Summary
이 기사는 산모 예방 접종의 번역적으로 적합한 모델에서 점막 면역을 평가하는 수단으로 토끼(Oryctolagus cuniculus)를수유하여 내비강 내 백신의 투여 및 우유 수집을 설명하고 보여줍니다.
Abstract
태반과 인체의 항체 전달의 유사성으로 인해 토끼는 모성 예방 접종의 훌륭한 모델입니다. 이 연구 모델의 추가 장점은 번식 및 샘플 수집의 용이성, 상대적으로 짧은 임신 기간 및 큰 쓰레기 크기입니다. 예방 접종의 일반적으로 평가 된 경로는 피하 포함, 근육 내, 비강, 그리고 상인. 이러한 예방 접종에 대한 면역 학적 반응의 연대순 검출을 위한 비단말 샘플 수집은 댐과 키트 모두에서 혈액 의 수집을 포함하고, 수유에서 우유는 않습니다. 이 기사에서는 우리 실험실이 뉴질랜드 화이트 토끼(Oryctolagus cuniculus)의모성 예방 접종 연구에 활용 한 기술을 시연 할 것입니다.
Introduction
모계 예방 접종 및 항체 전송의 연구는 여러 가지 이유로 매우 중요합니다, 이것은 면제 전송의 초기 경로와 신생아와 유아에 병원체와 질병에서 후속 보호. 모성 예방 접종은 이 취약한 기간1동안 특정 병원균과 관련된 이환율 및 사망률을 감소시킴으로써 전 세계 수준에서 모계 및 유아/아동 건강에 긍정적인 영향을 미칠 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 이 전략의 주요 목표는 임신 내내 특정 모계 항체의 수준을 증가시키는 것입니다. 이러한 항체는 면역 체계가도전1,2,3에 적절하게 반응할 만큼 충분히 성숙해질 때까지 감염으로부터 보호하기에 충분한 수준으로 신생아와 유아에게 전달될 수있다. 이전 연구는 출생 시 더 높은 항체 티터가 파상풍, 등도, 호흡 싱크바이러스(RSV), 인플루엔자 및 그룹 B 연쇄상 구균 감염1,2,3을포함하여 신생아에서 수많은 다른 전염병의 완전한 보호 또는 지연된 발병 및 감소된 심각도와 연관된다는 것을 입증하였다.
인간에서, 모계 항체는 태반을 통해 수동적으로 전송되고 또한 간호를 통해 모유를 통해 전달됩니다. 이전 연구는 바이러스에 감염된 어머니로부터 인간의 모유에서 HIV 특정 IgA 수준이 바이러스의 감소 된 산후 전염과 관련이 있음을 입증했다, 모유 안티 HIV IgA에 대한 보호 역할을 제안4. 비인간 영장류에 대한 연구는 HIV에 대한 예방 접종이 모유에서 상당한 항체 반응을 유도 할 수 있음을 입증하고, 유사한 혈청 IgG 반응은 점막 예방 접종에 비해 전신에 따라 유도되었지만, 점막 예방 접종은 우유내에서상당히 높은 IgA 반응을 유도5,6.
이러한 연구에 대한 번역적으로 적합한 동물 모델을 식별하는 것은 모유를 통한 항체 전달뿐만 아니라 지동적 항체 전달의 태반 유형 및 메커니즘을 고려해야합니다. 혈청 (영장류, 설치류 및 토끼), 내피 (육식 동물), 및 상피 (말, 돼지 및 반추제)를 포함하여 마테르노 태아 인터페이스의 조직 유형과 층을 기반으로 포유동물에서 태반의 세 가지 주요 유형이 있습니다. 혈청 태반은 가장 침습적인 유형으로, 모계 혈액 공급과 초리온 또는 가장 바깥쪽 태아 막 사이의 직접적인 의사 소통을 가능하게 합니다. 트로포블라스트 층의 수에 기초하여, 영장류에서 발견되는 헤모모노코오레태반, 토끼의 혈액 투석 태반, 쥐와마우스에서관찰된 헤모티코알 태반 을 포함한 여러 가지 변이가 있다 7. 모계 혈액 공급과 초리온 사이의 이러한 직접적인 접촉은 임신 중 태반을 통해 항체의 수동 전달을 허용합니다. IgG는 인간 태반8을크게 교차시키는 유일한 항체 클래스이며, IgA는 인간 모유9에서발견되는 Ig의 우세한 클래스입니다. 과학적으로 관련 된 모델중 영장류 (인간 포함), 토끼 및 기니 피그만 우유10,11에서 자궁과 IgA에서 IgG를 전송합니다. 따라서 토끼 모델은 IgG의 트랜스태반 전달및 IgA의 수유 전달을 제어하는 인간에 필적하는 요인을 통합합니다.
