Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Inmunización intranasal y recolección de leche en estudios de inmunización materna en conejos blancos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

Este artículo describe y demuestra la administración de vacunas intranasales y la colección de leche de los conejos lactantes (Cuniculus de Oryctolagus) como medios de evaluar inmunidad de la mucosa en un modelo traslacional apropiado de la inmunización maternal.

Abstract

Debido a las similitudes en la placentación y la transferencia de anticuerpos con los humanos, los conejos son un excelente modelo de inmunización materna. Las ventajas adicionales de este modelo de investigación son la facilidad de reproducción y recolección de muestras, el período de gestación relativamente corto y los grandes tamaños de camada. Las vías de inmunización comúnmente evaluadas incluyen subcutánea, intramuscular, intranasal e intradérmica. La recolección de muestras no terminales para la detección cronológica de las respuestas inmunológicas a estas inmunizaciones incluye la recolección de sangre, tanto de presas como de kits, y la leche de la lactancia. En este artículo, demostraremos las técnicas que nuestro laboratorio ha utilizado en estudios de inmunización materna en conejos blancos de Nueva Zelanda(Oryctolagus cuniculus),incluida la inmunización intranasal y la recolección de leche.

Introduction

Los estudios de inmunización materna y transferencia de anticuerpos son invaluables por numerosas razones, ya que esta es la ruta inicial de transferencia de inmunidad y la posterior protección contra patógenos y enfermedades en recién nacidos y bebés. La inmunización materna tiene el potencial de tener un impacto positivo en la salud materna y del lactante/niño a nivel mundial al reducir la morbilidad y la mortalidad asociadas con ciertos patógenos durante este período vulnerable1. El objetivo principal de esta estrategia es aumentar los niveles de anticuerpos maternos específicos durante todo el embarazo. Estos anticuerpos pueden entonces ser transferidos al recién nacido y al bebé a niveles suficientes para proteger contra infecciones hasta que su sistema inmunológico esté lo suficientemente maduro como para responder adecuadamente a los desafíos1,2,3. Trabajos anteriores han demostrado que los títulos de anticuerpos más altos al nacer se asocian con una protección completa o con un inicio tardío y una gravedad reducida de numerosas enfermedades infecciosas diferentes en el recién nacido, incluyendo tétanos, tos ferina, virus sincitial respiratorio (RSV), influenza e infecciones estreptocócicas del grupo B1,2,3.

En los seres humanos, los anticuerpos maternos se transfieren pasivamente a través de la placenta y también se transfieren a través de la leche materna a través de la lactancia. Trabajos anteriores han demostrado que los niveles de IgA específicos del VIH en la leche materna humana de madres infectadas con el virus se asociaron con la reducción de la transmisión postnatal del virus, lo que sugiere un papel protector de la leche materna contra el VIH IgA4. Estudios en primates no humanos han demostrado que la inmunización contra el VIH puede inducir una respuesta significativa de anticuerpos en la leche materna, y aunque se indujeron respuestas similares a la IgG sérica después de la inmunización sistémica versus de la mucosa, la inmunización de la mucosa indujo una respuesta IgA significativamente mayor dentro de la leche5,6.

La identificación de un modelo animal apropiado traslacionalmente para estos estudios debe tener en cuenta el tipo de placentación y los mecanismos de transferencia pasiva de anticuerpos, así como la transferencia de anticuerpos a través de la leche materna. Hay tres tipos principales de placentación en mamíferos basados en los tipos de tejido y capas en la interfaz materno-fetal, incluyendo hemocorial (primates, roedores y conejos), endoteliocorial (carnívoros) y epiteliocorial (caballos, cerdos y rumiantes). La placenta hemocorial es el tipo más invasivo, lo que permite la comunicación directa entre el suministro de sangre materna y el corion, o la membrana fetal más externa. Con base en el número de capas de trofoblastos, existen varias variaciones de placentación hemocorial, incluyendo la placenta hemomonocorial encontrada en primates, la placenta hemodicorial en conejos y la placenta hemotricorial observada en ratas y ratones7. Este contacto directo entre el suministro de sangre materna y el corion permite la transferencia pasiva de anticuerpos a través de la placenta durante la gestación. IgG es la única clase de anticuerpos que atraviesa significativamente la placenta humana8,mientras que IgA es la clase predominante de Ig que se encuentra en la leche materna humana9. De los modelos científicamente relevantes, sólo los primates (incluidos los humanos), los conejos y los conejillos de Indias transfieren IgG en el útero e IgA en la leche10,11. Por lo tanto, el modelo de conejo incorpora factores comparables a los de los humanos que controlan la transferencia transplacental de IgG y la transferencia de IgA.

