Summary
Dit artikel beschrijft en demonstreert de toediening van intranasale vaccins en de verzameling van melk van zogende konijnen (Oryctolagus cuniculus) als een middel om mucosale immuniteit te beoordelen in een translationeel geschikt model van maternale immunisatie.
Abstract
Vanwege overeenkomsten in placentatie en antilichaamoverdracht met mensen, zijn konijnen een uitstekend model van maternale immunisatie. Extra voordelen van dit onderzoeksmodel zijn het gemak van fokken en monsterverzameling, relatief korte draagtijd en grote nestgroottes. Algemeen beoordeelde immunisatieroutes omvatten subcutane, intramusculaire, intranasale en intradermale. Niet-terminale monsterverzameling voor de chronologische detectie van de immunologische reacties op deze immunisaties omvat de verzameling van bloed, van zowel dammen als kits, en melk uit de lactatie wel. In dit artikel zullen we technieken demonstreren die ons lab heeft gebruikt in studies naar maternale immunisatie bij Nieuw-Zeelandse witte konijnen(Oryctolagus cuniculus),waaronder intranasale immunisatie en melkverzameling.
Introduction
Studies naar maternale immunisatie en antilichaamoverdracht zijn om tal van redenen van onschatbare waarde, omdat dit de eerste route van immuniteitsoverdracht en daaropvolgende bescherming tegen pathogenen en ziekten bij pasgeborenen en zuigelingen is. Maternale immunisatie kan zowel de gezondheid van moeder als kind/kind op mondiaal niveau positief beïnvloeden door de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met bepaalde pathogenen tijdens deze kwetsbare periode te verminderen1. Het belangrijkste doel van deze strategie is om de niveaus van specifieke maternale antilichamen tijdens de zwangerschap te verhogen. Deze antilichamen kunnen vervolgens worden overgedragen op de pasgeborene en de zuigeling op een niveau dat voldoende is om te beschermen tegen infecties totdat hun immuunsysteem volwassen genoeg is om adequaat te reageren op uitdagingen1,2,3. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat titers met een hoger antilichaam bij de geboorte geassocieerd zijn met volledige bescherming of een vertraagd begin en verminderde ernst van tal van verschillende infectieziekten bij de pasgeborene, waaronder tetanus, kinkhoest, respiratoir syncytieel virus (RSV), influenza en streptokokkeninfecties van groep B1,2,3.
Bij mensen worden maternale antilichamen passief over de placenta overgebracht en ook via de moedermelk via borstvoeding overgedragen. Eerder werk heeft aangetoond dat hiv-specifieke IgA-niveaus in de moedermelk van moeders die besmet waren met het virus geassocieerd waren met een verminderde postnatale overdracht van het virus, wat wijst op een beschermende rol voor moedermelk anti-HIV IgA4. Studies bij niet-menselijke primaten hebben aangetoond dat immunisatie tegen HIV een significante antilichaamrespons in de moedermelk kan veroorzaken, en hoewel vergelijkbare serum-IgG-reacties werden geïnduceerd na systemische versus mucosale immunisatie, veroorzaakte mucosale immunisatie een significant hogere IgA-respons in de melk5,6.
Bij het vaststellen van een translationeel geschikt diermodel voor deze studies moet rekening worden gehouden met het placentatietype en de mechanismen voor passieve overdracht van antilichamen, alsmede met de overdracht van antilichamen via moedermelk. Er zijn drie hoofdtypen placentatie bij zoogdieren op basis van de weefseltypen en lagen op de materno-foetale interface, waaronder hemochoriale (primaten, knaagdieren en konijnen), endotheliochorial (carnivoren) en epitheliochorial (paarden, varkens en herkauwers). De hemochoriale placenta is het meest invasieve type, waardoor directe communicatie mogelijk is tussen de bloedtoevoer van de moeder en het koraal, of het buitenste foetale membraan. Op basis van het aantal trofoblastlagen zijn er verschillende variaties van hemochoriale placentatie, waaronder de hemomonochoriale placenta gevonden bij primaten, de hemodichoriale placenta bij konijnen en de hemotrichoriale placenta waargenomen bij ratten en muizen7. Dit directe contact tussen de bloedtoevoer van de moeder en het koraal zorgt voor de passieve overdracht van antilichamen over de placenta tijdens de zwangerschap. IgG is de enige antilichaamklasse die de menselijke placenta significant passeert8, terwijl IgA de overheersende klasse van Ig is die in menselijke moedermelk wordt aangetroffen9. Van de wetenschappelijk relevante modellen brengen alleen primaten (inclusief mensen), konijnen en cavia's IgG over in utero en IgA in de melk10,11. Daarom bevat het konijnenmodel factoren die vergelijkbaar zijn met die bij mensen die de transplacentale overdracht van IgG en lactaatoverdracht van IgA controleren.
Naast het dienen als een uitzonderlijk model voor maternale immuniteit en vaccinontwikkeling, maken overeenkomsten tussen het konijn en menselijke neusholtes ze een geschikt model voor intranasale immunisatie. Het volume van de neusholte van het konijn lijkt meer op mensen dan knaagdiermodellen op basis van relatieve lichaamsmassa12. Bovendien toonden Casteleyn et al. 12 aan dat het nasale geassocieerde lymfoïde weefsel (NALT) volumineuzer is bij het konijn in vergelijking met knaagdieren. De NALT bevindt zich voornamelijk op het ventrale en ventrolytische aspect van de ventrale neusvlees en op het laterale en dorsolaterale aspect van de nasofaryngeale meatus bij konijnen, terwijl bij knaagdieren het lymfoïde weefsel alleen aanwezig is langs het ventrale aspect van de nasofaryngeale meatus12. Bij konijnen zijn de structuur en locatie van de intra-epitheliale en lamina propria-lymfocyten, evenals de geïsoleerde lymfoïde follikels, vergelijkbaar met die van mensen12.