모계 면역 및 백신 개발을 위한 뛰어난 모델로 봉사하는 것 외에도 토끼와 인간 비강 사이의 유사성은 비강 내 예방 접종을위한 적절한 모델입니다. 토끼 비강의 부피는 상대체질량(12)에기초한 설치류 모델보다 인간과 더 유사하다. 추가적으로, Casteleyn 외. 12는 비강 관련 림프구 조직 (NALT)이 설치류에 비해 토끼에서 더 볼륨하다는 것을 입증했다. NALT는 주로 복부 비강 고기의 복부 및 복부 및 복부 에 위치하고 토끼에서 비인두 고기의 측면 과 등쪽 측면에, 반면 설치류에서, 림프 조직은 비인두 고기의 복부 측면을 따라 존재12. 토끼에서, 자궁 내 및 라미나 프로프리아 림프구의 구조와 위치뿐만 아니라, 고립 된 림프구 여포, 인간(12)과유사하다.
모계 및 점막 면역을 위한 모형으로 토끼를 사용하는 추가적인 이점은 그들의 높은 fecundity 및 상대적으로 짧은 임신 기간을 포함합니다. 큰 소변 혈관 은 시리얼 수집을위한 혈액의 큰 볼륨에 상대적으로 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 다양한 점막 시료는 모유13(수유 시), 점막 분비물 또는 세척(예: 구강14,15,16,기관지 알팔벨라 라베라13,17,18,19,질20,21, 20, 20) 및 20, 20, 20, 20, 20, 20을포함하여 항원 특이적 항체 반응 작용제용으로 수집될 수있다. 우유 샘플은 수유 중에 쉽게 수집하여 항원 특이적 항체 반응의 존재를 평가할 수 있습니다. 인간과 마우스만큼 풍부하지는 않지만 토끼 관련 연구 및 연구 결과에 다양한 실험 시약을 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 뉴질랜드 화이트 토끼(Oryctolagus cuniculus)에서비강 내 예방 접종 및 우유 수집을 설명하고 시연할 것입니다.
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Protocol
모든 절차는 듀크 대학 IACUC 정책에 따라 승인및 수행되었다.
참고: 필요한 재료는 재료 표에제공됩니다.
1. 토끼 세이션과 마취
- 아세프로마진을 근육질(IM)으로 투여하여 1 mg/kg의 투여량으로 여성 토끼(성적으로 성숙하고 약 5-30개월 된 세팅)를 진정시합니다. 동물의 크기에 따라 25G 바늘로 1 mL 주사기를 사용하십시오. 에팍스 근육은 근육 주사의 바람직한 사이트입니다.
참고: 아세프로마진은 피하 투여될 수 있지만, 보다 빠르게 작용하고 피부 병변발생을 감소시키기 때문에 IM은 실험실에서 선호된다. - 아세프로마진이 효과를 발휘할 수 있도록 10-15분 정도 기다립니다.
- 연결된 코 콘을 동물의 코 위에 배치하여 토끼를 이소플루란으로 마취시합니다. 기화기를 최대 4리터/분 산소와 결합하여 최대 4%까지 조절합니다. 토끼는 이소플루란에 대한 혐오감이 높기 때문에 동물을 마스킹할 때 적절한 구속이 필요합니다.
