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Immunology and Infection

Immunizzazione intranasale e raccolta del latte negli studi sull'immunizzazione materna nei conigli bianchi della Nuova Zelanda(Oryctolagus cuniculus)

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

Questo articolo descrive e dimostra la somministrazione di vaccini intranasali e la raccolta di latte dai conigli in allattamento (Oryctolagus cuniculus) come mezzo per valutare l'immunità mucosa in un modello traslazionale appropriato di immunizzazione materna.

Abstract

A causa delle somiglianze nella placentation e nel trasferimento di anticorpi con l'uomo, i conigli sono un eccellente modello di immunizzazione materna. Ulteriori vantaggi di questo modello di ricerca sono la facilità di allevamento e raccolta dei campioni, il periodo di gestazione relativamente breve e le grandi dimensioni dei rifiuti. Le vie comunemente valutate di immunizzazione includono sottocutanee, intramuscolari, intranasali e intradermiche. La raccolta non clinica dei campioni per l'individuazione cronologica delle risposte immunologiche a queste vaccinazioni include la raccolta di sangue, sia da dighe che da kit, e il latte proveniente dall'allattamento lo fa. In questo articolo, dimostreremo le tecniche che il nostro laboratorio ha utilizzato negli studi sull'immunizzazione materna nei conigli bianchi della NuovaZelanda (Oryctolagus cuniculus), inclusa l'immunizzazione intranasale e la raccolta del latte.

Introduction

Gli studi sull'immunizzazione materna e sul trasferimento di anticorpi sono inestimabili per numerose ragioni, poiché questa è la via iniziale di trasferimento dell'immunità e successiva protezione da agenti patogeni e malattie nei neonati e nei neonati. L'immunizzazione materna ha il potenziale di avere un impatto positivo sulla salute sia materna che infantile a livello globale riducendo la morbilità e la mortalità associate a determinati agenti patogeni durante questo periodovulnerabile 1. L'obiettivo principale di questa strategia è aumentare i livelli di anticorpi materni specifici durante la gravidanza. Questi anticorpi possono quindi essere trasferiti al neonato e al neonato a livelli sufficienti per proteggersi dalle infezioni fino a quando il loro sistema immunitario non è abbastanza maturo da rispondereadeguatamente alle sfide 1,2,3. Lavori precedenti hanno dimostrato che i titolo di anticorpi più elevati alla nascita sono associati a una protezione completa o a un esordio ritardato e a una ridotta gravità di numerose diverse malattie infettive nel neonato, tra cui tetano, pertosse, virus respiratorio sinciziale (RSV), influenza e infezioni streptococciche di gruppo B1,2,3.

Nell'uomo, gli anticorpi materni vengono trasferiti passivamente attraverso la placenta e vengono anche trasferiti attraverso il latte materno attraverso l'allattamento. Lavori precedenti hanno dimostrato che i livelli di IgA specifici per l'HIV nel latte materno umano delle madri infettate dal virus erano associati a una ridotta trasmissione postnatale del virus, suggerendo un ruolo protettivo per il latte materno anti-HIV IgA4. Studi su primati non umani hanno dimostrato che l'immunizzazione contro l'HIV può indurre una significativa risposta anticorpale nel latte materno, e sebbene risposte IgG siere simili siano state indotte a seguito dell'immunizzazione sistemica contro mucosa, l'immunizzazione mucosa ha indotto una risposta IgA significativamentepiù elevata all'interno del latte 5,6.