Extra voordelen van het gebruik van het konijn als model voor maternale en mucosale immuniteit zijn hun hoge vruchtbaarheid en relatief korte draagtijd. Grote auricular bloedvaten zorgen voor relatief gemakkelijke toegang tot grote hoeveelheden bloed voor seriële collecties. Een verscheidenheid van mucosal steekproeven kan voor antigeen-specifieke antilichaamreactietesten worden verzameld, met inbegrip van moedermelk13 (wanneer het lacteren), mucosal afscheidingen of wasbeurten (b.v.,mondelinge14,15,16,bronchoalveolaire lavage13,17,18,19,vaginale20, 21,22),en uitwerpselen20,23,23. Melkmonsters kunnen gemakkelijk worden verzameld tijdens de lactatie om de aanwezigheid van antigeenspecifieke antilichaamresponsen te beoordelen. Hoewel niet zo overvloedig als voor mensen en muizen, is een breed scala aan experimentele reagentia beschikbaar voor konijnenspecifieke studies en assays. In dit artikel zullen we intranasale immunisatie en melkverzameling beschrijven en demonstreren bij Nieuw-Zeelandse witte konijnen(Oryctolagus cuniculus).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met het IACUC-beleid van duke university.
OPMERKING: De benodigde materialen zijn opgenomen in de tabel met materialen.
1. Konijnensedatie en anesthesie
- Verdoven van het vrouwelijke konijn (geslachtsrijp; ongeveer 5-30 maanden oud) door acepromazine intramusculair (IM) toe te dienen in een dosis van 1 mg/kg. Afhankelijk van de grootte van het dier, gebruik een spuit van 1 of 3 ml met een naald van 25 G. Epaxiale spieren zijn de voorkeursplaats van de intramusculaire injectie.
OPMERKING: Acepromazine kan ook subcutaan worden toegediend, maar IM heeft de voorkeur van het laboratorium, omdat het sneller werkt en de incidentie van huidlaesies vermindert. - Wacht 10-15 minuten om het acepromazine te laten werken.
- Verdoof het konijn met isofluraan door de verbonden neuskegel over de neus van het dier te plaatsen. Stel de vaporizer in op maximaal 4% isofluraan in combinatie met maximaal 4 liter/minuut zuurstof. Konijnen hebben een hoge afkeer van isofluraan, dus voldoende terughoudendheid is nodig bij het maskeren van het dier.
- Eenmaal volledig verdoofd, zoals beoordeeld door de pinna, pedaal en / of palpebrale reflex, breng oftalmisch smeermiddel aan op elk oog om uitdroging van de ogen en daaropvolgende hoornvlieszweren te voorkomen.
- Controleer voortdurend reflexen en ademhaling tijdens anesthesie en verminder de isofluraansnelheid tot 1-2% zodra een adequaat anesthesievlak is bereikt.
2. Intranasale immunisatie
- Bereid immunisatieoplossing voor voorafgaand aan de behandeling van dieren.
- Verdoven het konijn zoals hierboven beschreven.
- Zodra het laboratoriumlid klaar is om het vaccin toe te dienen en het konijn zich in een adequaat anesthesievlak bevindt, schakelt u de isofluraan en zuurstof uit en verwijdert u de neuskegel.
- Plaats het konijn in dorsale ligfiets en prop de nek en het hoofd onder een hoek van ongeveer 45° die gemakkelijke toegang en visualisatie van beide nares mogelijk maakt door het laboratoriumlid dat het vaccin toedient.
- Laad de pipet met niet meer dan 100 μL van de vaccinoplossing en dien de oplossing snel toe in elk neusgat. De pipet moet onder een hoek van ongeveer 45° worden gehouden, schuin naar het mediale aspect van de neuspassage.
OPMERKING: Het doel van immunisatie is dat de oplossing in contact komt met het slijmvlies van de nares, dus de punt mag niet in de nares worden geplaatst, omdat dit kan leiden tot slijtage of irritatie van de slijmvliezen en mogelijk de immunogeniciteit van het nasaal toegediende vaccin kan beïnvloeden. Het vaccin moet snel worden toegediend en op dezelfde manier in de andere nare worden toegediend. - Na toediening in beide neuspassages, houd het konijn gedurende 30 seconden in dorsale liggedrag om lekkage van de vaccinoplossing te minimaliseren.
OPMERKING: Het laboratorium zal meestal niet meer dan 100 μL per neusgat per keer toedienen. Als een groter volume moet worden toegediend, met een maximumtotaal van 500 μL, kan het vaccin worden toegediend in 100 μL aliquots met een rustperiode van 30 seconden tussen immunisaties en herhaalde aanvullende toedieningen van vaccins, met 30 seconden rust tussen elke toediening, totdat het totale vaccinvolume is geleverd. - Plaats het konijn na immunisatie op het ventrum voor herstel en houd het dier nauwlettend in de gaten totdat het sternale ligfiets kan behouden.