Además de servir como un modelo excepcional para la inmunidad materna y el desarrollo de vacunas, las similitudes entre el conejo y las cavidades nasales humanas las convierten en un modelo apropiado para la inmunización intranasal. El volumen de la cavidad nasal del conejo es más similar a los humanos que los modelos de roedores basados en la masa corporal relativa12. Además, Casteleyn et al. 12 demostraron que el tejido linfoide asociado nasal (NALT) es más voluminoso en el conejo en comparación con los roedores. El NALT se localiza principalmente en el aspecto ventral y ventromedial del meato nasal ventral y en el aspecto lateral y dorsolateral del meato nasofaríngeo en conejos, mientras que en roedores, el tejido linfoide sólo está presente a lo largo del aspecto ventral del meato nasofaríngeo12. En los conejos, la estructura y localización de los linfocitos intraepiteliales y de la lámina propia, así como de los folículos linfoides aislados, son similares a los humanos12.

Las ventajas adicionales de usar el conejo como modelo para la inmunidad materna y de la mucosa incluyen su alta fecundidad y su período de gestación relativamente corto. Los vasos sanguíneos auriculares grandes permiten el acceso relativamente fácil a los grandes volúmenes de sangre para las colecciones seriales. Se puede recolectar una variedad de muestras de la mucosa para ensayos de respuesta de anticuerpos específicos del antígeno, incluida la leche materna13 (al amamantar), secreciones o lavados de la mucosa (por ejemplo,oral 14,15,16,lavado broncoalveolar13,17,18,19,vaginal20,21,22)y heces20,23,24,25. Las muestras de leche se pueden recolectar fácilmente durante la lactancia para evaluar la presencia de respuestas de anticuerpos específicos del antígeno. Aunque no es tan abundante como para los seres humanos y los ratones, una amplia variedad de reactivos experimentales están disponibles para estudios y ensayos específicos de conejos. En este artículo, describiremos y demostraremos la inmunización intranasal y la recolección de leche en conejos blancos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con las políticas de la IACUC de la Universidad de Duke.

NOTA: Los materiales necesarios se proporcionan en la Tabla de materiales.

1. Sedación y anestesia del conejo

  1. Sedar el conejo hembra (sexualmente maduro; aproximadamente 5-30 meses de edad) mediante la administración de acepromazina por vía intramuscular (IM) a una dosis de 1 mg/kg. Dependiendo del tamaño del animal, use una jeringa de 1 o 3 ml con una aguja de 25 G. Los músculos epaxiales son el sitio preferido de la inyección intramuscular.
    NOTA: La acepromazina también se puede administrar por vía subcutánea, pero el laboratorio prefiere la IM, ya que actúa más rápidamente y reduce la incidencia de lesiones cutáneas.
  2. Espere de 10 a 15 minutos para permitir que la acepromazina suba efecto.
  3. Anestesiar el conejo con isoflurano colocando el cono de la nariz conectado sobre la nariz del animal. Ajuste el vaporizador a hasta un 4% de isoflurano combinado con hasta 4 litros/minuto de oxígeno. Los conejos tienen una alta aversión al isoflurano, por lo que es necesaria una restricción adecuada al enmascarar al animal.
  4. Una vez completamente anestesiado, según lo evaluado por el pabellón pinna, el pedal y/o el reflejo palpebral, aplique lubricante oftálmico a cada ojo para evitar el secado de los ojos y la posterior ulceración corneal.
  5. Monitoree continuamente los reflejos y la respiración durante la anestesia, y reduzca la tasa de isoflurano al 1-2% una vez que se ha alcanzado un plano adecuado de anestesia.

2. Inmunización intranasal

  1. Prepare la solución de la inmunización antes de la manipulación animal.
  2. Sedar el conejo como se describió anteriormente.
  3. Una vez que el miembro del laboratorio esté listo para administrar la vacuna y el conejo esté en un plano adecuado de anestesia, apague el isoflurano y el oxígeno y retire el cono de la nariz.
  4. Coloque el conejo en reclinación dorsal, y sujete el cuello y la cabeza en un ángulo aproximado de 45° que permita un fácil acceso y visualización de ambas narinas por parte del miembro del laboratorio que administra la vacuna.
  5. Cargue la pipeta con no más de 100 μL de la solución vacunal y administre rápidamente la solución en cada fosa nasal. La pipeta debe mantenerse en un ángulo aproximado de 45°, en ángulo hacia el aspecto medial del conducto nasal.
    NOTA: El objetivo de la inmunización es que la solución entre en contacto con la membrana mucosa de las narinas, por lo que la punta no debe colocarse dentro de las narinas, ya que esto puede resultar en abrasión o irritación de los tejidos de la mucosa y potencialmente influir en la inmunogenicidad de la vacuna administrada por vía nasal. La vacuna debe administrarse rápidamente y hacerse de la misma manera en la otra nara.
  6. Después de la administración en ambas fosas nasales, mantenga el conejo en reclinación dorsal durante 30 segundos para minimizar la fuga de la solución de la vacuna.
    NOTA: El laboratorio normalmente no administrará más de 100 μL por fosa nasal a la vez. Si se va a administrar un volumen mayor, con un total máximo de 500 μL, la vacuna puede administrarse en alícuotas de 100 μL con un período de descanso de 30 segundos entre inmunizaciones, y administraciones adicionales de vacuna repetidas, con 30 segundos de reposo entre cada administración, hasta que se entregue el volumen total de la vacuna.
  7. Después de la inmunización, coloque el conejo en el ventrum para su recuperación y vigile de cerca al animal hasta que pueda mantener la reclinación esternal.