- 일단 완전히 마취되면, 피나, 페달 및/또는 palpebral 반사에 의해 평가된 바와 같이, 눈의 건조및 후속 각막 궤양을 방지하기 위하여 각 눈에 안과 윤활유를 적용하십시오.
- 마취 중 반사 신경과 호흡을 지속적으로 모니터링하고 마취의 적절한 평면에 도달하면 이소플루란 속도를 1-2 %로 줄입니다.
2. 비강 내 예방 접종
- 동물 취급 전에 예방 접종 솔루션을 준비하십시오.
- 위에서 설명한 대로 토끼를 진정시하십시오.
- 일단 실험실 구성원이 백신을 관리할 준비가 되고 토끼가 마취의 적당한 평면에 있으면, 이소플루란과 산소를 끄고 코 콘을 제거하십시오.
- 토끼를 등쪽 의 비수성에 놓고, 백신을 투여하는 실험실 구성원에 의해 두 나레의 쉽게 접근및 시각화를 허용하는 대략 45° 각도로 목과 머리를 소품.
- 백신 용액의 100 μL 이하로 파이펫을 적재하고 각 콧구멍에 용액을 신속하게 관리합니다. 파이펫은 비강 통로의 내측 측면을 향해 기울어진 대략 적인 45° 각도로 유지되어야 합니다.
참고: 예방 접종의 목적은 암말의 점막에 접촉하는 용액을 위한 것이므로 점막 조직의 마모 또는 자극을 초래하고 잠재적으로 nasally 투여 된 백신의 면역 원성에 영향을 미칠 수 있으므로 팁은 나레 안에 배치되어서는 안됩니다. 백신은 신속하게 투여되고 다른 나레에서 동일한 방식으로 수행되어야합니다. - 두 비강 통로에서 투여한 후, 백신 용액의 누출을 최소화하기 위해 30초 동안 등쪽 회복으로 토끼를 유지한다.
참고: 실험실은 일반적으로 한 번에 콧구멍당 100 μL 을 초과하지 않습니다. 더 큰 부피를 투여할 경우 최대 500 μL을 투여할 경우, 백신은 예방 접종 사이의 30초 휴식 기간을 가진 100 μL 알리쿼트에서 투여될 수 있으며, 백신의 추가 투여는 총 백신 부피가 전달될 때까지 각 투여 사이에 30초의 휴식과 함께 반복될 수 있다. - 예방 접종 후, 회복을 위해 통풍관에 토끼를 배치하고 엄격하게 예방 접종을 유지할 수있을 때까지 동물을 면밀히 모니터링하십시오.
3. 우유 컬렉션
- 위에서 설명한 대로 수유 토끼를 진정시하십시오.
- 알코올 면봉 / 닦아로 한계 귀 정맥 위에 피부를 청소합니다.
- 1 mL 주사기와 25g 바늘을 사용하여, 우유 를 진정시키는 한계 귀 정맥을 통해 정맥내 옥시토신의 약 1-2 IU를 투여한다.
참고 : 원활한 근육 이완으로 인해 토끼가 옥시토신 투여 후 소변을 보거나 배변하는 것이 일반적입니다. - 옥시토신 투여 후, 거즈 조각으로 주사 부위에 압력을 가하십시오.
- 토끼의 코 위에 마취 마스크를 유지하면서, 뒤늦은 분기에 토끼를 소품.
참고: 우유 수집은 동물과 함께 측면 의식으로 수행 할 수 있지만 실험실은 토끼가 마취 마스크로 토끼를 똑바로 잡고 있는 조수와 함께 엉덩이에 올려질 때 수집이 더 쉽다는 것을 발견합니다. - 멸균 튜브를 열어 우유 수집을 준비하고 유방 조직과 관련 젖꼭지를 찾습니다. 젖꼭지는 일반적으로 최근 간호에서 젖은 모피에 의해 포위되고, 유방 조직은 우유의 가득 차있을 때 쉽게 만져볼 수 있습니다.
- 엄지와 집게 손가락 사이의 젖꼭지와 관련된 유방 조직을 잡고 젖꼭지 방향으로 선 조직에 부드럽고 마사지 압력을 가하십시오. 수집 튜브를 젖꼭지 위에 놓고 표현된 우유를 수집합니다.
