गर्भवती या गैर-गर्भवती की पुष्टि की गई थी। सीरम प्रोजेस्टेरोन के स्तर को मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी वेटनरी डायग्नोस्टिक लेबोरेटरी के माध्यम से एक इम्यूनोसे सिस्टम (जैसे, सीमेंस हेल्थिनर्स इम्मुलिटे 2000) के साथ एक रसायनीय इम्यूनोसे (सीएलईए) का उपयोग करके मापा गया था। त्रुटि सलाखों के मतलब के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं, और नमूना आकार समूह प्रति 4-6 खरगोशों के शामिल थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। जन्म के समय किट में एंटीजन-विशिष्ट आईजीजी स्तर (मातृ स्तर के सापेक्ष) और मातृ प्रतिरक्षण की एक श्रृंखला के बाद 3 सप्ताह की उम्र में। खून करता है और किट से जल्द ही जलाने के बाद और उम्र के 3 सप्ताह में एकत्र किया गया था । सीरम के भीतर एंटीजन-विशिष्ट आईजीजी स्तरों का पता लगाया गया था, जैसा कि पहले28वर्णित फ्लोरोसेंट एलिसा का उपयोग करके किया गया था। एंटीजन-विशिष्ट आईजीजी को किट सीरम और मातृ सीरम में पाए गए स्तरों के अनुपात के रूप में प्लॉट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। खरगोश के दूध में आईजीए, आईजीएम और आईजीजी स्तरों की तुलना। खरगोश के दूध के रूप में वर्णित है और वीडियो में प्रदर्शन एकत्र किया गया था । दूध को 4 डिग्री सेल्सियस पर 4.5 घंटे के लिए 13,000 x ग्राम) द्वारा संसाधित किया गया था, और प्रसंस्करण के बाद स्पष्ट मध्य परत को अलग किया गया था। कुल आईजीए, आईजीजी और आईजीएम स्तरों को फ्लोरोसेंट एलिसा द्वारा इस स्पष्ट परत में मापा गया था जैसा कि पहले28वर्णित था, सिवाय इसके कि प्लेटों को क्रमशः कुल खरगोश आईजीए, आईजीजी या आईजीएम का पता लगाने के लिए पॉलीक्लोनल एंटी-आईजीए, एंटी-आईजीजी या एंटी-आईजीएम के साथ लेपित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हालांकि उपरोक्त प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है, खरगोशों का सफल प्रजनन इस मातृ मॉडल के लिए और दूध संग्रह के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है। खरगोश आसानी से एक शोध सेटिंग में लाइव कवर द्वारा पैदा कर रहे हैं। यह सिफारिश की है कि प्रजनन के लिए हिरन के पिंजरे में स्थानांतरित किया जाता है, के रूप में क्षेत्रीय और आक्रामक हो सकता है अगर हिरन के साथ अपने पिंजरे में रखा । यदि महिलाएं 15 मिनट के बाद गैर-ग्रहणशील हैं (जैसा कि काटने, या मुखर होने से संकेत दिया गया है), तो डो को वापस अपने पिंजरे में रखा जाना चाहिए। खरगोश प्रजनन पर कई जानकारीपूर्ण वीडियो और ट्यूटोरियल हैं जिन्हें ऑनलाइन29देखा जा सकता है, लेकिन प्रजनन के बाद, पुरुष आमतौर पर गिर जाएगा और मुखर हो सकता है। एक बार यह मनाया जाता है, डो उसके पिंजरे में वापस किया जा सकता है । एक हिरन शुक्राणुओं की संख्या में कोई कमी नहीं के साथ एक दिन में 2-3 बार नस्ल हो सकता है30। हमारे IACUC में अनुमोदित प्रोटोकॉल, रुपये प्रति सप्ताह 10-12 प्रजनन तक ही सीमित है और प्रति सप्ताह कम से दो आराम दिन प्रदान किए जाते हैं, सूत्रों के रूप में राज्य है कि एक भी हिरन आमतौर पर सेवा के लिए पर्याप्त है 10-1531करता है । हमारे समूह के विक्रेता से सिद्ध प्रजनकों की खरीद के लिए प्रजनन सफलता दर में सुधार का सुझाव है । के रूप में खरगोशों को प्रेरित किया जाता है और ओव्यूलेशन आम तौर पर 10-13 घंटे के बाद होता हैमैथुन 31,हम में गर्भावस्था की एक उच्च दर का अनुभव किया है कि सुबह में पैदा कर रहे है और फिर दोपहर में फिर से, या दो बार है कि 10-13 घंटे खिड़की के भीतर (७५% से ९५% सफलता दर, अप्रकाशित वृद्धि देखी) । साहित्य के आधार पर, विशिष्ट प्रजनन सफलता की दर57-100%32,33, 34,35,36, 37,38,39,40और कूड़े के आकार का औसत लगभग 7-9 किट31से भिन्न होता है।