3. Recolección de leche

  1. Sedar el conejo lactante como se describió anteriormente.
  2. Limpie la piel sobre la vena marginal del oído con el hisopo/toallita de alcohol.
  3. Usando una jeringa de 1 ml y una aguja de 25 g, administre aproximadamente 1-2 UI de oxitocina por vía intravenosa a través de la vena marginal del oído para inducir la decepción de la leche.
    NOTA: Debido a la relajación del músculo liso, es común que el conejo orine o defeque después de la administración de oxitocina.
  4. Después de la administración de oxitocina, aplique presión al sitio de inyección con el pedazo de gasa.
  5. Mientras mantiene la máscara de anestesia sobre la nariz del conejo, apoya al conejo en sus cuartos traseros.
    NOTA: La recolección de leche también se puede realizar con el animal en reclinación lateral, pero el laboratorio encuentra que la recolección es más fácil cuando el conejo está apoyado en su grupa con un asistente que sostiene el conejo en posición vertical con la máscara de anestesia.
  6. Abra el tubo estéril para prepararse para la recolección de leche y localice el tejido mamario y las tetinas asociadas. Las tetinas están típicamente rodeadas por piel húmeda de la lactancia reciente, y el tejido mamario es fácilmente palpable cuando está lleno de leche.
  7. Agarre el tejido mamario asociado con un pezón entre el pulgar y el índice y aplique una presión suave y masajeadora al tejido glandular en la dirección del pezón. Coloque el tubo de recolección sobre el pezón para recoger la leche extraída.
    NOTA: A veces puede tomar varios minutos para que la oxitocina sea efectiva, y la producción de leche parece variar entre las glándulas mamarias. Si la expresión de la leche no es exitosa, espere varios minutos o gire alrededor de las glándulas mamarias adicionales. La leche de todas las tetinas se puede recoger en el mismo vial. Por lo general, varios mililitros de leche se pueden recolectar fácilmente de una dora lactante.
  8. Después de la recolección de leche, apague el isoflurano y el oxígeno, y permita que el conejo se recupere mientras es monitoreado de cerca hasta que el animal pueda mantener la reclinación esternal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En la Figura 1se muestra una visión general de un diseño típico de un estudio de inmunización intranasal materna, que incorpora las inmunizaciones, la reproducción, el encamiento, la lactancia y la transferencia de anticuerpos. Aunque no se ilustra, la sangre se debe recoger antes de la inmunización inicial para las medidas de la línea de fondo y a través del resto del estudio a intervalos regulares. La sangre se obtiene fácilmente a través de la arteria del oído central con sedación leve y un agente analgésico tópico (por ejemplo, lidocaína al 2,5% y crema prilocaína al 2,5%). La presencia de niveles antígeno-específicos de IgG se puede medir en estas muestras. Los conejos hembras se inmunizan por vía intranasal, como se describe en el protocolo y se demuestra en el vídeo. Dependiendo del estudio, la vacuna puede requerir un impulso o puede necesitar administrarse a través de una vía adicional (por ejemplo, intramuscular o subcutánea). Después de la iniciación del estudio, se crían conejos; preferimos comprar criadores probados de vendedores para usar para asegurar una tasa de embarazo más alta para estos estudios. Dependiendo del calendario de inmunización, los conejos pueden recibir inmunizaciones adicionales durante todo el embarazo. La IgG específica del antígeno se transfiere transplacentemente a los kits, y aproximadamente a los 30-32 días después de la reproducción, las gestantes se encenderán. Recomendamos limitar el manejo de kits durante los primeros días para minimizar el rechazo de los hace. Se pueden recoger muestras de sangre de los kits para evaluar los niveles de IgG específicos del antígeno que se transfirieron transplacentemente (Figura 3). Además de una amplia variedad de nutrientes, los kits reciben IgA de la dora lactante mientras amamanta. Los kits se desteten típicamente a las 4-8 semanas, pero antes del destete, la leche se puede recolectar fácilmente de la lactancia, como se demuestra en el video. Las muestras de leche recogidas pueden ser procesadas para la detección de niveles totales y específicos de IgA de antígenos (Figura 4). Dependiendo del estudio, las vacunas (+/- los aumentos) se pueden administrar a los kits, y las muestras de sangre seriales se pueden recoger de los kits en una edad muy temprana usando la vena safena lateral.

Para los estudios maternos, determinar el embarazo lo antes posible es útil para el diseño del estudio y para garantizar que la dora no necesite ser rebred. Las mediciones de progesterona se pueden utilizar como un medio para detectar el embarazo. Como se muestra en la Figura 2,se pueden detectar niveles elevados de progesterona en conejos preñadas en comparación con conejos no preñadas, incluso después de que se confirmaron los apareamientos por un dólar para todos. Hay métodos adicionales para la detección del embarazo, incluyendo palpación manual, ultrasonido y radiografías; sin embargo, estos requieren equipo personal y adecuado bien entrenado.