L'individuazione di un modello animale trascrittariamente appropriato per tali studi dovrebbe tener conto del tipo di placentation e dei meccanismi di trasferimento passivo degli anticorpi, nonché del trasferimento di anticorpi attraverso il latte materno. Esistono tre tipi principali di placentazione nei mammiferi in base ai tipi e agli strati tissutali nell'interfaccia materno-fetale, tra cui emocorali (primati, roditori e conigli), endoteliocorali (carnivori) ed epiteliocorali (cavalli, maiali e ruminanti). La placenta emocorale è il tipo più invasivo, consentendo la comunicazione diretta tra l'apporto di sangue materno e il corione, o la membrana fetale più esterna. In base al numero di strati di trofoblasti, ci sono diverse variazioni di placentazione emocorale, tra cui la placenta emomonocorale che si trova nei primati, la placenta emodichoriale nei conigli e la placenta emotricorale osservata nei ratti e nei topi7. Questo contatto diretto tra l'apporto di sangue materno e il corione consente il trasferimento passivo di anticorpi attraverso la placenta durante la gestazione. IgG è l'unica classe di anticorpi che attraversa significativamente la placentaumana 8, mentre L'IgA è la classe predominante di Ig che si trova nel latte maternoumano 9. Dei modelli scientificamente rilevanti, solo primati (compresi gli esseri umani), conigli e cavie trasferiscono IgG in utero e IgA nel latte10,11. Pertanto, il modello del coniglio incorpora fattori paragonabili a quelli dell'uomo che controllano il trasferimento transplacentale dell'IgG e il trasferimento lattazionale dell'IgA.

Oltre a servire come modello eccezionale per l'immunità materna e lo sviluppo del vaccino, le somiglianze tra il coniglio e le cavità nasali umane li rendono un modello appropriato per l'immunizzazione intranasale. Il volume della cavità nasale del coniglio è più simile agli esseri umani rispetto ai modelli di roditori basati sulla massa corporearelativa 12. Inoltre, Casteleyn et al. Il NALT si trova principalmente all'aspetto ventrale e ventromediale del meato nasale ventrale e all'aspetto laterale e dorsolaterale del meato nasofaringeo nei conigli, mentre nei roditori, il tessuto linfoide è presente solo lungo l'aspetto ventrale del meato nasofaringeo12. Nei conigli, la struttura e la posizione dei linfociti intraepiteliali e lamina propria, così come i follicoli linfoidi isolati, sono simili agli esseriumani 12.

Ulteriori vantaggi dell'uso del coniglio come modello per l'immunità materna e mucosa includono la loro elevata fecondità e il periodo di gestazione relativamente breve. I grandi vasi sanguigni auricolari consentono un accesso relativamente facile a grandi volumi di sangue per le raccolte seriali. Una varietà di campioni di mucosa può essere raccolta per test di risposta anticorpale specifici dell'antigene, compreso il lattematerno 13 (in allattamento), le secrezioni o lavaggi della mucosa (ad esempio,orale 14,15,16, lavanda broncoalsolare13,17,18,19,vaginale 20,21,22)e le feci20,23,24,25. I campioni di latte possono essere facilmente raccolti durante l'allattamento per valutare la presenza di risposte anticorpali specifiche dell'antigene. Sebbene non sia abbondante come per gli esseri umani e i topi, un'ampia varietà di reagenti sperimentali sono disponibili per studi e saggi specifici per conigli. In questo articolo, descriveremo e dimostreremo l'immunizzazione intranasale e la raccolta del latte nei conigli bianchi della Nuova Zelanda(Oryctolagus cuniculus).

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Protocol

Tutte le procedure sono state approvate ed eseguite in conformità con le politiche della Duke University IACUC.

NOTA: I materiali necessari sono forniti nella tabella dei materiali.