गर्भावस्था को यथाशीघ्र निर्धारित करना मातृ अध्ययनों में इस बात की पुष्टि करने में सहायक होता है कि डो को अध्ययन से फिर से ऊपर करने या हटाने की आवश्यकता नहीं है। गर्भावस्था का पता लगाने के विकल्पों में टटोलना (14 दिनों के रूप में जल्दी)31,अल्ट्रासाउंड (5-9 दिनों के रूप में जल्दी)40,रेडियोग्राफ (दिन के रूप में 11)31,वजन बढ़ाने, और आणविक तकनीकों, जैसे इंसुलिन-विकास कारकों के माप41 (आईजीएफ) और प्रोजेस्टेरोन34,37,38,42, 43शामिल हैं। पिछले काम ने गैर-गर्भवती खरगोशों41में स्तरों की तुलना में गर्भवती खरगोशों में आईजीएफ-II के स्तर की महत्वपूर्ण ऊंचाई का संकेत दिया है। हालांकि, हमारे हाथों में, हम गर्भवती और गैर-गर्भवती खरगोशों (अप्रकाशित) के बीच आईजीएफ-II के स्तर में अंतर का पता लगाने में असमर्थ थे। चूंकि खरगोशों में गर्भावस्था के रखरखाव के लिए पर्याप्त प्रोजेस्टेरोन का स्तर आवश्यक है37,44, कई अध्ययनों ने गर्भवती खरगोशों में प्रोजेस्टेरोन के स्तर का आकलन किया है और गैर-गर्भवती खरगोशों के सापेक्ष ऊंचा स्तर का प्रदर्शन किया है, विशेष रूप से मध्य गर्भ34, 43,44के आसपास ऑर्गेनोजेनेसिसके दौरान। हमारा समूह गर्भवती और गैर-गर्भवती खरगोशों के बीच एलिसा का उपयोग करके प्रोजेस्टेरोन के स्तर में अंतर का पता लगाने में असमर्थ था, लेकिन मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी वेटनरी डायग्नोस्टिक लेबोरेटरी में एक स्वचालित रसायनीय चढ़ाई परख का उपयोग करके प्रारंभिक परिणाम गर्भवती खरगोशों में ऊंचा प्रोजेस्टेरोन स्तर का संकेत देते हैं, भले ही एक हिरन द्वारा संभोग के बाद सभी का मूल्यांकन किया गया(चित्रा 2)।