참고: 옥시토신이 효과적이기까지는 몇 분 정도 걸릴 수 있으며, 우유 생산은 유방 땀샘마다 달라지는 것으로 보입니다. 우유 발현이 성공하지 못하면 몇 분 정도 기다리거나 추가 유방 땀샘으로 회전하십시오. 모든 젖꼭지에서 우유는 동일한 바이알에서 수집 할 수 있습니다. 일반적으로 수유 도에서 여러 밀리리터를 쉽게 수집할 수 있습니다. - 우유 수집 후, 이소플루란과 산소를 끄고 동물이 흉골 의 변칙을 유지할 수있을 때까지 밀접하게 모니터링되는 동안 토끼가 회복 할 수 있습니다.
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Representative Results
전형적인 모계 내 비강 예방 접종 연구 설계에 대한 개요는 예방 접종, 사육, 발성, 수유 및 항체 전달을 통합한 도 1에묘사됩니다. 비록 설명 되지, 혈액 기준 선 측정에 대 한 초기 예방 접종 전에 정기적으로 연구의 나머지 부분에 걸쳐 수집 해야 합니다. 혈액은 가벼운 체기와 국소 진통제 (예를 들어, 리도카인 2.5 % 및 프리로카인 2.5 % 크림)와 중앙 귀 동맥을 통해 쉽게 얻을 수 있습니다. 항원 특이적 IgG 수준의 존재는 이러한 샘플에서 측정될 수 있다. 여성 토끼는 프로토콜에 설명되어 비디오에서 입증된 바와 같이 비강 내 경로를 통해 예방 접종을 받습니다. 연구에 따라, 백신 부스트를 요구할 수 있습니다 또는 추가 경로를 통해 제공 될 필요가 있을 수 있습니다 (예를 들어, 근육 또는 피하). 연구 개시 후 토끼는 사육됩니다. 우리는 이러한 연구에 대 한 높은 임신 율을 보장 하기 위해 사용 하는 공급 업체에서 입증 된 브리더를 구입 하는 것을 선호 합니다. 예방 접종 일정에 따라 토끼는 임신 기간 내내 추가 예방 접종을받을 수 있습니다. 항원 별 IgG는 키트로 트랜스페이즈로 전송되며, 약 30-32일 후에 번식 후 임신이 불붙을 것이다. 처음 며칠 동안 키트 취급을 제한하여 거부를 최소화하는 것이 좋습니다. 혈액 샘플은 키트로부터 수집되어 트랜스페이언탈리(그림3)로전달된 항원 특이적 IgG 수준을 평가할 수 있다. 다양한 영양소 외에도 키트는 수유 하는 도에서 IgA를 받습니다. 키트는 일반적으로 4-8 주에 젖을 짜지만 젖을 짜기 전에 비디오에서 설명 한 것처럼 수유에서 우유를 쉽게 수집 할 수 있습니다. 수집된 우유 샘플은 총 및 항원 특이적 IgA수준(도 4)의검출을 위해 처리될 수 있다. 연구에 따라, 백신 (+/-부스트) 키트에 관리 될 수 있습니다., 그리고 직렬 혈액 샘플 측면 수 페누스 정맥을 사용 하 여 매우 이른 나이에 키트에서 수집 될 수 있습니다.
모성 연구를 위해, 가능한 한 빨리 임신을 결정하는 것은 연구 디자인에 도움이 되고 doe가 번식할 필요가 없도록 하는 것이 도움이됩니다. 프로게스테론 측정은 임신을 검출하는 수단으로 사용될 수 있다. 도 2에도시된 바와 같이, 높은 프로게스테론 수준은 임신하지 않은 토끼에 비해 임신한 토끼에서 검출될 수 있으며, 짝짓기 후에도 모든 것을 확인하였습니다. 수동 심포피션, 초음파 및 방사선 검사를 포함하여 임신 탐지를 위한 추가 방법이 있습니다; 그러나, 이들은 잘 훈련 된 개인 및 적절한 장비가 필요합니다.