1. Sedazione del coniglio e anestesia

  1. Sedare il coniglio femmina (sessualmente maturo; circa 5-30 mesi) somministrando acepromazina per via intramuscolare (IM) a una dose di 1 mg/kg. A seconda delle dimensioni dell'animale, utilizzare una siringa da 1 o 3 ml con un ago da 25 G. I muscoli epaxiali sono il sito preferito dell'iniezione intramuscolare.
    NOTA: L'acepromazina può anche essere somministrata per via sottocutanea, ma l'messaggistica istantanea è preferita dal laboratorio, in quanto agisce più rapidamente e riduce l'incidenza delle lesioni cutanee.
  2. Attendere 10-15 minuti per consentire l'effetto dell'acepromazina.
  3. Anestetizza il coniglio con isoflurane posizionando il cono del naso collegato sul naso dell'animale. Regolare il vaporizzatore fino al 4% di isoflurane combinato con fino a 4 litri / minuto di ossigeno. I conigli hanno un'alta avversione all'isoflurane, quindi è necessaria un'adeguata moderazione quando mascherano l'animale.
  4. Una volta completamente anestetizzato, come valutato dalla pinna, dal pedale e/o dal riflesso palpebrale, applicare lubrificante oftalmico su ogni occhio per evitare l'asciugatura degli occhi e la successiva ulcerazione corneale.
  5. Monitorare continuamente i riflessi e la respirazione durante l'anestesia e ridurre la velocità dell'isoflurane all'1-2% una volta raggiunto un piano adeguato di anestesia.

2. Immunizzazione intranasale

  1. Preparare la soluzione di immunizzazione prima della manipolazione degli animali.
  2. Sedate il coniglio come descritto sopra.
  3. Una volta che il membro del laboratorio è pronto a somministrare il vaccino e il coniglio si trova in un piano adeguato di anestesia, spegnere l'isoflurane e l'ossigeno e rimuovere il cono del naso.
  4. Posizionare il coniglio in recumbency dorsale e puntellare il collo e la testa con un angolo approssimativo di 45 ° che consente un facile accesso e visualizzazione di entrambi i nares da parte del membro del laboratorio che somministra il vaccino.
  5. Caricare la pipetta con non più di 100 μL della soluzione vaccinale e somministrare rapidamente la soluzione in ogni narice. La pipetta deve essere tenuta con un angolo approssimativo di 45°, angolata verso l'aspetto mediale del passaggio nasale.
    NOTA: L'obiettivo dell'immunizzazione è che la soluzione contatti la mucosa dei narici, quindi la punta non deve essere posizionata all'interno delle narici, in quanto ciò può causare abrasione o irritazione dei tessuti mucosi e potenzialmente influenzare l'immunogenicità del vaccino somministrato nasalmente. Il vaccino deve essere somministrato rapidamente e fatto allo stesso modo nell'altro rullante.
  6. Dopo la somministrazione in entrambi i passaggi nasali, mantenere il coniglio in reclinanza dorsale per 30 secondi per ridurre al minimo la perdita della soluzione vaccinale.
    NOTA: Il laboratorio in genere somministra non più di 100 μL per narice alla volta. Se deve essere somministrato un volume maggiore, con un totale massimo di 500 μL, il vaccino può essere somministrato in aliquote di 100 μL con un periodo di riposo di 30 secondi tra le vaccinazioni e somministrazioni aggiuntive di vaccino ripetute, con 30 secondi di riposo tra ogni somministrazione, fino a quando non viene consegnato il volume totale del vaccino.
  7. Dopo l'immunizzazione, posizionare il coniglio sul ventrum per il recupero e monitorare da vicino l'animale fino a quando non può mantenere la rimorsipanza sternale.