3. Melkinzameling
- Verdoven het zogende konijn zoals hierboven beschreven.
- Reinig de huid over de randoorader met het alcoholdoekje/doekje.
- Met behulp van een spuit van 1 ml en een naald van 25 g dient u ongeveer 1-2 IE oxytocine intraveneus via de marginale oorader toe te dienen om melkuitstorting te veroorzaken.
OPMERKING: Vanwege de soepele spierontspanning is het gebruikelijk dat het konijn plast of poept na toediening van oxytocine. - Oefen na toediening van oxytocine druk uit op de injectieplaats met het stuk gaas.
- Terwijl u het anesthesiemasker over de neus van het konijn houdt, propt u het konijn op zijn achterhand.
OPMERKING: Melkverzameling kan ook worden uitgevoerd met het dier in laterale ligligheid, maar het lab vindt dat het verzamelen gemakkelijker is wanneer het konijn op zijn romp wordt gepropt met een assistent die het konijn rechtop houdt met het anesthesiemasker. - Open de steriele buis om zich voor te bereiden op het verzamelen van melk en zoek het borstweefsel en de bijbehorende spenen. De spenen zijn meestal omgeven door natte vacht van recente verpleging en het borstweefsel is gemakkelijk voelbaar als het vol melk zit.
- Pak het borstweefsel dat geassocieerd is met een speen tussen duim en wijsvinger vast en oefen een zachte, masserende druk uit op het klierweefsel in de richting van de speen. Plaats de opvangbuis over de speen om de uitgedrukte melk op te halen.
OPMERKING: Het kan soms enkele minuten duren voordat de oxytocine effectief is en de melkproductie lijkt te variëren tussen de borstklieren. Als de melkexpressie niet succesvol is, wacht dan enkele minuten of draai rond naar de extra borstklieren. Melk van alle spenen kan in dezelfde flacon worden verzameld. Meestal kunnen enkele milliliter melk gemakkelijk worden verzameld bij een zogende doe. - Na het verzamelen van de melk, zet de isofluraan en zuurstof uit en laat het konijn herstellen terwijl het nauwlettend wordt gevolgd totdat het dier in staat is om sternale ligfiets te behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van een typisch ontwerp van een intranasale immunisatiestudie bij de moeder is weergegeven in figuur 1, waarin de immunisaties, fokken, aanmaak, lactatie en antilichaamoverdracht zijn opgenomen. Hoewel niet geïllustreerd, moet bloed worden verzameld voorafgaand aan de initiële immunisatie voor nulmetingen en gedurende de rest van het onderzoek met regelmatige tussenpozen. Bloed is gemakkelijk te verkrijgen via de centrale oorslagader met milde sedatie en een topisch pijnstillend middel (bijv. lidocaïne 2,5% en prilocaïne 2,5% crème). De aanwezigheid van antigeenspecifieke IgG-niveaus kan in deze monsters worden gemeten. Vrouwelijke konijnen worden geïmmuniseerd via de intranasale route, zoals beschreven in het protocol en gedemonstreerd in de video. Afhankelijk van het onderzoek kan het vaccin een boost nodig hebben of via een extra route (bijv. intramusculair of subcutaan) moeten worden toegediend. Na de studie-initiatie worden konijnen gefokt; we geven er de voorkeur aan om bewezen fokkers van verkopers te kopen om te gebruiken om een hoger zwangerschapspercentage voor deze studies te garanderen. Afhankelijk van de immunisatietijdlijn kunnen konijnen tijdens de zwangerschap extra immunisaties krijgen. Antigeen-specifieke IgG wordt transplacentally overgebracht naar de kits, en na ongeveer 30-32 dagen na de fokkerij zal zwanger zijn. We raden aan om het gebruik van kits de eerste dagen te beperken om afwijzing van de does te minimaliseren. Bloedmonsters kunnen uit de kits worden verzameld om antigeenspecifieke IgG-niveaus te beoordelen die transplacentaal zijn overgedragen (figuur 3). Naast een breed scala aan voedingsstoffen, krijgen kits IgA van de zogende doe tijdens het verplegen. Kits worden meestal gespeend na 4-8 weken, maar voorafgaand aan het spenen kan melk gemakkelijk worden verzameld uit lactaat, zoals aangetoond in de video. De verzamelde melkmonsters kunnen vervolgens worden verwerkt voor de detectie van totale en antigeenspecifieke IgA-niveaus (figuur 4). Afhankelijk van het onderzoek kunnen vaccins (+/- boosts) aan de kits worden toegediend en kunnen seriële bloedmonsters op zeer jonge leeftijd uit de kits worden verzameld met behulp van de laterale sapheneuze ader.
Voor maternale studies is het zo vroeg mogelijk bepalen van de zwangerschap nuttig voor het studieontwerp en om ervoor te zorgen dat de doe niet opnieuw hoeft te worden geteelt. Progesteronmetingen kunnen worden gebruikt als een middel om zwangerschap te detecteren. Zoals getoond in figuur 2, kunnen verhoogde progesteronspiegels worden gedetecteerd bij zwangere konijnen in vergelijking met niet-zwangere konijnen, zelfs nadat paringen met een bok voor iedereen werden bevestigd. Er zijn extra methoden voor zwangerschapsdetectie, waaronder handmatige palpatie, echografie en röntgenfoto's; deze vereisen echter goed opgeleide persoonlijke en juiste apparatuur.