자궁에서 간으로 옮겨진 항원 특이적 IgG는 키트의 혈청에서 측정될 수 있다. 혈액은 초기 항원 특정 항체 수준을 평가하기 위하여 출생의 시간 또는 그 근처에 키트의 소수에서 집합될 수 있습니다, 그러나 직렬 혈액 수집은 키트 나이 및 증가크기 때문에 기술적으로 훨씬 쉽습니다. 도 3에묘사된 바와 같이, 키트내항원 특이적 IgG의 혈청 수준은 ELISA에 의해 측정되고 모계 수준에 비해 측정될 수 있다. 모성 으로 전송 된 IgG 수준은 출생시 더 높고 시간이 지남에 따라 감소하는 경향이 있습니다.
점막 시료의 일종으로서 우유를 채취하여 총 또는 항원 특이적 항체 수준을 측정할 수 있습니다. 도 4에도시된 바와 같이, IgA는 수유를 통해 키트로 옮겨지는 모유 내의 전체 항체 수준의 상당 부분을 구성한다. 우리의 결과는 모유 IgA가 IgG에 비해 약간 더 높은 ELISA 신호 (상대적인 광 단위, RLU)를 생성하고, IgA와 IgG 모두 IgM에 대한 신호보다 훨씬 높은 신호를 생성한다는 것을 보여줍니다. 이러한 결과는 토끼 우유 주위에 포함 제안 하는 다른 사람에서 결과 와 일치 4.5 mg/mL IgA, 2.4 mg/mL IgG, 그리고 0.1 mg/mL IgM26,27.
그림 1. 토끼(Oryctolagus cuniculus)모델에서 모계 내 예방 접종 연구 설계를위한 샘플 타임 라인. 여성 토끼는 프로토콜에 설명되어 비디오에서 입증된 바와 같이 비강 내 경로를 통해 예방 접종을 받습니다. 연구에 따라, 백신 부스트를 요구할 수 있습니다 또는 추가 경로 통해 제공 될 필요가 있을 수 있습니다 (예를 들어 근육 또는 피하). 토끼는 다음 사육된다. 항원 별 IgG는 키트로 트랜스페이즈로 전송되며, 약 30-32일 후에 번식 후 임신이 불붙을 것이다. IgA는 수유 하는 doe에서 키트에 전달 됩니다. 젖을 짜기 전에, 우유는 수유에서 쉽게 수집될 수 있고 총 및 항원 특정 IgA 수준을 평가하기 위하여 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 임신 및 임신하지 않은 토끼의 프로게스테론 수준은 번식 후 3 주에 있습니다. 토끼로부터 3주 만에 혈액을 채취하였다. 토끼는 30-32 일 후에 쓰레기를 점화하는 기능에 근거하여 임신 또는 비 임신 중 하나를 확인되었습니다. 혈청 프로게스테론 수준은 면역 분석 시스템(예를 들어, 지멘스 헬스인 IMMULITE 2000)을 가진 화학발광 면역 분석기(CLIA)를 사용하여 미시간 주립 대학 수의진단 실험실을 통해 측정하였다. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타내며 샘플 크기는 그룹당 4-6 토끼로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 항원 별 IgG 수준은 출생 시 와 3 주 후 모계 예방 접종에 대한 키트 (모성 수준에 비해). 혈액은 곧 점화 후 3 주에 키트와 키트에서 수집되었다. 혈청 내의 항원 특이적 IgG 수준은 이전에 설명된28과같이 형광 ELISA를 사용하여 검출되었다. 항원 특이적 IgG는 키트 혈청 및 모계 혈청에서 검출된 수준의 비율로 플롯된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 토끼 우유에 IgA, IgM 및 IgG 수준의 비교. 토끼 우유는 비디오에서 설명되고 입증된 대로 수집되었습니다. 