3. Raccolta del latte

  1. Sedate il coniglio in allattamento come descritto sopra.
  2. Pulire la pelle sulla vena dell'orecchio marginale con il tampone /salvietta alcolica.
  3. Utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 25 g, somministrare circa 1-2 UI di ossitocina per via endovenosa attraverso la vena dell'orecchio marginale per indurre la resa dei conti del latte.
    NOTA: A causa del rilassamento muscolare liscio, è comune che il coniglio urina o defechi dopo la somministrazione di ossitocina.
  4. Dopo la somministrazione di ossitocina, applicare pressione sul sito di iniezione con il pezzo di garza.
  5. Pur mantenendo la maschera di anestesia sul naso del coniglio, puntellare il coniglio sui quarti posteriori.
    NOTA: La raccolta del latte può anche essere eseguita con l'animale in reclinabile laterale, ma il laboratorio scopre che la raccolta è più facile quando il coniglio è sporgente sulla groppa con un assistente che tiene il coniglio in posizione verticale con la maschera di anestesia.
  6. Aprire il tubo sterile per prepararsi alla raccolta del latte e localizzare il tessuto mammario e le te capesine associate. Le capezzale sono tipicamente circondate da pellicce bagnate della recente infermieristica e il tessuto mammario è facilmente palpabile quando è pieno di latte.
  7. Afferrare il tessuto mammario associato a un tat tra il pollice e l'indice e applicare una pressione delicata e massaggiante sul tessuto ghiandolare nella direzione del tato. Posizionare il tubo di raccolta sopra il teat per raccogliere il latte espresso.
    NOTA: A volte possono essere necessario diversi minuti prima che l'ossitocina sia efficace e la produzione di latte sembra variare tra le ghiandole mammarie. Se l'espressione del latte non ha successo, attendere alcuni minuti o ruotare intorno alle ghiandole mammarie aggiuntive. Il latte di tutte le te capesine può essere raccolto nella stessa fiala. In genere, diversi millilitri di latte possono essere facilmente raccolti da una doe in allattamento.
  8. Dopo la raccolta del latte, spegnere l'isoflurane e l'ossigeno e consentire al coniglio di riprendersi mentre è attentamente monitorato fino a quando l'animale non è in grado di mantenere la reclinanza sternale.

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Representative Results

Una panoramica di un tipico progetto di studio di immunizzazione intranasale materna è descritta nella figura 1, che incorpora le immunizzazioni, l'allevamento, l'adessimento, l'allattamento e il trasferimento di anticorpi. Sebbene non sia illustrato, il sangue deve essere raccolto prima dell'immunizzazione iniziale per le misurazioni di base e per tutto il resto dello studio a intervalli regolari. Il sangue si ottiene facilmente attraverso l'arteria dell'orecchio centrale con sedazione lieve e un agente analgesico topico (ad esempio, lidocaina 2,5% e prilocaina crema al 2,5%). La presenza di livelli IgG specifici dell'antigene può essere misurata in questi campioni. I conigli femmine vengono immunizzati attraverso la via intranasale, come descritto nel protocollo e dimostrato nel video. A seconda dello studio, il vaccino può richiedere una spinta o potrebbe dover essere somministrato attraverso una via aggiuntiva (ad esempio, intramuscolare o sottocutanea). Dopo l'iniziazione allo studio, vengono allevati conigli; preferiamo acquistare allevatori comprovati dai venditori da utilizzare per garantire un tasso di gravidanza più elevato per questi studi. A seconda della tempistica di immunizzazione, i conigli possono ricevere immunizzazioni aggiuntive durante la gravidanza. L'IgG specifico dell'antigene viene trasferito traslochintalmente ai kit e a circa 30-32 giorni dopo l'allevamento, le donne incinte si adescontiranno. Si consiglia di limitare la manipolazione dei kit per i primi giorni per ridurre al minimo il rifiuto da parte delle parti. I campioni di sangue possono essere raccolti dai kit per valutare i livelli di IgG specifici dell'antigene che sono stati trasferiti trasplacentalmente (Figura 3). Oltre a un'ampia varietà di nutrienti, i kit ricevono IgA dalla doe in allattamento durante l'allattamento. I kit vengono in genere svezzati a 4-8 settimane, ma prima dello svezzamento, il latte può essere facilmente raccolto dalla allattamento, come dimostrato nel video. I campioni di latte raccolti possono quindi essere trasformati per l'individuazione di livelli di IgA totali e specifici dell'antigene (figura 4). A seconda dello studio, i vaccini (+/- potenziamenti) possono essere somministrati ai kit e i campioni di sangue seriale possono essere raccolti dai kit in tenera età utilizzando la vena safenosa laterale.