Antigeen-specifieke IgG die transplacentally werd overgebracht terwijl in utero kan worden gemeten in het serum van kits. Bloed kan worden verzameld uit een klein aantal kits op of in de buurt van het moment van geboorte om vroege antigeenspecifieke antilichaamniveaus te beoordelen, maar seriële bloedafname is technisch veel gemakkelijker naarmate de kits ouder worden en groter worden. Zoals afgebeeld in figuur 3, kunnen serumspiegels van antigeenspecifieke IgG in de kits worden gemeten aan de hand van ELISA en vergeleken met de maternale niveaus. Maternale overgedragen IgG-niveaus zijn meestal hoger bij de geboorte en nemen in de loop van de tijd af.
Als een type mucosaal monster kan melk worden verzameld en verwerkt om totale of antigeenspecifieke antilichaamniveaus te meten. Zoals weergegeven in figuur 4,vormt IgA een aanzienlijk deel van de totale antilichaamniveaus in de moedermelk die via borstvoeding naar de kits worden overgebracht. Onze resultaten tonen aan dat moedermelk IgA een iets hoger ELISA-signaal produceert (relatieve lichteenheden, RLU) in vergelijking met IgG, en zowel IgA als IgG produceren een signaal dat veel hoger is dan het signaal voor IgM. Deze resultaten zijn in overeenstemming met resultaten van anderen die suggereren dat konijnenmelk ongeveer 4,5 mg/ml IgA, 2,4 mg/ml IgG en 0,1 mg/ml IgM26,27bevat .
Figuur 1. Voorbeeldtijdlijn voor een maternale intranasale immunisatiestudie in een konijn (Oryctolagus cuniculus) model. Vrouwelijke konijnen worden geïmmuniseerd via de intranasale route, zoals beschreven in het protocol en gedemonstreerd in de video. Afhankelijk van het onderzoek kan het vaccin een boost nodig hebben of via een extra route (bijv. intramusculair of subcutaan) moeten worden toegediend. Konijnen worden dan gefokt. Antigeen-specifieke IgG wordt transplacentally overgebracht naar de kits, en na ongeveer 30-32 dagen na de fokkerij zal zwanger zijn. IgA wordt doorgegeven aan de kits van de zogende doe tijdens het verplegen. Voorafgaand aan het spenen kan melk gemakkelijk worden verzameld uit de lacterende doet om de totale en antigeen-specifieke IgA-niveaus te beoordelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Progesteronspiegels bij zwangere en niet-zwangere konijnen na 3 weken na het fokken. Bloed werd verzameld van konijnen op 3 weken na de fokkerij. Konijnen werden bevestigd of zwanger of niet-zwanger op basis van het vermogen om een nest aan te maken op 30-32 dagen na de fokkerij. Serum progesteron niveaus werden gemeten via de Michigan State University Veterinary Diagnostic Laboratory met behulp van een chemiluminescente immunoassay (CLIA) met een immunoassay systeem (bijv. Siemens Healthineers IMMULITE 2000). Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten van het gemiddelde en de steekproefgrootte bestond uit 4-6 konijnen per groep. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Antigeenspecifieke IgG-niveaus in kits (ten opzichte van maternale niveaus) bij de geboorte en op de leeftijd van 3 weken na een reeks maternale immunisaties. Bloed werd verzameld uit de does en kits kort na het aanmaaken en op de leeftijd van 3 weken. Antigeenspecifieke IgG-spiegels in het serum werden gedetecteerd met behulp van een fluorescerende ELISA zoals eerder beschreven28. Antigeen-specifieke IgG wordt uitgezet als een verhouding van de niveaus gedetecteerd in de kit serum en maternale serum. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Een vergelijking van IgA-, IgM- en IgG-niveaus in konijnenmelk. Konijnenmelk werd verzameld zoals beschreven en gedemonstreerd in de video. Melk werd verwerkt door een lange centrifuge (13.000 x g gedurende 4,5 uur bij 4 °C) en de heldere middelste laag werd na verwerking geïsoleerd. De totale IgA-, IgG- en IgM-spiegels werden in deze heldere laag gemeten door fluorescerende ELISA zoals eerder beschreven28, behalve dat platen waren bedekt met polyklonale anti-IgA, anti-IgG of anti-IgM om respectievelijk totaal konijn IgA, IgG of IgM te detecteren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel niet beschreven in het bovenstaande protocol, is een succesvolle fokkerij van de konijnen noodzakelijk voor dit moedermodel en om melkverzameling mogelijk te maken. Konijnen worden gemakkelijk gefokt door live dekking in een onderzoeksomgeving. Het wordt aanbevolen om deze over te brengen naar de kooi van de bok voor de fokkerij, net als territoriaal en agressief kan zijn als ze in hun eigen kooi met de bok worden gehouden. Als vrouwtjes na 15 minuten niet ontvankelijk zijn (zoals aangegeven door weg te lopen bijten of te vocaliseren), moet de doe terug in haar eigen kooi worden geplaatst. Er zijn verschillende informatieve video's en tutorials over het fokken van konijnen die online kunnen worden waargenomen29,maar na het fokken zal het mannetje meestal omvallen en kan vocaliseren. Zodra dit is waargenomen, kan de doe worden teruggebracht naar haar kooi. Een bok kan 2-3 keer per dag broeden zonder afname van het aantal zaadcellen30. In ons IACUC-goedgekeurde protocol zijn bokken beperkt tot het fokken van 10-12 does per week en worden ze ten minste twee rustdagen per week verstrekt, omdat bronnen stellen dat een enkele bok meestal voldoende is om 10-15 does31te onderhouden. Onze groep stelt voor om bewezen fokkers van de leverancier te kopen om het foksucces te verbeteren. Aangezien de konijnen ovulatoren worden geïnduceerd en ovulatie typisch 10-13 uren na copulatie31voorkomt, hebben wij een hogere snelheid van zwangerschap ervaren in does die in de ochtend en dan opnieuw in de middag, of tweemaal binnen dat 10-13 uurvenster worden gefokt (waargenomen verhoging van 75% tot 95% succestarief, ongepubliceerd). Op basis van de literatuur variëren de typische foksuccespercentages van 57-100%32,33,34,35,36,37,38,39,40en nestgroottes gemiddeld ongeveer 7-9 kits31.