IgG Antígeno-específico que fue transferido transplacentally mientras que en el útero se puede medir en el suero de kits. La sangre se puede recolectar de un pequeño número de kits en o cerca del momento del nacimiento para evaluar los niveles tempranos de anticuerpos específicos de antígenos, pero la recolección de sangre en serie es técnicamente mucho más fácil ya que los kits envejecen y el aumento es el tamaño. Como se muestra en la Figura 3,los niveles séricos de IgG específica de antígeno en los kits pueden medirse mediante ELISA y compararse con los niveles maternos. Los niveles de IgG transferidos maternamente tienden a ser más altos al nacer y disminuyen con el tiempo.

Como tipo de muestra de la mucosa, la leche se puede recoger y procesar para medir niveles totales o antígeno-específicos del anticuerpo. Como se muestra en la Figura 4,la IgA constituye una parte significativa de los niveles totales de anticuerpos dentro de la leche materna que se está transfiriendo a los kits a través de la lactancia. Nuestros resultados demuestran que la leche materna IgA produce una señal ELISA ligeramente más alta (unidades de luz relativa, RLU) en comparación con IgG, y tanto IgA como IgG producen una señal que es mucho mayor que la señal para IgM. Estos resultados están de acuerdo con los resultados de otros que sugieren que la leche de conejo contiene alrededor de 4,5 mg/mL IgA, 2,4 mg/mL IgG y 0,1 mg/mL IgM26,27.

Figure 1
Figura 1. Línea de tiempo de la muestra para un diseño maternal del estudio intranasal de la inmunización en un modelo del conejo (Cuniculus de Oryctolagus). Los conejos hembras se inmunizan por vía intranasal, como se describe en el protocolo y se demuestra en el vídeo. Dependiendo del estudio, la vacuna puede requerir un impulso o puede necesitar ser administrada a través de una vía adicional (por ejemplo, intramuscular o subcutánea). Los conejos se crían entonces. La IgG específica del antígeno se transfiere transplacentemente a los kits, y aproximadamente a los 30-32 días después de la reproducción, las gestantes se encenderán. La IgA se pasa a los kits de la dora lactante mientras amamanta. Antes del destete, la leche se puede recoger fácilmente de la lactancia hace para evaluar niveles totales y antígeno-específicos de IgA. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Niveles de progesterona en conejos preñadas y no preñadas a las 3 semanas posteriores a la reproducción. La sangre fue recogida de conejos en 3 semanas de poste-crianza. Los conejos fueron confirmados como preñadas o no embarazadas en base a la capacidad de encender una camada a los 30-32 días después de la reproducción. Los niveles de la progesterona del suero fueron medidos a través del laboratorio de diagnóstico veterinario de la universidad de estado de Michigan usando un immunoensayo quimioluminiscente (CLIA) con un sistema del immunoensayo (e.g., Siemens Healthineers IMMULITE 2000). Las barras de error representan el error estándar de la media, y el tamaño de la muestra consistió en 4-6 conejos por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Niveles de IgG específicos de antígenos en kits (en relación con los niveles maternos) al nacer y a las 3 semanas de edad después de una serie de inmunizaciones maternas. La sangre fue recogida de los hace y de los kits pronto después de encender y en 3 semanas de la edad. los niveles Antígeno-específicos de IgG dentro del suero fueron detectados usando un ELISA fluorescente según lo descritopreviamente 28. IgG Antígeno-específico se traza como ratio de los niveles detectados en el suero del kit y el suero maternal. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Una comparación de los niveles de IgA, IgM e IgG en la leche de conejo. La leche de conejo fue recolectada como se describe y se demuestra en el video. La leche se procesó por una centrifugación larga (13.000 x g durante 4,5 horas a 4 °C), y la capa media clara se aisló después del procesamiento. Los niveles totales de IgA, IgG e IgM fueron medidos en esta capa clara por ELISA fluorescente según lo descritopreviamente 28,excepto que las placas fueron cubiertas con anti-IgA policlone, anti-IgG, o anti-IgM para detectar el conejo total IgA, IgG, o IgM, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aunque no se describe en el protocolo anterior, la cría exitosa de los conejos es necesaria para este modelo materno y para permitir la recolección de leche. Los conejos son fácilmente criados por cubierta viva en un entorno de investigación. Se recomienda que se transfiera a la jaula del buck para la cría, ya que puede ser territorial y agresivo si se mantiene en su propia jaula con el buck. Si las hembras no son receptivas después de 15 minutos (como lo indica huir mordiendo o vocalizando), la dora debe ser colocada de nuevo en su propia jaula. Hay varios videos informativos y tutoriales sobre la cría de conejos que se pueden observar en línea29, pero después de la cría, el macho normalmente se caerá y puede vocalizar. Una vez que esto se observa, la mente puede ser devuelta a su jaula. Un dólar puede reproducirse 2-3 veces al día sin disminución en el recuento de espermatozoides30. En nuestro protocolo aprobado por IACUC, los dólares se limitan a la cría de 10-12 hace por semana y se proporcionan al menos dos días de descanso por semana, ya que las fuentes afirman que un solo dólar suele ser suficiente para el servicio 10-15 hace31. Nuestro grupo sugiere la compra de criadores probados del proveedor para mejorar la tasa de éxito de la cría. Como los conejos son ovuladores inducidos y la ovulación ocurre típicamente 10-13 horas después de la cópula31,hemos experimentado una tasa más alta de embarazo en hace que se crían por la mañana y luego de nuevo por la tarde, o dos veces dentro de esa ventana de 10-13 horas (aumento observado del 75% al 95% tasa de éxito, inédito). De acuerdo con la literatura, las tasas de éxito de cría típicas varían de 57-100%32,33,34,35,36,37,38,39, 40,y los tamaños de camada promedian aproximadamente 7-9 kits31.