Per gli studi materni, determinare la gravidanza il prima possibile è utile per la progettazione dello studio e per garantire che la coniglia non sia necessaria per essere ribred. Le misurazioni del progesterone possono essere utilizzate come mezzo per rilevare la gravidanza. Come mostrato nella figura 2, alti livelli di progesterone possono essere rilevati nei conigli in gravidanza rispetto ai conigli non gravidi anche dopo che gli accoppiamenti di un dollaro sono stati confermati per tutti. Esistono metodi aggiuntivi per il rilevamento della gravidanza, tra cui palpazione manuale, ultrasuoni e radiografie; tuttavia, questi richiedono attrezzature personali e adeguate ben addestrate.

IgG specifico dell'antigene che è stato trasferito trasplacentalmente mentre in utero può essere misurato nel siero dei kit. Il sangue può essere raccolto da un piccolo numero di kit al momento della nascita o vicino al momento della nascita per valutare i primi livelli di anticorpi specifici dell'antigene, ma la raccolta del sangue seriale è tecnicamente molto più semplice in quanto l'età e l'aumento dei kit sono le dimensioni. Come illustrato nella figura 3, i livelli sieri di IgG specifico dell'antigene nei kit possono essere misurati da ELISA e confrontati con i livelli materni. I livelli di IgG trasferiti maternamente tendono ad essere più alti alla nascita e diminuiscono nel tempo.

Come tipo di campione di mucosa, il latte può essere raccolto e trasformato per misurare i livelli di anticorpi totali o specifici dell'antigene. Come mostrato nella figura 4, L'IgA costituisce una parte significativa dei livelli totali di anticorpi all'interno del latte materno che viene trasferito ai kit tramite allattamento. I nostri risultati dimostrano che l'IgA del latte materno produce un segnale ELISA leggermente più alto (unità di luce relative, RLU) rispetto a IgG, e sia IgA che IgG producono un segnale molto più alto del segnale per IgM. Questi risultati sono in accordo con i risultati di altri che suggeriscono che il latte di coniglio contiene circa 4,5 mg/mL IgA, 2,4 mg/mL IgG e 0,1 mg/mL IgM26,27.