우유는 긴 원심분리(4°C에서 4.5시간 동안 13,000 x g)에 의해 처리되었고, 명확한 중간층은 가공 후 분리되었다. 총 IgA, IgG 및 IgM 수준은 이전에 설명된 것과 같이 형광 ELISA에 의해 이 명확한 층에서 측정되었다28,플레이트는 각각 총 토끼 IgA, IgG, 또는 IgM을 검출하기 위해 폴리클론 안티 IgA, 안티 IgM으로 코팅된 것을 제외하고는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위의 프로토콜에 설명되지는 않지만 토끼의 성공적인 번식은이 모성 모델과 우유 수집을 허용하기 위해 필요합니다. 토끼는 연구 환경에서 라이브 커버로 쉽게 사육됩니다. 그것은 사육을 위해 벅의 케이지로 전송하는 것이 좋습니다, 벅과 자신의 케이지에 보관하는 경우 영토와 공격적 될 수 있습니다. 여성이 15 분 후에 수용하지 않는 경우 (물거나 발성하는 것으로 표시됨) doe는 자신의 케이지에 다시 배치해야합니다. 온라인29를관찰 할 수있는 토끼 사육에 대한 몇 가지 유익한 비디오및 튜토리얼이 있지만 번식 후 남성은 일반적으로 넘어지고 발성 할 수 있습니다. 이 관찰되면, doe는 그녀의 케이지로 반환 할 수 있습니다. 벅은 정자 수30의감소없이 하루에 2-3 번 번식 할 수 있습니다. 우리의 IACUC 승인 프로토콜에서, 달러는 일주일에 10-12 를 사육하는 것으로 제한되고 소스는 단일 벅이 일반적으로 서비스 10-15가31않습니다. 우리 그룹은 번식 성공률을 개선하기 위해 공급 업체에서 입증 된 브리더를 구입하는 것이 좋습니다. 토끼가 유도되고 배란이 전형적으로 10-13 시간 후 교란31에서발생함에 따라, 우리는 아침에 사육되는 임신의 높은 비율을 경험하고 오후에 다시, 또는 그 10-13 시간 창 내에서 두 번 (관찰 된 증가 75%에서 95% 성공률, 미공개). 문헌에 기초하여, 일반적인 번식 성공률은 57-100%32,33,34,35,36,37,38,39,40,쓰레기 크기 평균 약 7~9키트31개에차이가 있다.
가능한 한 빨리 임신을 결정하는 것은 doe가 연구에서 번식하거나 제거 될 필요가 없다는 것을 확인하기 위해 모계 연구에서 도움이됩니다. 임신 검출을 위한 선택권은 심팡 (14 일 일찍)31,초음파 (5-9 일)40,방사선 사진 (11 일 일찍)31,체중 증가 및 인슐린 성장 요인41 (IGF) 및 프로게스테론34,37,38,42, 43의측정과 같은 분자 기술을 포함한다. 이전 작품은 임신하지 않은 토끼의 수준에 비해 임신 토끼에서 IGF-II 수준의 상당한 고도를 표시했다(41). 그러나, 우리의 손에, 우리는 임신과 비 임신 토끼 사이의 IGF-II 수준에 있는 차이를 감지할 수 없었습니다 (미공개). 토끼37,44에서임신의 유지를 위해 적절한 프로게스테론 수준이 필요하므로, 여러 연구는 임신 토끼의 프로게스테론 수준을 평가하고 임신하지 않은 토끼에 비해 높은 수준을 입증했으며, 특히 임신 중반34,43,44의중간 임신 기간 동안. 우리 그룹은 임신과 임신하지 않은 토끼 사이의 ELISA를 사용하여 프로게스테론 수준의 차이를 감지 할 수 없었지만, 미시간 주립 대학 수의 진단 실험실에서 자동화 된 화학 발광 분석기를 사용하여 예비 결과는 벅에 의한 짝짓기 후에도 임신하지 않은 토끼에 비해 임신 하지 않은 토끼의 높은 프로게스테론 수준을 나타냅니다(그림 2).