Het zo vroeg mogelijk bepalen van de zwangerschap is nuttig in maternale studies om te bevestigen dat de doe niet opnieuw hoeft te worden gebloed of uit het onderzoek hoeft te worden verwijderd. Opties voor zwangerschapsdetectie zijn palpatie (al na 14 dagen)31, echografie (al vanaf 5-9 dagen)40, röntgenfoto's (al op dag 11)31, gewichtstoename en moleculaire technieken, zoals metingen van insulinegroeifactoren41 (IGF) en progesteron34,37,38,42,43. Eerder werk heeft aangetoond dat de IGF-II-spiegels aanzienlijk zijn verhoogd bij zwangere konijnen in vergelijking met de niveaus bij niet-zwangere konijnen41. In onze handen konden we echter geen verschil in IGF-II-niveaus detecteren tussen zwangere en niet-zwangere konijnen (niet gepubliceerd). Aangezien adequate progesteronspiegels noodzakelijk zijn voor het behoud van de zwangerschap bij konijnen37,44, hebben verschillende studies progesteronniveaus bij zwangere konijnen beoordeeld en verhoogde niveaus ten opzichte van niet-zwangere konijnen aangetoond , met name tijdens organogenese rond mid-zwangerschap34,43,44. Onze groep was niet in staat om verschillen in progesteronniveaus te detecteren met behulp van een ELISA tussen zwangere en niet-zwangere konijnen, maar voorlopige resultaten met behulp van een geautomatiseerde chemiluminescentietest in het Michigan State University Veterinary Diagnostic Laboratory wijzen op verhoogde progesteronniveaus bij zwangere konijnen in vergelijking met niet-zwangere konijnen, zelfs na paringen met een bok werden bevestigd voor alles wat beoordeeld werd (Figuur 2).
Lacteren kan ongeveer 250 ml, of 60 ml/kg melk per dagproduceren 45,46, waardoor grote hoeveelheden voor experimentele testen de totale en antigeenspecifieke antilichaamresponsen / concentraties kunnen worden beoordeeld. Konijnenmelk bevat een hoog vet- en eiwitgehalte, dat 2 en 3 keer meer geconcentreerde niveaus van vet en eiwit bevat, in vergelijking met koe- en zeugenmelk, respectievelijk45,47. Vanwege het hoge vetgehalte in de melk vereisen de monsters een aanzienlijke verwerking, afhankelijk van de uit te voeren test. Na centrifugeren van het melkmonster worden drie verschillende lagen gescheiden, waaronder de cellen in de onderste laag, een heldere tussenlaag met de immunoglobulinen en vet in de bovenste laag48. Immunoglobulinen, binnen de heldere tussenlaag, zijn aanwezig in hoge concentraties in het colostrum en de melk en bestaan voornamelijk uit IgA, IgG en IgM (figuur 4). Hoewel melkmonsters gemakkelijk met de hand kunnen worden verzameld, en dit is onze voorkeurstechniek in het lab, zijn vacuümsystemen ook gerapporteerd in de literatuur13,46,48. Yoshiyama et al.48 verzamelden melkmonsters onder negatieve druk en beschreven een lange centrifugeertijd (15.000 x g gedurende 4 uur) voor het scheiden van de melklagen voordat de heldere tussenlaag door een Sepharose 4B-kolom werd gepasseerd voor immunoglobulineverwijdering. Met behulp van deze methode konden auteurs choleratoxinespecifieke antilichamen in de konijnenmelk van oraal geïmmuniseerde konijnen detecteren op voldoende niveaus voor bescherming tegen vibrio-cholerae-geïnduceerde secretie in de darm48. Peri et al.13 verwerkte melkmonsters verzameld door aspiratie met een watervacuümsysteem door centrifugeren bij 4 °C gedurende 2 uur bij 24.000 x g. In deze studie konden auteurs anti-RSV IgA detecteren in de biest-, melk- en bronchiale en intestinale secreties na mucosale immunisatie (oraal of intratracheaal), maar niet intraveneuze immunisatie, terwijl anti-RSV IgG werd gedetecteerd in colostrum, melk en serum, ongeacht immunisatieroute13.