Figure 1
Figura 1. Sequenza temporale di esempio per un progetto di studio di immunizzazione intranasale materna in un modello diconiglio (Oryctolagus cuniculus). I conigli femmine vengono immunizzati attraverso la via intranasale, come descritto nel protocollo e dimostrato nel video. A seconda dello studio, il vaccino può richiedere una spinta o potrebbe dover essere somministrato attraverso una via aggiuntiva (ad esempio intramuscolare o sottocutanea). I conigli vengono quindi allevati. L'IgG specifico dell'antigene viene trasferito traslochintalmente ai kit e a circa 30-32 giorni dopo l'allevamento, le donne incinte si adescontiranno. L'IgA viene passato ai kit dalla doe in allattamento durante l'allattamento. Prima dello svezzamento, il latte può essere facilmente raccolto dalla lattazione per valutare i livelli totali e specifici dell'IgA antigene. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Livelli di progesterone nei conigli in gravidanza e non in gravidanza a 3 settimane dopo la riproduzione. Il sangue è stato raccolto dai conigli a 3 settimane dopo l'allevamento. I conigli sono stati confermati in gravidanza o non in gravidanza in base alla capacità di adiccare una cucciolata a 30-32 giorni dopo l'allevamento. I livelli di progesterone sierica sono stati misurati attraverso il Michigan State University Veterinary Diagnostic Laboratory utilizzando un test immunologico chemiluminescente (CLIA) con un sistema di immunoanalisi (ad esempio, Siemens Healthineers IMMULITE 2000). Le barre di errore rappresentano un errore standard della media e la dimensione del campione consisteva di 4-6 conigli per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Livelli IgG specifici dell'antigene nei kit (rispetto ai livelli materni) alla nascita e a 3 settimane di età a seguito di una serie di vaccinazioni materne. Il sangue è stato raccolto dalle cose da fare e dai kit subito dopo l'adeguimento e a 3 settimane di età. I livelli IgG specifici dell'antigene all'interno del siero sono stati rilevati utilizzando un ELISA fluorescente come descrittoin precedenza 28. L'IgG specifico dell'antigene è tracciato come un rapporto tra i livelli rilevati nel siero del kit e nel siero materno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Un confronto dei livelli di IgA, IgM e IgG nel latte di coniglio. Il latte di coniglio è stato raccolto come descritto e dimostrato nel video. Il latte è stato lavorato con una lunga centrifugazione (13.000 x g per 4,5 ore a 4 °C) e lo strato medio chiaro è stato isolato dopo la lavorazione. I livelli totali di IgA, IgG e IgM sono stati misurati in questo strato chiaro da ELISA fluorescentecome precedentemente descritto 28, tranne per il fatto che le piastre sono state rivestite rispettivamente con anti-IgA policlonale, anti-IgG o anti-IgM per rilevare rispettivamente il coniglio totale IgA, IgG o IgM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Sebbene non descritto nel protocollo precedente, l'allevamento riuscito dei conigli è necessario per questo modello materno e per consentire la raccolta del latte. I conigli sono facilmente allevati dalla copertura dal vivo in un ambiente di ricerca. Si raccomanda di trasferire nella gabbia del dollaro per l'allevamento, così come può essere territoriale e aggressivo se tenuto nella propria gabbia con il dollaro. Se le femmine non sono ricettive dopo 15 minuti (come indicato scappando mordendo o vocalizzando), la coniglia dovrebbe essere riposta nella propria gabbia. Ci sono diversi video informativi e tutorial sull'allevamento di conigli che possono essere osservati online29, ma dopo l'allevamento, il maschio in genere cadrà e può vocalizzare. Una volta osservato questo, la coniglia può essere restituita alla sua gabbia. Un dollaro può riprodursi 2-3 volte al giorno senza alcuna diminuzione del numero dispermatozoi 30. Nel nostro protocollo approvato dalla IACUC, i dollari sono limitati all'allevamento 10-12 fa a settimana e vengono forniti almeno due giorni di riposo alla settimana, poiché le fonti affermano che un singolo dollaro è solitamente sufficiente per il servizio 10-15fa 31. Il nostro gruppo suggerisce di acquistare allevatori comprovati dal venditore per migliorare il tasso di successo riproduttivo. Poiché i conigli sono ovulatori indotti e l'ovulazione si verifica in genere 10-13 ore dopo la copulazione31, abbiamo sperimentato un tasso più elevato di gravidanza in fa che vengono allevati al mattino e poi di nuovo nel pomeriggio, o due volte all'interno di quella finestra di 10-13 ore (aumento osservato dal 75% al 95% tasso di successo, inedito). In base alla letteratura, i tassi tipici di successo riproduttivo variano dal 57-100%32,33,34,35,36,37,38,39,40e le dimensioni dei rifiuti in media circa 7-9 kit31.