Determinar el embarazo lo antes posible es útil en los estudios maternos para confirmar que la dora no necesita ser reprimido o retirado del estudio. Las opciones para la detección del embarazo incluyen la palpación (tan pronto como 14 días)31,ultrasonido (tan pronto como 5-9 días)40,radiografías (tan pronto como el día 11)31,aumento de peso, y técnicas moleculares, tales como medidas de los factores de crecimiento de la insulina41 (IGF) y progesterona34,37,38,42,43. Trabajos anteriores han indicado elevaciones significativas de los niveles de IGF-II en conejos preñadas en comparación con los niveles en conejos no preñadas41. Sin embargo, en nuestras manos, no pudimos detectar una diferencia en los niveles de IGF-II entre conejos preñadas y no embarazadas (inéditos). Como los niveles adecuados de progesterona son necesarios para el mantenimiento del embarazo en conejos37,44,varios estudios han evaluado los niveles de progesterona en conejos preñadas y han demostrado niveles elevados en relación con los conejos no preñadas, particularmente durante la organogénesis alrededor de la mitad de la gestación34,43,44. Nuestro grupo no pudo detectar diferencias en los niveles de progesterona utilizando un ELISA entre conejos preñadas y no preñadas, pero los resultados preliminares utilizando un ensayo quimioluminiscente automatizado en el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad Estatal de Michigan indican niveles elevados de progesterona en conejos preñadas en comparación con conejos no preñadas, incluso después de que se confirmaron apareamientos por un dólar para todos los hace evaluados(Figura 2).

La lactancia puede producir aproximadamente 250 mL, o 60 mL/kg, de leche diariamente45,46,lo que permite grandes volúmenes para ensayos experimentales para evaluar las respuestas/concentraciones totales y específicas de anticuerpos antígenos. La leche de conejo contiene altos niveles de grasa y proteína, conteniendo 2 y 3 veces más niveles concentrados de grasa y proteína, en comparación con la leche de vaca y cerda, respectivamente45,47. Debido al alto contenido de grasa en la leche, las muestras requieren un procesamiento significativo, dependiendo de los ensayos a realizar. Después de la centrifugación de la muestra de leche, se separan tres capas distintas, incluidas las células dentro de la capa inferior, la capa intermedia clara que contiene las inmunoglobulinas y la grasa dentro de la capa superior48. Las inmunoglobulinas, dentro de la capa intermedia clara, están presentes en altas concentraciones dentro del calostro y la leche y se componen principalmente de IgA, IgG e IgM(Figura 4). Aunque las muestras de leche se recogen fácilmente a mano, y esta es nuestra técnica preferida dentro del laboratorio, los sistemas de vacío también se han reportado en la literatura13,46,48. Yoshiyama et al.48 recogieron muestras de leche utilizando presión negativa y describieron una larga centrifugación (15.000 x g durante 4 horas) para la separación de las capas de leche antes de pasar la capa intermedia clara a través de una columna Sepharose 4B para la eliminación de inmunoglobulinas. Utilizando este método, los autores pudieron detectar anticuerpos específicos de la toxina del cólera dentro de la leche de conejo de conejos inmunizados por vía oral a niveles suficientes para la protección contra la secreción inducida por Vibrio choleraeen el intestino48. Peri et al.13 muestras de leche procesadas recogidas por aspiración con un sistema de vacío de agua por centrifugación a 4 °C durante 2 horas a 24.000 x g. En este estudio, los autores pudieron detectar IgA anti-RSV en el calostro, la leche y las secreciones bronquiales e intestinales después de la inmunización de la mucosa (oral o intratraqueal), pero no la inmunización intravenosa, mientras que la igG anti-RSV se detectó en calostro, leche y suero independientemente de la ruta de inmunización13.