Wees voorzichtig tijdens de intranasale immunisatieprocedure om te bevestigen dat het konijn zich in een adequaat anesthesievlak bevindt en om te voorkomen dat grote hoeveelheden vaccin in één keer worden toegediend. Eerder werk van onze groep heeft aangetoond dat de werkzaamheid van de intranasale immunisatie werd beïnvloed door het gebruik van anesthesie49. In het bijzonder correleerde diepe anesthesie veroorzaakt door de combinatie van ketamine en xylazine met verhoogde immunogeniciteit van het nasaal toegediende vaccin en verbeterde nasale retentie van de oplossing. Deze niveaus waren significant hoger dan retentie en immunogeniciteit bij konijnen intranasaal geïmmuniseerd na sedatie met acepromazine en butorphanol49. Soortgelijke bevindingen zijn ook aangetoond na intranasale immunisatie bij muizen50,51. Bovendien toonde ons werk verhoogde immunogeniciteit aan na intranasale immunisatie onder de diepe anesthesie bij dieren die volledig wakker waren en bij dieren die een kortere duur anesthesie ondergingen met een combinatie van acepromazine en isofluraan. Dit verschil in IgG-immunogeniciteit tussen diepe versus kortere duur anesthesie was significant op het 42-dagen-tijdspunt, maar niet op het 56-daagse tijdstip. Hoewel verhoogde immunogeniciteit en retentie het gevolg kunnen zijn van de diepere anesthesie, hadden konijnen ten minste 30 minuten nodig om te herstellen; terwijl konijnen rechtop en mobiel waren binnen 5 minuten na ontvangst van het neusvaccin na de kortere duur isofluraan-geïnduceerde anesthesie. Hoewel anesthesie misschien niet ideaal is voor het nabootsen van de klinische setting voor intranasale immunisatie bij mensen, kan een anesthesie van kortere duur (bijv. isofluraan) de voorkeur hebben boven een langere, diepe anesthesie met injecteerbare middelen (bijv. ketamine + xylazine). Het gebruik van een diermodel, zoals aangetoond in Gwinn et al.49,vereist vaak het gebruik van sedatie of anesthesie om een veilige behandeling van dieren en effectieve en consistente vaccinafgifte mogelijk te maken. Een mogelijke beperking voor anesthesiegebruik met toediening van vaccins in diermodellen is het effect ervan op het vermogen van het dier om een geschikte immuunrespons op het vaccin te induceren. Interessant is dat rapporten in de literatuur suggereren dat isofluraan systemische ontstekingsreacties kan verzachten, bescherming biedt tegen uitdagingen52 en oxidatieve stress en ontsteking vermindert53.
Met betrekking tot het minimaliseren van vaccinverlies en adequate intranasale toediening, beveelt onze groep een rustperiode van 30 seconden na toediening van elke aliquot van het intranasale vaccin aan om het behoud van de oplossing in de neusholte mogelijk te maken en om te voorkomen dat de oplossing uit de neusgaten sijpelt als het konijn onmiddellijk in sternale ligfiets wordt geplaatst en naar de kooi wordt teruggebracht. Bovendien is het belangrijk om het volume van de toegediende aliquot te beperken om intranasale immunisatie te garanderen, omdat de slijmvliesabsorptie wordt beperkt door het oppervlak van de neuspassage. Als een groot volume wordt toegediend, kan de oplossing het neusslijmvlies omzeilen en resulteren in inhalatie of maagimmunisatie. Onze groep beveelt aliquots van 100 μL per neusgat aan met een maximaal intranasaal volume van 500 μL.
Dit artikel richt zich op de levering van mucosale vaccins, met name via de intranasale route, maar er zijn meerdere methoden van immunisatie, zowel mucosale als parenterale methoden die zijn aangetoond bij konijnen. Deze aanvullende methoden omvatten, maar zijn niet beperkt tot, oraal, subcutaan, intramusculair en intradermaal. Als zodanig variëren de te verzamelen en te beoordelen monsters op basis van de experimentele doelen en de route van immunisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs willen de afdeling Laboratory Animal Resources van Duke University en hun veeteeltteam erkennen voor hun hulp en grote zorg voor de dieren. Daarnaast willen de auteurs het PhotoPath-team binnen de afdeling Pathologie herkennen voor hun hulp bij de audio- en videogedeelten van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door discretionaire onderzoeksfondsen van het Staatslaboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intranasal Immunization | |||
| Anesthesia Machine/Vaporizer | Vet Equip | 901807 | |
| Hypodermic Needle (25 g) | Terumo | 07-806-7584 | |
| Isoflurane (250 mL Bottle) | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | 2-4% |
| Luer Lock Syringe (1 mL) | Air-Tite | 07-892-7410 | |
| Mucosal Vaccine | N/A | N/A | Experimental Vaccine |
| Nose Cone | McCulloch Medical | 07891-1097 | |
| Pipette Tips | VWR | 53503-290 | |
| Pipettor | VWR | 89079-962 | |
| PromAce (Acepromazine maleate) | Boehringer Ingelheim | 07-893-5734 | 1mg/kg IM |
| Puralube Sterile Ophthalmic Ointment | Dechra | 07-888-2572 | |
| Milk Collection | |||
| Alcohol Prep 2-ply | Covidien | 07-839-8871 | |
| Anesthesia Machine/Vaporizer | Vet Equip | 901807 | |
| Hypodermic Needles (25 g) | Terumo | 07-806-7584 | |
| Isoflurane (250 mL Bottle) | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | 2-4% |
| Luer Lock Syringe (1 mL) | Air-Tite | 07-892-7410 | |
| Non-Woven Sponge (4x4) | Covidien | 07-891-5815 | |
| Nose Cone | McCulloch Medical | 07891-1097 | |
| PromAce (Acepromazine Maleate) | Boehringer Ingelheim | 07-893-5734 | 1mg/kg IM |
| Puralube Sterile Ophthalmic Ointment | Dechra | 07-888-2572 | |
| Sterile Conical Vial (15 mL) | Falcon | 14-959-49B |
References
- Munoz, F. M. Current Challenges and Achievements in Maternal Immunization Research. Frontiers in Immunology. 9, 436 (2018).