स्तनपान कराने से लगभग 250 एमएल, या 60 एमएल/किलो दूध का उत्पादन हो सकता है, दैनिक45,46,प्रायोगिक परख के लिए बड़ी मात्रा में कुल और एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं/सांद्रता का आकलन करने की अनुमति देता है। खरगोश के दूध में वसा और प्रोटीन का उच्च स्तर होता है, जिसमें गाय की तुलना में वसा और प्रोटीन के 2 और 3 गुना अधिक केंद्रित स्तर होते हैं और दूध बोते हैं, क्रमशः45,47। दूध में वसा की मात्रा अधिक होने के कारण, नमूनों को आयोजित किए जाने वाले परख के आधार पर महत्वपूर्ण प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। दूध के नमूने के अपकेंद्रीकरण के बाद, तीन अलग-अलग परतों को अलग किया जाता है, जिसमें निचली परत के भीतर की कोशिकाएं, इम्यूनोग्लोबुलिन युक्त मध्यवर्ती परत और शीर्ष परत48के भीतर वसा शामिल हैं। इम्यूनोग्लोबुलिन, स्पष्ट मध्यवर्ती परत के भीतर, कोलोस्ट्रम और दूध के भीतर उच्च सांद्रता पर मौजूद होते हैं और मुख्य रूप से आईजीए, आईजीजी और आईजीएम(चित्र 4)से बने होते हैं। हालांकि दूध के नमूने आसानी से हाथ से एकत्र किए जाते हैं, और प्रयोगशाला के भीतर यह हमारी पसंदीदा तकनीक है, साहित्य13,46,48में वैक्यूम सिस्टम की भी सूचना दी गई है। योशियामा एटअल. ४८ ने नकारात्मक दबाव का उपयोग करके दूध के नमूनों को एकत्र किया और इम्यूनोग्लोबुलिन हटाने के लिए सेफारोज 4 बी कॉलम के माध्यम से स्पष्ट मध्यवर्ती परत को पारित करने से पहले दूध की परतों को अलग करने के लिए एक लंबी अपकेंद्रित्र (4 घंटे के लिए १५,० x g) का वर्णन किया । इस विधि का उपयोग करते हुए, लेखक आंत48में विब्रियो हैजा-प्रेरितस्राव के खिलाफ सुरक्षा के लिए पर्याप्त स्तर पर मौखिक रूप से प्रतिरक्षित खरगोशों के खरगोश के दूध के भीतर हैजा टॉक्सिन-विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने में सक्षम थे। पेरी एट अल.13 प्रसंस्कृत दूध के नमूने आकांक्षा द्वारा पानी वैक्यूम प्रणाली के साथ 2 घंटे के लिए 2 घंटे के लिए 2 घंटे के लिए 2 डिग्री सेल्सियस पर 24,000 x ग्राम पर एक पानी वैक्यूम प्रणाली के साथ एकत्र किए गए । इस अध्ययन में, लेखक म्यूकोसल प्रतिरक्षण (मौखिक या नसों में नसों में) के बाद कोलोस्ट्रम, दूध, और ब्रोंकियल और आंतों के स्राव में एंटी-आरएसवी आईजीए का पता लगाने में सक्षम थे, लेकिन नसों में प्रतिरक्षण नहीं, जबकि प्रतिरक्षण मार्ग13की परवाह किए बिना कोलोस्ट्रम, दूध और सीरम में एंटी-आरएसवी आईजीजी का पता लगाया गया था।

खरगोश संज्ञाहरण के एक पर्याप्त विमान में है और एक बार में वैक्सीन की बड़ी मात्रा प्रशासन से बचने के लिए की पुष्टि करने के लिए इंट्रानासाल प्रतिरक्षण प्रक्रिया के दौरान देखभाल की जानी चाहिए। हमारे समूह के पिछले कार्य से पता चला है कि इंट्रानैसल प्रतिरक्षण की प्रभावकारिता संज्ञाहरण49के उपयोग से प्रभावित थी । विशेष रूप से, केटामाइन और जाइलाज़ीन के संयोजन से प्रेरित गहरे संज्ञाहरण ने नासली प्रशासित वैक्सीन की बढ़ती इम्यूनोजेनिसिटी और समाधान की बेहतर नाक प्रतिधारण के साथ सहसंबद्ध किया। ये स्तर एसेप्रोमाजिन और बुटोफेनॉल49के साथ स्मगलिंग के बाद खरगोशों में प्रतिधारण और इम्यूनोजेनिसिटी से काफी अधिक थे । चूहों में इंट्रानसल प्रतिरक्षण के बाद भी इसी तरह के निष्कर्षोंका प्रदर्शन किया गया है . इसके अतिरिक्त, हमारे काम ने जानवरों पर गहरे संज्ञाहरण के तहत इंट्रानासाल प्रतिरक्षण के बाद इम्यूनोजेनिसिटी में वृद्धि का प्रदर्शन किया जो पूरी तरह से जाग रहे थे और एसेप्रोमाज़ीन और आइसोफ्लुन के संयोजन के साथ कम अवधि के संज्ञाहरण से गुजर रहे जानवरों पर। गहरी बनाम छोटी अवधि संज्ञाहरण के बीच आईजीजी इम्यूनोजेनिकिटी में यह अंतर 42 दिन के समय बिंदु पर महत्वपूर्ण था, लेकिन 56 दिन के समय बिंदु पर नहीं। हालांकि बढ़ी हुई इम्यूनोजेनिसिटी और प्रतिधारण गहरे संज्ञाहरण से परिणाम हो सकता है, खरगोशों को ठीक होने के लिए कम से कम 30 मिनट की आवश्यकता होती है; जबकि, खरगोश कम अवधि आइसोफलुरेन-प्रेरित संज्ञाहरण के बाद नाक का टीका प्राप्त करने के 5 मिनट के भीतर सीधे और मोबाइल थे । यद्यपि संज्ञाहरण मनुष्यों में इंट्रानासाल प्रतिरक्षण के लिए नैदानिक सेटिंग की नकल करने के लिए आदर्श नहीं हो सकता है, लेकिन इंजेक्शन एजेंटों (जैसे, केटामाइन + जाइलाज़ीन) के साथ एक लंबी, गहरी संज्ञाहरण के लिए एक छोटी अवधि एनेस्थीसिया (उदाहरण के लिए, केटामाइन + जाइलाज़ीन) के लिए पसंद किया जा सकता है। एक पशु मॉडल का उपयोग, जैसा कि Gwinn एट अल49में प्रदर्शित किया गया है, अक्सर सुरक्षित पशु हैंडलिंग और प्रभावी और लगातार वैक्सीन वितरण के लिए अनुमति देने के लिए स्नेशन या संज्ञाहरण के उपयोग की आवश्यकता होगी। पशु मॉडल में वैक्सीन प्रशासन के साथ संज्ञाहरण उपयोग के लिए एक संभावित सीमा पशु की क्षमता पर इसका प्रभाव टीका के लिए एक उपयुक्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए है । दिलचस्प बात यह है कि साहित्य में रिपोर्ट ों से पता चलता है कि आइसोफ्लुरेन प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को क्षीण कर सकता है, चुनौतियों के खिलाफ सुरक्षा प्रदान कर सकता है52 और ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन53को कम कर सकता है।