수유는 매일45,46의약 250mL 또는 60 mL/kg을 생산할 수 있으며, 실험용 약량이 총 및 항원 별 항체 반응/농도를 평가할 수 있도록 합니다. 토끼 우유는 각각45,47에비해 2 배 와 3 배 더 많은 지방과 단백질을 함유하는 지방과 단백질의 높은 수준을 함유하고 있습니다. 우유의 지방 함량이 높기 때문에, 시료는 수행될 에세이에 따라 상당한 처리가 필요합니다. 우유 샘플의 원심분리에 따라, 3개의 뚜렷한 층은 바닥 층 내의 세포, 면역글로불린을 포함하는 명확한 중간 층, 및 상부 층 내의지방(48)을포함하여 분리된다. 명확한 중간 층 내에서 면역 글로불린은 초유 및 우유 내의 고농도에 존재하며 주로 IgA, IgG 및 IgM(그림 4)으로구성됩니다. 우유 샘플은 손으로 쉽게 수집되고 실험실 내에서 우리가 선호하는 기술이지만, 진공 시스템은 또한 문헌13,46,48에서보고되었다. 요시야마 외48은 음압을 이용한 우유 샘플을 수집하고 면역글로불린 제거를 위한 세포로즈 4B 컬럼을 통과하기 전에 우유 층의 분리를 위해 긴 원심분리(15,000 x g 4시간 동안)를 설명했다. 이 방법을 사용하여, 저자는내장(48)에서 비브리오 콜레라에대한 보호를 위한 충분한 수준에서 경구 예방 접종 토끼의 토끼 우유 내의 콜레라 독소 특이적 항체를 검출할 수 있었다. Peri 외.13 가공 우유 샘플은 24,000 x g에서 2 시간 동안 4 °C에서 원심 분리에 의해 물 진공 시스템으로 포부에 의해 수집됩니다. 이 연구에서 저자는 점막 예방 접종 (구두 또는 내 내) 다음 초유, 우유 및 기관지 및 장 분비물에서 안티 RSV IgA를 검출 할 수 있었지만 정맥 예방 접종은 아닌 반면 반대로 RSV IgG는 예방 경로13에관계없이 초유, 우유 및 혈청에서 검출되었습니다.
토끼가 마취의 적절한 평면에 있는지 확인하고 한 번에 많은 양의 백신을 투여하지 않도록 비강 내 예방 접종 절차 중에주의를 기울여야합니다. 우리 군의 이전 연구는 내비강 내 예방 접종의 효능이마취(49)의사용에 의해 영향을 받았다는 것을 보여주었다. 구체적으로, 케타민과 자일라진의 조합에 의해 유도된 심층 마취는 용액의 비강 보존을 향상시키는 비강 투여의 면역원성 증가와 상관관계가 있다. 이들 수준은 아세프로마진과부차솔(49)으로침전된 후 면역항암면역물질로 면역원성보다 현저히 높았다. 유사한 사실 인정은 또한 마우스에서 비강 내 예방 접종을 다음 을 입증하였다50,51. 또한, 우리의 연구는 완전히 깨어 있는 동물에 깊은 마취의 밑에 비강 내 면역원내 면역성 및 아세프로마진과 이소플루란의 조합으로 더 짧은 기간 마취를 겪고 있는 동물을 통해 증가한 면역원성을 보여주었습니다. IgG 면역원성 사이의 심층 대 짧은 기간 마취 사이의 이러한 차이는 42 일 시점에서 중요했지만 56 일 시점에서는 중요하지 않았습니다. 면역원성 및 유지가 더 깊은 마취로 인해 발생할 수 있지만, 토끼는 복구하기 위해 적어도 30 분이 필요합니다. 반면, 토끼는 짧은 기간 이소플루란 유도 마취 에 따라 비강 백신을 받은 후 5 분 이내에 똑바로 이동했다. 마취는 인간에서 비강 내 예방 접종을위한 임상 설정을 모방하기에 이상적이지 않을 수 있지만, 짧은 기간 마취 (예를 들어, 이소플루란)는 주사용 제 (예를 들어, 케타민 + 자일라진)를 가진 더 길고 깊은 마취를 선호할 수 있습니다. Gwinn 외49에서입증된 동물 모델의 사용은 종종 안전한 동물 취급과 효과적이고 일관된 백신 전달을 허용하기 위해 진정제 또는 마취를 사용해야 합니다. 동물 모델에서 백신 투여와 마취 사용에 대한 잠재적 제한은 백신에 대한 적절한 면역 반응을 유도하는 동물의 능력에 미치는 영향이다. 흥미롭게도, 문헌의 보고서는 isoflurane이 전신 염증 반응을 감쇠 할 수 있음을 제안, 도전에 대한 보호를 제공52 산화 스트레스와 염증을 감소53.