- Kachikis, A., Englund, J. A. Maternal immunization: Optimizing protection for the mother and infant. The Journal of Infection. 72, Suppl 83-90 (2016).
- Omer, S. B.
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. , 01560 (2015).
- Fouda, G. G. A., et al. Mucosal Immunization of Lactating Female Rhesus Monkeys with a Transmitted/Founder HIV-1 Envelope Induces Strong Env-Specific IgA Antibody Responses in Breast Milk. Journal of Virology. 87 (12), 6986-6999 (2013).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces Robust IgA-Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Furukawa, S., Kuroda, Y., Sugiyama, A. A comparison of the histological structure of the placenta in experimental animals. Journal of Toxicologic Pathology. 27 (1), 11-18 (2014).
- Palmeira, P., Quinello, C., Silveira-Lessa, A. L., Zago, C. A., Carneiro-Sampaio, M. IgG placental transfer in healthy and pathological pregnancies. Clinical & Developmental Immunology. 2012, 985646 (2012).
- Macchiaverni, P., et al. Mother to child transfer of IgG and IgA antibodies against Dermatophagoides pteronyssinus. Scandinavian Journal of Immunology. 74 (6), 619-627 (2011).
- Pentsuk, N., vander Laan, J. W. An interspecies comparison of placental antibody transfer: new insights into developmental toxicity testing of monoclonal antibodies. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 86 (4), 328-344 (2009).
- Butler, J. E., Rainard, P., Lippolis, J., Salmon, H., Kacskovics, I., et al. Mucosal Immunology. Mestecky, J., et al. , Academic Press. Ch. 116 2269-2306 (2015).
- Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Vanden Broeck, W. NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit. Veterinary Immunology Immunopathology. 133 (2-4), 212-218 (2010).
- Peri, B. A., et al. Antibody content of rabbit milk and serum following inhalation or ingestion of respiratory syncytial virus and bovine serum albumin. Clinical and Experimental Immunology. 48 (1), 91-101 (1982).
- Fukuizumi, T., Inoue, H., Tsujisawa, T., Uchiyama, C. Tonsillar application of killed Streptococcus mutans induces specific antibodies in rabbit saliva and blood plasma without inducing a cross-reacting antibody to human cardiac muscle. Infection and Immunity. 65 (11), 4558-4563 (1997).
- Saeed, M. I., Omar, A. R., Hussein, M. Z., Elkhidir, I. M., Sekawi, Z. Development of enhanced antibody response toward dual delivery of nano-adjuvant adsorbed human Enterovirus-71 vaccine encapsulated carrier. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (10), 2414-2424 (2015).
- Ma, Y., et al. Vaccine delivery to the oral cavity using coated microneedles induces systemic and mucosal immunity. Pharmaceutical Research. 31 (9), 2393-2403 (2014).
- Jarvinen, L. Z., Hogenesch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Induction of protective immunity in rabbits by coadministration of inactivated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Infection and Immunity. 66 (8), 3788-3795 (1998).
- Suckow, M. A., Bowersock, T. L., Nielsen, K., Grigdesby, C. F. Enhancement of respiratory immunity to Pasteurella multocida by cholera toxin in rabbits. Laboratory Animals. 30 (2), 120-126 (1996).
- Jarvinen, L. Z., HogenEsch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Intranasal vaccination of New Zealand white rabbits against pasteurellosis, using alginate-encapsulated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Comparative Medicine. 50 (3), 263-269 (2000).
- Winchell, J. M., Routray, S., Betts, P. W., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal and systemic antibody responses to a C4/V3 construct following DNA vaccination of rabbits via the Peyer's patch. The Journal of Infectious Diseases. 178 (3), 850-853 (1998).
- Wegmann, F., et al. A novel strategy for inducing enhanced mucosal HIV-1 antibody responses in an anti-inflammatory environment. PLoS One. 6 (1), 15861 (2011).
- Winchell, J. M., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal immune response to an HIV C4/V3 peptide following nasal or intestinal immunization of rabbits. AIDS Research and Human Retroviruses. 13 (10), 881-889 (1997).
- Knudsen, C., et al. Quantitative feed restriction rather than caloric restriction modulates the immune response of growing rabbits. The Journal of Nutrition. 145 (3), 483-489 (2015).
- Ciarlet, M., et al. Subunit rotavirus vaccine administered parenterally to rabbits induces active protective immunity. Journal of Virology. 72 (11), 9233-9246 (1998).
- Denchev, V., Mitov, I., Marinova, S., Linde, K. Local and systemic immune response in rabbits after intraintestinal immunization with a double-marker attenuated strain of Salmonella typhimurium. Journal of Hygiene, Epidemiology, Microbiology, and Immunology. 32 (4), 457-465 (1988).