वैक्सीन हानि और पर्याप्त इंट्रानासल वितरण को कम करने के संबंध में, हमारा समूह इंट्रानसल वैक्सीन के प्रत्येक एलिकोट को नाक गुहा के भीतर समाधान को बनाए रखने के लिए अनुमति देने और नथुने से बाहर रिसाव से समाधान को रोकने के लिए 30 सेकंड की एक आराम अवधि की सिफारिश करता है यदि खरगोश को तुरंत कठोर रूप में रखा जा रहा है और पिंजरे में लौट आया है। इसके अतिरिक्त, इंट्रानैसल प्रतिरक्षण सुनिश्चित करने के लिए प्रशासित एलिकोट की मात्रा को सीमित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि म्यूकोसल अवशोषण नाक मार्ग के सतह क्षेत्र द्वारा सीमित है। यदि एक बड़ी मात्रा प्रशासित की जाती है, तो समाधान नाक म्यूकोसा को बाईपास कर सकता है और परिणामस्वरूप साँस लेना या गैस्ट्रिक प्रतिरक्षण हो सकता है। हमारा समूह 500 माइक्रोन की अधिकतम इंट्रानासाल मात्रा के साथ 100 माइक्रोन प्रति नथु की एलिकोट्स की सिफारिश करता है।

यह लेख विशेष रूप से इंट्रानासल मार्ग के माध्यम से म्यूकोसल वैक्सीन डिलीवरी पर केंद्रित है, लेकिन प्रतिरक्षण के कई तरीके हैं, दोनों म्यूकोसल और पेरेंटरल जो खरगोशों में प्रदर्शित किए गए हैं। इन अतिरिक्त तरीकों में शामिल हैं, लेकिन मौखिक, चमड़े के नीचे, इंट्रामस्क्युलर और इंट्राडर्मल तक सीमित नहीं हैं। इस प्रकार, एकत्र किए जाने वाले नमूनों और मूल्यांकन प्रायोगिक लक्ष्यों और प्रतिरक्षण के मार्ग के आधार पर भिन्न होते हैं ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को ड्यूक विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु संसाधनों के विभाजन और उनकी सहायता और जानवरों को प्रदान की महान देखभाल के लिए उनके पशुपालन टीम को स्वीकार करना चाहते हैं । इसके अतिरिक्त, लेखक पांडुलिपि के ऑडियो और वीडियो भागों के साथ उनकी सहायता के लिए पैथोलॉजी विभाग के भीतर फोटोपाथ टीम को पहचानना चाहते हैं। इस काम को स्टैट्स प्रयोगशाला से विवेकाधीन अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन अंक 173 मातृ प्रतिरक्षण इंट्रानासाल प्रतिरक्षण म्यूकोसल प्रतिरक्षण दूध संग्रह खरगोश का दूध ओरेक्टोलागस क्यूनिकुलस।
न्यूजीलैंड व्हाइट रैबिट्स<em>(ओरेक्टोलागस क्यूनिकुलस)</em>में मातृ प्रतिरक्षण के अध्ययन में इंट्रानासल प्रतिरक्षण और दुग्ध संग्रह
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Landon, C. D., Dancourt, G., Shing,… More

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

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