Determinare la gravidanza il prima possibile è utile negli studi materni per confermare che la coniglia non ha bisogno di essere ribred o rimossa dallo studio. Le opzioni per il rilevamento della gravidanza includono palpazione (già 14 giorni)31,ultrasuoni (già 5-9 giorni)40,radiografie (già il giorno 11)31,aumento di peso e tecniche molecolari, come misurazioni dei fattori insulino-crescita41 (IGF) e progesterone34,37,38,42,43. Lavori precedenti hanno indicato elevazioni significative dei livelli di IGF-II nei conigli in gravidanza rispetto ai livelli nei conigli non gravidi41. Tuttavia, nelle nostre mani, non siamo stati in grado di rilevare una differenza nei livelli di IGF-II tra conigli gravidi e non gravidi (inediti). Poiché sono necessari adeguati livelli di progesterone per il mantenimento della gravidanza nei conigli37,44, diversi studi hanno valutato i livelli di progesterone nei conigli in gravidanza e dimostrato livelli elevati rispetto ai conigli non gravidi, in particolare durante l'organogenesi intorno alla media gestazione34,43,44. Il nostro gruppo non è stato in grado di rilevare differenze nei livelli di progesterone utilizzando un ELISA tra conigli in gravidanza e non in gravidanza, ma i risultati preliminari che utilizzano un saggio chemiluminescente automatizzato presso il Laboratorio diagnostico veterinario della Michigan State University indicano elevati livelli di progesterone nei conigli in gravidanza rispetto ai conigli non gravidi anche dopo che gli accoppiamenti di un dollaro sono stati confermati per tutti gli effetti valutati(Figura 2).

La allattamento può produrre circa 250 mL, o 60 mL/kg, di latte al giorno45,46, consentendo grandi volumi per test sperimentali per valutare risposte/concentrazioni anticorpali totali e specifiche dell'antigene. Il latte di coniglio contiene alti livelli di grassi e proteine, contenenti livelli 2 e 3 volte più concentrati di grassi e proteine, rispetto al latte vaccino e di scrofa,rispettivamente 45,47. A causa dell'alto contenuto di grassi nel latte, i campioni richiedono una lavorazione significativa, a seconda dei test da condurre. Dopo la centrifugazione del campione di latte, vengono separati tre strati distinti, tra cui le cellule all'interno dello strato inferiore, lo strato intermedio chiaro contenente le immunoglobuline e il grasso all'interno dello stratosuperiore 48. Le immunoglobuline, all'interno dello strato intermedio chiaro, sono presenti ad alte concentrazioni all'interno del colostro e del latte e sono principalmente fatte di IgA, IgG e IgM(Figura 4). Sebbene i campioni di latte siano facilmente raccolti a mano, e questa è la nostra tecnica preferita all'interno del laboratorio, i sistemi di vuoto sono stati riportati anche nellaletteratura 13,46,48. 48 hanno raccolto campioni di latte usando pressione negativa e hanno descritto una lunga centrifugazione (15.000 x g per 4 ore) per la separazione degli strati di latte prima di passare lo strato intermedio chiaro attraverso una colonna sefarose 4B per la rimozione dell'immunoglobulina. Utilizzando questo metodo, gli autori sono stati in grado di rilevare anticorpi specifici della tossina del colera all'interno del latte di conigli immunizzati per via orale a livelli sufficienti per la protezione contro la secrezione indotta da Vibrio choleraenell'intestino48. 13 campioni di latte lavorato raccolti per aspirazione con un sistema di vuoto d'acqua mediante centrifugazione a 4 °C per 2 ore a 24.000 x g. In questo studio, gli autori sono stati in grado di rilevare l'IgA anti-RSV nel colostro, nel latte e nelle secrezioni bronchiali e intestinali a seguito dell'immunizzazione mucosa (orale o intratracheale), ma non l'immunizzazione endovenosa, mentre l'IgG anti-RSV è stato rilevato in colostro, latte e siero indipendentemente dalla via di immunizzazione13.