- Watson, D. L. Immunological functions of the mammary gland and its secretion--comparative review. Australian Journal of Biological Sciences. 33 (4), 403-422 (1980).
- Lascelles, A. K., McDowell, G. H. Localized humoral immunity with particular reference to ruminants. Transplantation Reviews. 19, 170-208 (1974).
- Jones, D. I., et al. Optimized Mucosal Modified Vaccinia Virus Ankara Prime/Soluble gp120 Boost HIV Vaccination Regimen Induces Antibody Responses Similar to Those of an Intramuscular Regimen. Journal of Virology. 93 (14), (2019).
- Rabbit Tracks: Breeding Techniques and Management. Michigan State University. , Available from: https://www.canr.msu.edu/resources/rabit tracks breeding techniques and management (2020).
- Patton, N. M. The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. Ch. 2 27-45 (1994).
- Nowland, M. H., Brammer, D. W., Garcia, A., Rush, H. G. Laboratory Animal Medicine. Fox, J. G., et al. , Academic Press. Ch. 10 411-461 (2015).
- Attia, Y. A., Al-Hanoun, A., El-Din, A. E., Bovera, F., Shewika, Y. E. Effect of bee pollen levels on productive, reproductive and blood traits of NZW rabbits. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 95 (3), 294-303 (2011).
- Feussner, E. L., Lightkep, G. E., Hennesy, R. A., Hoberman, A. M., Christian, M. S. A decade of rabbit fertility data: study of historical control animals. Teratology. 46 (4), 349-365 (1992).
- Manal, A. F., Tony, M. A., Ezzo, O. H. Feed restriction of pregnant nulliparous rabbit does: consequences on reproductive performance and maternal behaviour. Animal Reproduction Science. 120 (1-4), 179-186 (2010).
- Marai, I. F., Ayyat, M. S., Abd el-Monem, U. M. Growth performance and reproductive traits at first parity of New Zealand white female rabbits as affected by heat stress and its alleviation under Egyptian conditions. Tropical Animal Health and Production. 33 (6), 451-462 (2001).
- Rodríguez, M., et al. A diet supplemented with n-3 polyunsaturated fatty acids influences the metabomscic and endocrine response of rabbit does and their offspring. Journal of Animal Science. 95 (6), 2690-2700 (2017).
- Salem, A. A., El-Shahawy, N. A., Shabaan, H. M., Kobeisy, M. Effect of punicalagin and human chorionic gonadotropin on body weight and reproductive traits in maiden rabbit does. Veterinary and Animal Science. 10, 100140 (2020).
- Sirotkin, A. V., Parkanyi, V., Pivko, J. High temperature impairs rabbit viability, feed consumption, growth and fecundity: examination of endocrine mechanisms. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106478 (2020).
- Sun, L., et al. Effect of light intensity on ovarian gene expression, reproductive performance and body weight of rabbit does. Animal Reproduction Science. 183, 118-125 (2017).
- El-Gayar, M., et al. Pregnancy detectuib ub rabbits by ultrasonography as compared to manual palpation. Egyptian Journal of Animal Production. 51 (3), 196-199 (2014).
- Nason, K. S., Binder, N. D., Labarta, J. I., Rosenfeld, R. G., Gargosky, S. E. IGF-II and IGF-binding proteins increase dramatically during rabbit pregnancy. The Journal of Endocrinology. 148 (1), 121-130 (1996).
- Haneda, R., et al. Changes in blood parameters in pregnant Japanese White rabbits. The Journal Toxicological Sciences. 35 (5), 773-778 (2010).
- Mizoguchi, Y., et al. Changes in blood parameters in New Zealand White rabbits during pregnancy. Laboratory Animals. 44 (1), 33-39 (2010).
- Salem, A. A., Gomaa, Y. A. Effect of combination vitamin E and single long-acting progesterone dose on enhancing pregnancy outcomes in the first two parities of young rabbit does. Animal Reproduction Science. 150 (1-2), 35-43 (2014).
- Maertens, L., Lebas, F., Szendro, Z. Rabbit milk: A review of quantity, quality and non-dietary affecting factors. World Rabbit Science. 14 (4), 205-230 (2006).
- Pekow, C. A. The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press. 243-258 (2012).
- Jenness, R.
- Yoshiyama, Y., Brown, W. R. Specific antibodies to cholera toxin in rabbit milk are protective against Vibrio cholerae-induced intestinal secretion. Immunology. 61 (4), 543-547 (1987).
- Gwinn, W. M., et al. Effective induction of protective systemic immunity with nasally administered vaccines adjuvanted with IL-1. Vaccine. 28 (42), 6901-6914 (2010).
- Sloat, B. R., Cui, Z. Evaluation of the immune response induced by a nasal anthrax vaccine based on the protective antigen protein in anaesthetized and non-anaesthetized mice. Journal of Pharmcy and Pharmacology. 58 (4), 439-447 (2006).
- Janakova, L., et al. Influence of intravenous anesthesia on mucosal and systemic antibody responses to nasal vaccines. Infection and Immunity. 70 (10), 5479-5484 (2002).
- Fuentes, J. M., et al. General anesthesia delays the inflammatory response and increases survival for mice with endotoxic shock. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (2), 281-288 (2006).
- Lee, Y. -M., Song, B. C., Yeum, K. -J. Impact of Volatile Anesthetics on Oxidative Stress and Inflammation. BioMed Research International. 2015, 242709 (2015).