Se debe tener cuidado durante el procedimiento de inmunización intranasal para confirmar que el conejo está en un plano adecuado de anestesia y para evitar la administración de grandes volúmenes de vacuna a la vez. Trabajos previos de nuestro grupo han demostrado que la eficacia de la inmunización intranasal fue influenciada por el uso de la anestesia49. Específicamente, la anestesia profunda inducida por la combinación de ketamina y xilazina se correlacionó con el aumento de la inmunogenicidad de la vacuna administrada por vía nasal y la mejora de la retención nasal de la solución. Estos niveles fueron significativamente superiores a la retención e inmunogenicidad en conejos inmunizados intranasalmente tras sedación con acepromazina y butorfanol49. También se han demostrado hallazgos similares tras la inmunización intranasal en ratones50,51. Además, nuestro trabajo demostró una mayor inmunogenicidad después de la inmunización intranasal bajo anestesia profunda sobre animales que estaban completamente despiertos y sobre animales sometidos a anestesia de menor duración con una combinación de acepromazina e isoflurano. Esta diferencia en la inmunogenicidad de IgG entre la anestesia profunda versus la de menor duración fue significativa en el punto de tiempo de 42 días, pero no en el punto de tiempo de 56 días. Aunque el aumento de la inmunogenicidad y la retención pueden resultar de la anestesia más profunda, los conejos requirieron al menos 30 minutos para recuperarse; mientras que, los conejos eran verticales y móviles en el plazo de 5 minutos de recibir la vacuna nasal que seguía la anestesia isoflurane-inducida de menor duración. Aunque la anestesia puede no ser ideal para imitar el entorno clínico para la inmunización intranasal en humanos, se puede preferir una anestesia de menor duración (por ejemplo, isoflurano) a una anestesia más larga y profunda con agentes inyectables (por ejemplo, ketamina + xilazina). El uso de un modelo animal, como se demuestra en Gwinn et al.49,a menudo requerirá el uso de sedación o anestesia para permitir el manejo seguro de los animales y la administración efectiva y consistente de la vacuna. Una limitación potencial para el uso de anestesia con la administración de la vacuna en modelos animales es su efecto sobre la capacidad del animal para inducir una respuesta inmune apropiada a la vacuna. Curiosamente, los informes en la literatura sugieren que el isoflurano puede atenuar las respuestas inflamatorias sistémicas, proporcionando protección contra los desafíos52 y reduciendo el estrés oxidativo y la inflamación53.

Con respecto a la minimización de la pérdida de la vacuna y la entrega intranasal adecuada, nuestro grupo recomienda un período de descanso de 30 segundos después de administrar cada alícuota de la vacuna intranasal para permitir la retención de la solución dentro de la cavidad nasal y para evitar que la solución se filtre de las fosas nasales si el conejo se coloca inmediatamente en reclinación esternal y se devuelve a la jaula. Además, es importante limitar el volumen de la alícuota administrada para asegurar la inmunización intranasal, ya que la absorción de la mucosa está limitada por el área superficial del conducto nasal. Si se administra un gran volumen, la solución puede pasar por alto la mucosa nasal y dar lugar a la inmunización inhalacional o gástrica. Nuestro grupo recomienda alícuotas de 100 μL por fosa nasal con un volumen intranasal máximo de 500 μL.