Si deve fare attenzione durante la procedura di immunizzazione intranasale per confermare che il coniglio si trova in un piano adeguato di anestesia ed evitare di somministrare grandi volumi di vaccino contemporaneamente. Precedenti lavori del nostro gruppo hanno dimostrato che l'efficacia dell'immunizzazione intranasale è stata influenzata dall'uso dell'anestesia49. In particolare, l'anestesia profonda indotta dalla combinazione di chetamina e xiloazina correlata con una maggiore immunogenicità del vaccino somministrato nasalmente e una migliore ritenzione nasale della soluzione. Questi livelli erano significativamente più alti della ritenzione e dell'immunogenicità nei conigli immunizzati per via intranasale in seguito alla sedazione con acepromazina e butorphanolo49. Risultati simili sono stati dimostrati anche in seguito all'immunizzazione intranasale neitopi 50,51. Inoltre, il nostro lavoro ha dimostrato una maggiore immunogenicità a seguito dell'immunizzazione intranasale sotto l'anestesia profonda su animali completamente svegli e su animali sottoposti ad anestesia di durata più breve con una combinazione di acepromazina e isoflurane. Questa differenza nell'immunogenicità IgG tra anestesia di durata profonda e durata più breve è stata significativa al momento di 42 giorni ma non al punto di 56 giorni. Sebbene l'aumento dell'immunogenicità e della ritenzione possa derivare dall'anestesia più profonda, i conigli hanno richiesto almeno 30 minuti per riprendersi; mentre i conigli erano eretti e mobili entro 5 minuti dalla ricezione del vaccino nasale dopo la durata più breve dell'anestesia indotta da isoflurane. Sebbene l'anestesia possa non essere ideale per imitare l'impostazione clinica per l'immunizzazione intranasale nell'uomo, un'anestesia di durata più breve (ad esempio, isoflurane) può essere preferita a un'anestesia più lunga e profonda con agenti iniettabili (ad esempio, chetamina + xiazina). L'uso di un modello animale, come dimostrato nella causa Gwinn etal. Una potenziale limitazione per l'uso dell'anestesia con somministrazione di vaccini nei modelli animali è il suo effetto sulla capacità dell'animale di indurre un'adeguata risposta immunitaria al vaccino. È interessante notare che i rapporti in letteratura suggeriscono che l'isoflurane può attenuare le risposte infiammatorie sistemiche, fornendo protezione controle sfide 52 e riducendo lo stress ossidativo e l'infiammazione53.

Per quanto riguarda la minimizzazione della perdita vaccinale e un'adeguata consegna intranasale, il nostro gruppo raccomanda un periodo di riposo di 30 secondi dopo la somministrazione di ogni aliquota del vaccino intranasale per consentire la ritenzione della soluzione all'interno della cavità nasale e per evitare che la soluzione estrae dalle narici se il coniglio viene immediatamente messo in rimempa sternale e restituito alla gabbia. Inoltre, è importante limitare il volume dell'aliquota somministrata per garantire l'immunizzazione intranasale, poiché l'assorbimento della mucosa è limitato dalla superficie del passaggio nasale. Se viene somministrato un grande volume, la soluzione può bypassare la mucosa nasale e provocare l'immunizzazione inalatoria o gastrica. Il nostro gruppo raccomanda aliquote di 100 μL per narice con un volume intranasale massimo di 500 μL.

Questo articolo si concentra sulla somministrazione di vaccini mucosi, in particolare attraverso la via intranasale, ma ci sono diversi metodi di immunizzazione, sia mucosa che parenterale che sono stati dimostrati nei conigli. Questi metodi aggiuntivi includono, ma non sono limitati a, orale, sottocutaneo, intramuscolare e intradermico. Come tale, i campioni da raccogliere e valutare variano in base agli obiettivi sperimentali e alla via di immunizzazione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere la Divisione di risorse animali di laboratorio della Duke University e il loro team di allevamento per la loro assistenza e grande cura fornita agli animali. Inoltre, gli autori vorrebbero riconoscere il team PhotoPath all'interno del Dipartimento di Patologia per la loro assistenza con le parti audio e video del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di ricerca discrezionali del laboratorio Staats.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

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References

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Immunologia e infezione Numero 173 Immunizzazione materna immunizzazione intranasale immunizzazione mucosa raccolta del latte latte di coniglio Oryctolagus cuniculus.
Immunizzazione intranasale e raccolta del latte negli studi sull'immunizzazione materna nei conigli bianchi della Nuova Zelanda<em>(Oryctolagus cuniculus)</em>
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Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

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