백신 손실의 최소화와 적절한 비강 내 전달과 관련하여, 우리 그룹은 비강 내의 용액을 보존할 수 있도록 비강 내 백신의 각 알리쿼트 투여 후 30 초의 휴식 기간을 권장하고 토끼가 즉시 흉선 재침에 배치되고 있는 경우 콧구멍에서 용액이 꺼지는 것을 방지할 것을 권장합니다. 또한, 점막 흡수가 비강 통로의 표면적에 의해 제한되기 때문에 비강 내 예방 접종을 보장하기 위해 투여된 알리쿼트의 부피를 제한하는 것이 중요하다. 대량이 투여되는 경우, 용액은 비강 점막을 우회하고 흡입 또는 위 예방 접종을 초래할 수 있다. 우리 그룹은 콧구멍 당 100 μL의 알리쿼트에 500 μL의 최대 비강 내 부피를 권장합니다.
이 문서는 점막 백신 전달에 초점을 맞추고, 특히 비강 경로를 통해, 하지만 예방 접종의 여러 방법이있다, 점막과 토끼에서 입증 된 비경구. 이러한 추가 방법은 포함, 하지만 에 제한 되지 않습니다., 구두, 피하, 근육, 그리고 상인. 따라서, 수집 및 평가되는 샘플은 예방 접종의 실험 목표 및 경로에 따라 다릅니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 듀크 대학의 실험실 동물 자원 부서와 동물에게 제공되는 지원과 훌륭한 치료에 대한 그들의 축산 팀을 인정하고 싶습니다. 또한 저자는 원고의 오디오 및 비디오 부분에 대한 지원을 위해 병리학부 내의 PhotoPath 팀을 인식하고 싶습니다. 이 작품은 Staats 실험실에서 임의 연구 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intranasal Immunization | |||
| Anesthesia Machine/Vaporizer | Vet Equip | 901807 | |
| Hypodermic Needle (25 g) | Terumo | 07-806-7584 | |
| Isoflurane (250 mL Bottle) | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | 2-4% |
| Luer Lock Syringe (1 mL) | Air-Tite | 07-892-7410 | |
| Mucosal Vaccine | N/A | N/A | Experimental Vaccine |
| Nose Cone | McCulloch Medical | 07891-1097 | |
| Pipette Tips | VWR | 53503-290 | |
| Pipettor | VWR | 89079-962 | |
| PromAce (Acepromazine maleate) | Boehringer Ingelheim | 07-893-5734 | 1mg/kg IM |
| Puralube Sterile Ophthalmic Ointment | Dechra | 07-888-2572 | |
| Milk Collection | |||
| Alcohol Prep 2-ply | Covidien | 07-839-8871 | |
| Anesthesia Machine/Vaporizer | Vet Equip | 901807 | |
| Hypodermic Needles (25 g) | Terumo | 07-806-7584 | |
| Isoflurane (250 mL Bottle) | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | 2-4% |
| Luer Lock Syringe (1 mL) | Air-Tite | 07-892-7410 | |
| Non-Woven Sponge (4x4) | Covidien | 07-891-5815 | |
| Nose Cone | McCulloch Medical | 07891-1097 | |
| PromAce (Acepromazine Maleate) | Boehringer Ingelheim | 07-893-5734 | 1mg/kg IM |
| Puralube Sterile Ophthalmic Ointment | Dechra | 07-888-2572 | |
| Sterile Conical Vial (15 mL) | Falcon | 14-959-49B |
References
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