Este artículo se centra en la entrega de la vacuna de la mucosa, específicamente vía la ruta intranasal, pero hay métodos múltiples de inmunización, de la mucosa y parenteral que se han demostrado en conejos. Estos métodos adicionales incluyen, pero no se limitan a, oral, subcutáneo, intramuscular, e intradérmico. Como tal, las muestras que se recogerán y evaluarán varían en función de los objetivos experimentales y la ruta de inmunización.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a la División de Recursos de Animales de Laboratorio de la Universidad de Duke y a su equipo de cría por su asistencia y gran cuidado prestado a los animales. Además, a los autores les gustaría reconocer al equipo de PhotoPath dentro del Departamento de Patología por su asistencia con las partes de audio y video del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por fondos de investigación discrecionales del laboratorio Staats.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz, F. M. Current Challenges and Achievements in Maternal Immunization Research. Frontiers in Immunology. 9, 436 (2018).
  2. Kachikis, A., Englund, J. A. Maternal immunization: Optimizing protection for the mother and infant. The Journal of Infection. 72, Suppl 83-90 (2016).
  3. Omer, S. B. Maternal Immunization. The New England Journal of Medicine. 376 (13), 1256-1267 (2017).
  4. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. , 01560 (2015).
  5. Fouda, G. G. A., et al. Mucosal Immunization of Lactating Female Rhesus Monkeys with a Transmitted/Founder HIV-1 Envelope Induces Strong Env-Specific IgA Antibody Responses in Breast Milk. Journal of Virology. 87 (12), 6986-6999 (2013).
  6. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces Robust IgA-Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
  7. Furukawa, S., Kuroda, Y., Sugiyama, A. A comparison of the histological structure of the placenta in experimental animals. Journal of Toxicologic Pathology. 27 (1), 11-18 (2014).
  8. Palmeira, P., Quinello, C., Silveira-Lessa, A. L., Zago, C. A., Carneiro-Sampaio, M. IgG placental transfer in healthy and pathological pregnancies. Clinical & Developmental Immunology. 2012, 985646 (2012).
  9. Macchiaverni, P., et al. Mother to child transfer of IgG and IgA antibodies against Dermatophagoides pteronyssinus. Scandinavian Journal of Immunology. 74 (6), 619-627 (2011).
  10. Pentsuk, N., vander Laan, J. W. An interspecies comparison of placental antibody transfer: new insights into developmental toxicity testing of monoclonal antibodies. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 86 (4), 328-344 (2009).
  11. Butler, J. E., Rainard, P., Lippolis, J., Salmon, H., Kacskovics, I., et al. Mucosal Immunology. Mestecky, J., et al. , Academic Press. Ch. 116 2269-2306 (2015).
  12. Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Vanden Broeck, W. NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit. Veterinary Immunology Immunopathology. 133 (2-4), 212-218 (2010).
  13. Peri, B. A., et al. Antibody content of rabbit milk and serum following inhalation or ingestion of respiratory syncytial virus and bovine serum albumin. Clinical and Experimental Immunology. 48 (1), 91-101 (1982).
  14. Fukuizumi, T., Inoue, H., Tsujisawa, T., Uchiyama, C. Tonsillar application of killed Streptococcus mutans induces specific antibodies in rabbit saliva and blood plasma without inducing a cross-reacting antibody to human cardiac muscle. Infection and Immunity. 65 (11), 4558-4563 (1997).
  15. Saeed, M. I., Omar, A. R., Hussein, M. Z., Elkhidir, I. M., Sekawi, Z. Development of enhanced antibody response toward dual delivery of nano-adjuvant adsorbed human Enterovirus-71 vaccine encapsulated carrier. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (10), 2414-2424 (2015).
  16. Ma, Y., et al. Vaccine delivery to the oral cavity using coated microneedles induces systemic and mucosal immunity. Pharmaceutical Research. 31 (9), 2393-2403 (2014).
  17. Jarvinen, L. Z., Hogenesch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Induction of protective immunity in rabbits by coadministration of inactivated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Infection and Immunity. 66 (8), 3788-3795 (1998).
  18. Suckow, M. A., Bowersock, T. L., Nielsen, K., Grigdesby, C. F. Enhancement of respiratory immunity to Pasteurella multocida by cholera toxin in rabbits. Laboratory Animals. 30 (2), 120-126 (1996).
  19. Jarvinen, L. Z., HogenEsch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Intranasal vaccination of New Zealand white rabbits against pasteurellosis, using alginate-encapsulated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Comparative Medicine. 50 (3), 263-269 (2000).
  20. Winchell, J. M., Routray, S., Betts, P. W., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal and systemic antibody responses to a C4/V3 construct following DNA vaccination of rabbits via the Peyer's patch. The Journal of Infectious Diseases. 178 (3), 850-853 (1998).
  21. Wegmann, F., et al. A novel strategy for inducing enhanced mucosal HIV-1 antibody responses in an anti-inflammatory environment. PLoS One. 6 (1), 15861 (2011).
  22. Winchell, J. M., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal immune response to an HIV C4/V3 peptide following nasal or intestinal immunization of rabbits. AIDS Research and Human Retroviruses. 13 (10), 881-889 (1997).
  23. Knudsen, C., et al. Quantitative feed restriction rather than caloric restriction modulates the immune response of growing rabbits. The Journal of Nutrition. 145 (3), 483-489 (2015).
  24. Ciarlet, M., et al. Subunit rotavirus vaccine administered parenterally to rabbits induces active protective immunity. Journal of Virology. 72 (11), 9233-9246 (1998).
  25. Denchev, V., Mitov, I., Marinova, S., Linde, K. Local and systemic immune response in rabbits after intraintestinal immunization with a double-marker attenuated strain of Salmonella typhimurium. Journal of Hygiene, Epidemiology, Microbiology, and Immunology. 32 (4), 457-465 (1988).
  26. Watson, D. L. Immunological functions of the mammary gland and its secretion--comparative review. Australian Journal of Biological Sciences. 33 (4), 403-422 (1980).
  27. Lascelles, A. K., McDowell, G. H. Localized humoral immunity with particular reference to ruminants. Transplantation Reviews. 19, 170-208 (1974).
  28. Jones, D. I., et al. Optimized Mucosal Modified Vaccinia Virus Ankara Prime/Soluble gp120 Boost HIV Vaccination Regimen Induces Antibody Responses Similar to Those of an Intramuscular Regimen. Journal of Virology. 93 (14), (2019).
  29. Rabbit Tracks: Breeding Techniques and Management. Michigan State University. , Available from: https://www.canr.msu.edu/resources/rabit tracks breeding techniques and management (2020).
  30. Patton, N. M. The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. Ch. 2 27-45 (1994).
  31. Nowland, M. H., Brammer, D. W., Garcia, A., Rush, H. G. Laboratory Animal Medicine. Fox, J. G., et al. , Academic Press. Ch. 10 411-461 (2015).
  32. Attia, Y. A., Al-Hanoun, A., El-Din, A. E., Bovera, F., Shewika, Y. E. Effect of bee pollen levels on productive, reproductive and blood traits of NZW rabbits. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 95 (3), 294-303 (2011).
  33. Feussner, E. L., Lightkep, G. E., Hennesy, R. A., Hoberman, A. M., Christian, M. S. A decade of rabbit fertility data: study of historical control animals. Teratology. 46 (4), 349-365 (1992).
  34. Manal, A. F., Tony, M. A., Ezzo, O. H. Feed restriction of pregnant nulliparous rabbit does: consequences on reproductive performance and maternal behaviour. Animal Reproduction Science. 120 (1-4), 179-186 (2010).
  35. Marai, I. F., Ayyat, M. S., Abd el-Monem, U. M. Growth performance and reproductive traits at first parity of New Zealand white female rabbits as affected by heat stress and its alleviation under Egyptian conditions. Tropical Animal Health and Production. 33 (6), 451-462 (2001).
  36. Rodríguez, M., et al. A diet supplemented with n-3 polyunsaturated fatty acids influences the metabomscic and endocrine response of rabbit does and their offspring. Journal of Animal Science. 95 (6), 2690-2700 (2017).
  37. Salem, A. A., El-Shahawy, N. A., Shabaan, H. M., Kobeisy, M. Effect of punicalagin and human chorionic gonadotropin on body weight and reproductive traits in maiden rabbit does. Veterinary and Animal Science. 10, 100140 (2020).
  38. Sirotkin, A. V., Parkanyi, V., Pivko, J. High temperature impairs rabbit viability, feed consumption, growth and fecundity: examination of endocrine mechanisms. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106478 (2020).
  39. Sun, L., et al. Effect of light intensity on ovarian gene expression, reproductive performance and body weight of rabbit does. Animal Reproduction Science. 183, 118-125 (2017).
  40. El-Gayar, M., et al. Pregnancy detectuib ub rabbits by ultrasonography as compared to manual palpation. Egyptian Journal of Animal Production. 51 (3), 196-199 (2014).
  41. Nason, K. S., Binder, N. D., Labarta, J. I., Rosenfeld, R. G., Gargosky, S. E. IGF-II and IGF-binding proteins increase dramatically during rabbit pregnancy. The Journal of Endocrinology. 148 (1), 121-130 (1996).
  42. Haneda, R., et al. Changes in blood parameters in pregnant Japanese White rabbits. The Journal Toxicological Sciences. 35 (5), 773-778 (2010).
  43. Mizoguchi, Y., et al. Changes in blood parameters in New Zealand White rabbits during pregnancy. Laboratory Animals. 44 (1), 33-39 (2010).
  44. Salem, A. A., Gomaa, Y. A. Effect of combination vitamin E and single long-acting progesterone dose on enhancing pregnancy outcomes in the first two parities of young rabbit does. Animal Reproduction Science. 150 (1-2), 35-43 (2014).
  45. Maertens, L., Lebas, F., Szendro, Z. Rabbit milk: A review of quantity, quality and non-dietary affecting factors. World Rabbit Science. 14 (4), 205-230 (2006).
  46. Pekow, C. A. The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press. 243-258 (2012).
  47. Jenness, R. Lactational Performance of Various Mammalian-Species. Journal of Dairy Science. 69 (3), 869-885 (1986).
  48. Yoshiyama, Y., Brown, W. R. Specific antibodies to cholera toxin in rabbit milk are protective against Vibrio cholerae-induced intestinal secretion. Immunology. 61 (4), 543-547 (1987).
  49. Gwinn, W. M., et al. Effective induction of protective systemic immunity with nasally administered vaccines adjuvanted with IL-1. Vaccine. 28 (42), 6901-6914 (2010).
  50. Sloat, B. R., Cui, Z. Evaluation of the immune response induced by a nasal anthrax vaccine based on the protective antigen protein in anaesthetized and non-anaesthetized mice. Journal of Pharmcy and Pharmacology. 58 (4), 439-447 (2006).
  51. Janakova, L., et al. Influence of intravenous anesthesia on mucosal and systemic antibody responses to nasal vaccines. Infection and Immunity. 70 (10), 5479-5484 (2002).
  52. Fuentes, J. M., et al. General anesthesia delays the inflammatory response and increases survival for mice with endotoxic shock. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (2), 281-288 (2006).
  53. Lee, Y. -M., Song, B. C., Yeum, K. -J. Impact of Volatile Anesthetics on Oxidative Stress and Inflammation. BioMed Research International. 2015, 242709 (2015).

Tags

Inmunología e Infección Número 173 Inmunización materna Inmunización intranasal Inmunización mucosa Recolección de leche Leche de conejo Oryctolagus cuniculus.
Inmunización intranasal y recolección de leche en estudios de inmunización materna en conejos blancos de Nueva Zelanda (<em>Oryctolagus cuniculus</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing,… More

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter