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Immunology and Infection

Vaccination intranasale et collecte de lait dans les études sur l’immunisation maternelle chez le lapin blanc de Nouvelle-Zélande (Oryctolagus cuniculus)

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

Cet article décrit et démontre l’administration de vaccins intranasaux et la collecte de lait de lapins en conctation (Oryctolagus cuniculus) comme moyen d’évaluer l’immunité muqueuse dans un modèle translationnelle approprié de vaccination maternelle.

Abstract

En raison des similitudes dans la placentation et le transfert d’anticorps avec les humains, les lapins sont un excellent modèle d’immunisation maternelle. D’autres avantages de ce modèle de recherche sont la facilité de reproduction et de prélèvement d’échantillons, une période de gestation relativement courte et une portée de grande taille. Les voies d’immunisation couramment évaluées comprennent les voies d’immunisation sous-cutanées, intramusculaires, intranasales et intradermiques. Le prélèvement d’échantillons non terminaux pour la détection chronologique des réponses immunologiques à ces immunisations comprend le prélèvement de sang, à la fois des mères et des trousses, et le lait provenant de l’allée. Dans cet article, nous démontrerons les techniques que notre laboratoire a utilisées dans les études de vaccination maternelle chez les lapins blancs de Nouvelle-Zélande(Oryctolagus cuniculus),y compris l’immunisation intranasale et la collecte de lait.

Introduction

Les études sur l’immunisation maternelle et le transfert d’anticorps sont inestimables pour de nombreuses raisons, car il s’agit de la voie initiale du transfert de l’immunité et de la protection subséquente contre les agents pathogènes et les maladies chez les nouveau-nés et les nourrissons. La vaccination maternelle a le potentiel d’avoir un impact positif sur la santé maternelle et infantile/infantile au niveau mondial en réduisant la morbidité et la mortalité associées à certains agents pathogènes au cours de cette période vulnérable1. L’objectif principal de cette stratégie est d’augmenter les niveaux d’anticorps maternels spécifiques tout au long de la grossesse. Ces anticorps peuvent ensuite être transférés au nouveau-né et au nourrisson à des niveaux suffisants pour protéger contre les infections jusqu’à ce que leur système immunitaire soit suffisamment mature pour répondre adéquatement aux défis1,2,3. Des travaux antérieurs ont démontré que des titres d’anticorps plus élevés à la naissance sont associés soit à une protection complète, soit à une apparition retardée et à une gravité réduite de nombreuses maladies infectieuses différentes chez le nouveau-né, y compris le tétanos, la coqueluche, le virus respiratoire syncytial (VRS), la grippe et les infections streptococciques du groupe B1,2,3.

Chez l’homme, les anticorps maternels sont transférés passivement à travers le placenta et sont également transférés à travers le lait maternel via l’allaitement. Des travaux antérieurs ont démontré que les taux d’IgA spécifiques au VIH dans le lait maternel humain chez les mères infectées par le virus étaient associés à une réduction de la transmission postnatale du virus, ce qui suggère un rôle protecteur pour les IgA4anti-VIH dans le lait maternel. Des études chez des primates non humains ont démontré que l’immunisation contre le VIH peut induire une réponse anticorps significative dans le lait maternel, et bien que des réponses sériques similaires aux IgG aient été induites à la suite d’une immunisation systémique par rapport à l’immunisation muqueuse, l’immunisation muqueuse a induit une réponse significativement plus élevée aux IgA dans le lait5,6.

L’identification d’un modèle animal approprié sur le plan translationnelle pour ces études devrait tenir compte du type de placentation et des mécanismes de transfert d’anticorps passifs, ainsi que du transfert d’anticorps par le lait maternel. Il existe trois principaux types de placentation chez les mammifères en fonction des types de tissus et des couches à l’interface materno-fœtale, y compris l’hémochorial (primates, rongeurs et lapins), l’endothéliochorial (carnivores) et l’épithéliochorial (chevaux, porcs et ruminants). Le placenta hémochorial est le type le plus invasif, permettant une communication directe entre l’apport sanguin maternel et le chorion, ou la membrane fœtale la plus externe. Sur la base du nombre de couches de trophoblastes, il existe plusieurs variations de placentation hémochoriale, y compris le placenta hémomonochorial trouvé chez les primates, le placenta hémochichorial chez le lapin et le placenta hémotrichorial observé chez le rat et la souris7. Ce contact direct entre l’apport sanguin maternel et le chorion permet le transfert passif d’anticorps à travers le placenta pendant la gestation. Les IgG sont la seule classe d’anticorps qui traverse de manière significative le placenta humain8,tandis que les IgA sont la classe prédominante d’Ig présente dans le lait maternel humain9. Parmi les modèles scientifiquement pertinents, seuls les primates (y compris les humains), les lapins et les cobayes transfèrent des IgG in utero et des IgA dans le lait10,11. Par conséquent, le modèle du lapin intègre des facteurs comparables à ceux chez l’homme qui contrôlent le transfert transplacentaire d’IgG et le transfert lactationnel d’IgA.

En plus de servir de modèle exceptionnel pour l’immunité maternelle et le développement de vaccins, les similitudes entre les cavités nasales du lapin et de l’homme en font un modèle approprié pour l’immunisation intranasale. Le volume de la cavité nasale du lapin est plus similaire à celui des humains que les modèles de rongeurs basés sur la masse corporelle relative12. De plus, Casteleyn et coll. 12 ont démontré que le tissu lymphoïde associé nasal (NALT) est plus volumineux chez le lapin que chez les rongeurs. Le NALT est situé principalement à l’aspect ventral et ventromedial du méat nasal ventral et à l’aspect latéral et dorsolatéral du méat nasopharyngé chez le lapin, tandis que chez les rongeurs, le tissu lymphoïde n’est présent que le long de l’aspect ventral du méat nasopharyngé12. Chez le lapin, la structure et l’emplacement des lymphocytes intraépithéliales et lamina propria, ainsi que les follicules lymphoïdes isolés, sont similaires à ceux des humains12.

Les avantages supplémentaires de l’utilisation du lapin comme modèle d’immunité maternelle et muqueuse comprennent sa fécondité élevée et sa période de gestation relativement courte. Les gros vaisseaux sanguins auriculaires permettent un accès relativement facile à de grands volumes de sang pour les collectes en série. Une variété d’échantillons muqueux peuvent être prélevés pour les tests de réponse anticorps spécifiques à l’antigène, y compris le lait maternel13 (lors de l’allaitement), les sécrétions muqueuses ou les lavages (par exemple, orale14,15,16,lavage bronchoalvéolaire13,17,18,19,vaginal20,21,22)et matières fécales20,23,24,25. Des échantillons de lait peuvent être facilement prélevés pendant l’allaitement pour évaluer la présence de réponses anticorps spécifiques à l’antigène. Bien qu’ils ne soient pas aussi abondants que pour les humains et les souris, une grande variété de réactifs expérimentaux sont disponibles pour les études et les essais spécifiques aux lapins. Dans cet article, nous décrirons et démontrerons l’immunisation intranasale et la collecte de lait chez les lapins blancs de Nouvelle-Zélande (Oryctolagus cuniculus).

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Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées et exécutées conformément aux politiques de l’IACUC de l’Université Duke.

REMARQUE : Les matériaux nécessaires sont fournis dans la table des matériaux.

1. Sédation et anesthésie du lapin

  1. Calmer le lapin femelle (sexuellement mature; environ 5-30 mois) en administrant l’acepromazine par voie intramusculaire (IM) à une dose de 1 mg/kg. Selon la taille de l’animal, utilisez une seringue de 1 ou 3 mL avec une aiguille de 25 G. Les muscles epaxiaux sont le site préféré de l’injection intramusculaire.
    REMARQUE: L’acepromazine peut également être administrée par voie sous-cutanée, mais la MI est préférée par le laboratoire, car elle agit plus rapidement et réduit l’incidence des lésions cutanées.
  2. Attendez 10-15 minutes pour permettre à l’acepromazine de prendre effet.
  3. Anesthésiez le lapin avec de l’isoflurane en plaçant le cône de nez connecté sur le nez de l’animal. Réglez le vaporisateur jusqu’à 4% d’isoflurane combiné avec jusqu’à 4 litres / minute d’oxygène. Les lapins ont une forte aversion pour l’isoflurane, il est donc nécessaire de les restreindre suffisamment lors du masquage de l’animal.
  4. Une fois complètement anesthésié, comme évalué par le pinna, la pédale, et/ou le réflexe palpébral, appliquez le lubrifiant ophtalmique à chaque oeil pour empêcher le dessèchement des yeux et l’ulcération cornéenne suivante.
  5. Surveillez continuellement les réflexes et la respiration pendant l’anesthésie, et réduisez le taux d’isoflurane à 1-2% une fois qu’un plan adéquat d’anesthésie a été atteint.

2. Immunisation intranasale

  1. Préparer une solution d’immunisation avant la manipulation de l’animal.
  2. Calmez le lapin comme décrit ci-dessus.
  3. Une fois que le membre du laboratoire est prêt à administrer le vaccin et que le lapin est dans un plan d’anesthésie adéquat, éteignez l’isoflurane et l’oxygène et retirez le cône de nez.
  4. Placez le lapin en réamence dorsale et soutenez le cou et la tête à un angle d’environ 45 ° qui permet un accès et une visualisation faciles des deux narines par le membre du laboratoire qui administre le vaccin.
  5. Chargez la pipette avec pas plus de 100 μL de la solution vaccinale et administrez rapidement la solution dans chaque narine. La pipette doit être maintenue à un angle d’environ 45°, incliné vers l’aspect médial du passage nasal.
    NOTA : L’objectif de l’immunisation est que la solution entre en contact avec la membrane muqueuse des narines, de sorte que la pointe ne doit pas être placée dans les narines, car cela pourrait entraîner une abrasion ou une irritation des tissus muqueux et potentiellement influencer l’immunogénicité du vaccin administré par voie nasale. Le vaccin doit être administré rapidement et fait de la même manière dans l’autre nare.
  6. Après l’administration dans les deux voies nasales, maintenir le lapin en réamence dorsale pendant 30 secondes afin de minimiser les fuites de la solution vaccinale.
    REMARQUE : Le laboratoire n’administre généralement pas plus de 100 μL par narine à la fois. Si un volume plus important doit être administré, avec un total maximal de 500 μL, le vaccin peut être administré en aliquotes de 100 μL avec une période de repos de 30 secondes entre les vaccinations, et des administrations supplémentaires de vaccin répétées, avec 30 secondes de repos entre chaque administration, jusqu’à ce que le volume total de vaccin soit livré.
  7. Après l’immunisation, placez le lapin sur le ventrum pour le rétablissement et surveillez de près l’animal jusqu’à ce qu’il puisse maintenir la réamence sternale.

3. Collecte du lait

  1. Calmez le lapin en allaitant comme décrit ci-dessus.
  2. Nettoyez la peau sur la veine marginale de l’oreille avec l’écouvillon/lingette d’alcool.
  3. À l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 25 g, administrer environ 1 à 2 UI d’ocytocine par voie intraveineuse par l’intermédiaire de la veine marginale de l’oreille pour induire la déception du lait.
    REMARQUE: En raison de la relaxation des muscles lisses, il est courant pour le lapin d’uriner ou de déféquer après l’administration d’ocytocine.
  4. Après l’administration d’ocytocine, appliquez une pression sur le site d’injection avec le morceau de gaze.
  5. Tout en maintenant le masque d’anesthésie sur le nez du lapin, soutenez le lapin sur son quartier arrière.
    REMARQUE: La collecte du lait peut également être effectuée avec l’animal en recumbency latérale, mais le laboratoire constate que la collecte est plus facile lorsque le lapin est appuyé sur sa croupe avec un assistant tenant le lapin debout avec le masque d’anesthésie.
  6. Ouvrez le tube stérile pour vous préparer à la collecte du lait et localisez le tissu mammaire et les trayons associés. Les trayons sont généralement entourés de fourrure humide provenant d’allaitements récents, et le tissu mammaire est facilement palpable lorsqu’il est plein de lait.
  7. Saisissez le tissu mammaire associé à une trayon entre le pouce et l’index et appliquez une pression douce et massante sur le tissu glandulaire dans la direction du trayon. Placez le tube de collecte sur le trayon pour recueillir le lait exprimé.
    REMARQUE: Il peut parfois prendre plusieurs minutes pour que l’ocytocine soit efficace, et la production de lait semble varier entre les glandes mammaires. Si l’expression du lait n’est pas réussie, attendez quelques minutes ou tournez autour des glandes mammaires supplémentaires. Le lait de toutes les tétines peut être collecté dans le même flacon. Typiquement, plusieurs millilitres de lait peuvent être facilement collectés à partir d’une bèce en lait.
  8. Après la collecte du lait, éteignez l’isoflurane et l’oxygène et laissez le lapin se rétablir tout en étant surveillé de près jusqu’à ce que l’animal soit en mesure de maintenir la recumbence sternale.

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Representative Results

La figure 1donne un aperçu d’un plan d’étude typique de l’immunisation intranasale de la mère, qui comprend les immunisations, la reproduction, l’allaitement, la lactation et le transfert d’anticorps. Bien qu’il ne soit pas illustré, le sang devrait être prélevé avant l’immunisation initiale pour les mesures de base et tout au long du reste de l’étude à intervalles réguliers. Le sang est facilement obtenu par l’intermédiaire de l’artère centrale d’oreille avec la sédation douce et un agent analgésique topique (par exemple, lidocaïne 2,5% et prilocaine 2.5% crème). La présence de taux d’IgG spécifiques à l’antigène peut être mesurée dans ces échantillons. Les lapines sont immunisées par voie intranasale, comme décrit dans le protocole et démontré dans la vidéo. Selon l’étude, le vaccin peut nécessiter un coup de pouce ou devoir être administré par une voie supplémentaire (p. ex. intramusculaire ou sous-cutanée). Après le début de l’étude, les lapins sont élevés; nous préférons acheter des éleveurs éprouvés auprès de fournisseurs à utiliser pour assurer un taux de grossesse plus élevé pour ces études. Selon le calendrier d’immunisation, les lapines peuvent recevoir des vaccins supplémentaires tout au long de la grossesse. Les IgG spécifiques à l’antigène sont transférées transplacentairement aux trousses et, environ 30 à 32 jours après la reproduction, les femmes enceintes s’en alliment. Nous vous recommandons de limiter la manipulation des kits pendant les premiers jours afin de minimiser le rejet des faits. Des échantillons de sang peuvent être prélevés dans les trousses pour évaluer les taux d’IgG spécifiques à l’antigène qui ont été transférés transplacentairement (Figure 3). En plus d’une grande variété de nutriments, les kits reçoivent des IgA de la bèvrante allaitante pendant l’allaitement. Les trousses sont généralement sevrées entre 4 et 8 semaines, mais avant le sevrage, le lait peut facilement être prélevé à partir de la laitage, comme le démontre la vidéo. Les échantillons de lait prélevés peuvent ensuite être traités pour la détection des niveaux d’IgA totaux et spécifiques à l’antigène (Figure 4). Selon l’étude, des vaccins (+/- boosts) peuvent être administrés aux trousses, et des échantillons de sang en série peuvent être prélevés sur les trousses à un très jeune âge en utilisant la veine saphène latérale.

Pour les études maternelles, déterminer la grossesse le plus tôt possible est utile pour la conception de l’étude et pour s’assurer que la bêchée n’a pas besoin d’être rebroussée. Les mesures de progestérone peuvent être utilisées comme moyen de détecter la grossesse. Comme le montre la figure 2, desniveaux élevés de progestérone peuvent être détectés chez les lapines gravides par rapport aux lapines non gravides, même après que les accouplements par un mâle ont été confirmés pour tous les cas. Il existe d’autres méthodes de détection de la grossesse, y compris la palpation manuelle, l’échographie et les radiographies; cependant, ceux-ci nécessitent un équipement personnel et approprié bien formé.

IgG antigène-spécifique qui a été transféré transplacentally tandis qu’in utero peut être mesuré dans le sérum des kits. Le sang peut être prélevé à partir d’un petit nombre de trousses au moment de la naissance ou près de celle-ci pour évaluer les niveaux précoces d’anticorps spécifiques à l’antigène, mais la collecte de sang en série est techniquement beaucoup plus facile à mesure que les trousses vieillissent et augmentent. Comme le montre la figure 3, lesconcentrations sériques d’IgG spécifiques à l’antigène dans les trousses peuvent être mesurées par ELISA et comparées aux concentrations maternelles. Les taux d’IgG transférés par la mère ont tendance à être plus élevés à la naissance et à diminuer avec le temps.

En tant que type d’échantillon muqueux, le lait peut être prélevé et transformé pour mesurer les niveaux d’anticorps totaux ou spécifiques à l’antigène. Comme le montre la figure 4,les IgA représentent une partie importante des niveaux totaux d’anticorps dans le lait maternel qui est transféré aux trousses par allaitement. Nos résultats démontrent que le lait maternel IgA produit un signal ELISA légèrement plus élevé (unités de lumière relative, RLU) par rapport aux IgG, et les IgA et les IgG produisent un signal qui est beaucoup plus élevé que le signal pour IgM. Ces résultats sont en accord avec les résultats d’autres qui suggèrent que le lait de lapin contient environ 4,5 mg/mL d’IgA, 2,4 mg/mL d’IgG et 0,1 mg/mL d’IgM26,27.

Figure 1
Figure 1. Chronologie de l’échantillon pour un plan d’étude d’immunisation intranasale maternelle dans un modèle de lapin (Oryctolagus cuniculus). Les lapines sont immunisées par voie intranasale, comme décrit dans le protocole et démontré dans la vidéo. Selon l’étude, le vaccin peut nécessiter un coup de pouce ou devoir être administré par une voie supplémentaire (p. ex. intramusculaire ou sous-cutanée). Les lapins sont ensuite élevés. Les IgG spécifiques à l’antigène sont transférées transplacentairement aux trousses et, environ 30 à 32 jours après la reproduction, les femmes enceintes s’en alliment. Les IgA sont transmises aux trousses de la bène allaitante pendant l’allaitement. Avant le sevrage, le lait peut facilement être prélevé à partir de l’allation pour évaluer les niveaux d’IgA totaux et spécifiques à l’antigène. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Taux de progestérone chez les lapines gestantes et non gestantines 3 semaines après la reproduction. Du sang a été prélevé sur des lapins à 3 semaines après la reproduction. Les lapines ont été confirmées enceintes ou non enceintes en fonction de leur capacité à allumer une portée 30 à 32 jours après la reproduction. Les taux sériques de progestérone ont été mesurés par le laboratoire de diagnostic vétérinaire de l’Université d’État du Michigan à l’aide d’un immunoessai chemiluminescent (CLIA) avec un système d’immunoessai (p. ex. Siemens Healthineers IMMULITE 2000). Les barres d’erreur représentent l’erreur type de la moyenne, et la taille de l’échantillon se composait de 4 à 6 lapins par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Taux d’IgG spécifiques à l’antigène dans les trousses (par rapport aux taux maternels) à la naissance et à l’âge de 3 semaines à la suite d’une série de vaccinations maternelles. Le sang a été prélevé sur les does et les kits peu de temps après l’essaisissant et à l’âge de 3 semaines. des niveaux antigène-spécifiques d’IgG dans le sérum ont été détectés utilisant un elisa fluorescent comme précédemment décrit28. IgG antigène-spécifique est tracé comme un rapport des niveaux détectés dans le sérum de kit et le sérum maternel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Une comparaison des niveaux d’IgA, d’IgM, et d’IgG dans le lait de lapin. Le lait de lapin a été recueilli comme décrit et démontré dans la vidéo. Le lait a été traité par centrifugation longue (13 000 x g pendant 4,5 heures à 4 °C), et la couche intermédiaire claire a été isolée après le traitement. Des niveaux totaux d’IgA, d’IgG, et d’IgM ont été mesurés dans cette couche claire par elisa fluorescent comme précédemment décrit28,excepté que des plaques ont été revêtues d’anti-IgA, d’anti-IgG, ou d’anti-IgM polyclonaux pour détecter le lapin total IgA, IgG, ou IgM, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Bien que cela ne soit pas décrit dans le protocole ci-dessus, un élevage réussi des lapins est nécessaire pour ce modèle maternel et pour permettre la collecte du lait. Les lapins sont facilement élevés par couverture vivante dans un cadre de recherche. Il est recommandé de le transférer dans la cage du mâle pour la reproduction, car il peut être territorial et agressif s’il est gardé dans sa propre cage avec le mâle. Si les femelles ne sont pas réceptives après 15 minutes (comme indiqué en s’envolant en mordant ou en vocalisant), la bègue doit être replacée dans sa propre cage. Il existe plusieurs vidéos et tutoriels informatifs sur l’élevage de lapins qui peuvent être observés en ligne29, mais après la reproduction, le mâle tombera généralement et pourra vocaliser. Une fois que cela est observé, la bè bè quinz peut être retournée dans sa cage. Un mâle peut se reproduire 2-3 fois par jour sans diminution du nombre de spermatozoïdes30. Dans notre protocole approuvé par l’IACUC, les mâles sont limités à la reproduction 10-12 fait par semaine et sont fournis au moins deux jours de repos par semaine, car les sources affirment qu’un seul mâle est généralement suffisant pour servir 10-15 fait31. Notre groupe suggère d’acheter des éleveurs éprouvés auprès du vendeur pour améliorer le taux de réussite de la reproduction. Comme les lapins sont des ovulateurs induits et que l’ovulation se produit généralement 10-13 heures après la copulation31, nous avons connu un taux de grossesse plus élevé dans les cas qui sont élevés le matin, puis à nouveau dans l’après-midi, ou deux fois dans cette fenêtre de 10-13 heures (augmentation observée de 75% à 95% taux de réussite, non publié). Selon la littérature, les taux de réussite typiques de reproduction varient de 57 à 100%32,33,34,35,36,37,38,39,40,et la taille moyenne des portées environ 7 à 9 kits31.

Déterminer la grossesse le plus tôt possible est utile dans les études maternelles pour confirmer que la bêchée n’a pas besoin d’être rebroussée ou retirée de l’étude. Les options pour la détection de la grossesse comprennent la palpation (dès 14 jours)31, l’échographie (dès 5-9 jours)40, les radiographies (dès le jour 11)31, la prise de poids et les techniques moléculaires, telles que les mesures des facteurs de croissance de l’insuline41 (IGF) et de la progestérone34,37,38,42,43. Des travaux antérieurs ont indiqué des élévations significatives des niveaux d’IGF-II chez les lapines gravides par rapport aux niveaux chez les lapines nongestantes 41. Cependant, dans nos mains, nous n’avons pas été en mesure de détecter une différence dans les niveaux d’IGF-II entre les lapines gestantes et non gestantes (non publié). Comme des niveaux adéquats de progestérone sont nécessaires pour le maintien de la grossesse chez les lapins37,44,plusieurs études ont évalué les niveaux de progestérone chez les lapines gestées et démontré des niveaux élevés par rapport aux lapines non gestantines, en particulier lors de l’organogenèse vers le milieu de la gestation34,43,44. Notre groupe n’a pas été en mesure de détecter les différences dans les niveaux de progestérone à l’aide d’un test ELISA entre les lapines gestantes et les lapines non gestantes, mais les résultats préliminaires à l’aide d’un test chemiluminescent automatisé au Laboratoire de diagnostic vétérinaire de l’Université d’État du Michigan indiquent des niveaux élevés de progestérone chez les lapines gravides par rapport aux lapines non gestantes, même après l’accouplement d’un mâle, ont été confirmés pour tous les cas évalués(figure 2).

L’allation peut produire environ 250 mL, ou 60 mL/kg, de lait par jour45,46,ce qui permet d’obtenir de grands volumes pour les essais expérimentaux afin d’évaluer les réponses/concentrations d’anticorps totaux et spécifiques à l’antigène. Le lait de lapin contient des niveaux élevés de matières grasses et de protéines, contenant 2 et 3 fois plus de niveaux concentrés de matières grasses et de protéines, par rapport au lait de vache et de truie, respectivement45,47. En raison de la teneur élevée en matières grasses du lait, les échantillons nécessitent un traitement important, en fonction des tests à effectuer. Après centrifugation de l’échantillon de lait, trois couches distinctes sont séparées, y compris les cellules à l’intérieur de la couche inférieure, la couche intermédiaire claire contenant les immunoglobulines, et la graisse dans la couche supérieure48. Les immunoglobulines, dans la couche intermédiaire claire, sont présentes à des concentrations élevées dans le colostrum et le lait et sont principalement composées d’IgA, d’IgG et d’IgM(figure 4). Bien que les échantillons de lait soient facilement collectés à la main, et c’est notre technique préférée en laboratoire, les systèmes de vide ont également été rapportés dans la littérature13,46,48. Yoshiyama et coll.48 ont prélevé des échantillons de lait à pression négative et ont décrit une longue centrifugation (15 000 x g pendant 4 heures) pour séparer les couches de lait avant de passer la couche intermédiaire claire à travers une colonne de Sépharose 4B pour l’élimination des immunoglobulines. En utilisant cette méthode, les auteurs ont pu détecter des anticorps spécifiques à la toxine du choléra dans le lait de lapin de lapins immunisés par voie orale à des niveaux suffisants pour la protection contre la sécrétion induite par Vibrio choleraedans l’intestin48. Peri et coll.13 échantillons de lait transformés prélevés par aspiration avec un système de vide d’eau par centrifugation à 4 °C pendant 2 heures à 24 000 x g. Dans cette étude, les auteurs ont pu détecter des IgA anti-RSV dans le colostrum, le lait et les sécrétions bronchiques et intestinales après l’immunisation muqueuse (orale ou intratrachéale), mais pas l’immunisation intraveineuse, tandis que des IgG anti-RSV ont été détectés dans le colostrum, le lait et le sérum indépendamment de la voie d’immunisation13.

Au cours de la procédure d’immunisation intranasale, il faut prendre soin de confirmer que le lapin est dans un plan d’anesthésie adéquat et d’éviter d’administrer de grandes quantités de vaccins à la fois. Des travaux antérieurs de notre groupe ont montré que l’efficacité de l’immunisation intranasale a été influencée par l’utilisation de l’anesthésie49. Plus précisément, l’anesthésie profonde induite par l’association de kétamine et de xylazine était corrélée avec une immunogénicité accrue du vaccin administré par voie nasale et une meilleure rétention nasale de la solution. Ces niveaux étaient significativement plus élevés que la rétention et l’immunogénicité chez les lapins immunisés par voie intranasale après sédation avec de l’acepromazine et du butorphanol49. Des résultats similaires ont également été démontrés à la suite de l’immunisation intranasale chez les souris50,51. En plus, notre travail a démontré l’immunogénicité accrue suivant l’immunisation intranasale sous l’anesthésie profonde au-dessus des animaux qui étaient entièrement éveillés et au-dessus des animaux subissant l’anesthésie de plus courte durée avec une combinaison d’acepromazine et d’isoflurane. Cette différence dans l’immunogénicité d’IgG entre l’anesthésie profonde contre plus courte de durée était significative au point de temps de 42 jours mais pas au point de temps de 56 jours. Bien que l’immunogénicité et la rétention accrues puissent résulter de l’anesthésie plus profonde, les lapins ont eu besoin d’au moins 30 minutes pour récupérer ; tandis que les lapins étaient debout et mobiles dans les 5 minutes suivant la réception du vaccin nasal suivant l’anesthésie isoflurane-induite de plus courte durée. Bien que l’anesthésie puisse ne pas être idéale pour imiter le cadre clinique de l’immunisation intranasale chez les humains, une anesthésie de plus courte durée (p. ex. isoflurane) peut être préférée à une anesthésie plus longue et profonde avec des agents injectables (p. ex. kétamine + xylazine). L’utilisation d’un modèle animal, comme l’ont démontré Gwinn et coll.49, nécessitera souvent l’utilisation de sédation ou d’anesthésie pour permettre une manipulation sécuritaire des animaux et l’administration efficace et uniforme des vaccins. Une limitation potentielle de l’utilisation de l’anesthésie avec l’administration de vaccins chez des modèles animaux est son effet sur la capacité de l’animal à induire une réponse immunitaire appropriée au vaccin. Intéressant, les rapports dans la littérature suggèrent que l’isoflurane puisse atténuer des réponses inflammatoires systémiques, fournissant la protection contre des défis52 et réduisant le stress oxydant et l’inflammation53.

En ce qui concerne la minimisation de la perte de vaccin et l’administration intranasale adéquate, notre groupe recommande une période de repos de 30 secondes après l’administration de chaque partie aliquote du vaccin intranasal afin de permettre la rétention de la solution dans la cavité nasale et d’empêcher la solution de s’infiltrer des narines si le lapin est immédiatement placé en réaménagé sternal et retourné dans la cage. De plus, il est important de limiter le volume de la partie aliquote administrée pour assurer l’immunisation intranasale, car l’absorption muqueuse est limitée par la surface du passage nasal. Si un grand volume est administré, la solution peut contourner la muqueuse nasale et entraîner une immunisation par inhalation ou gastrique. Notre groupe recommande des aliquotes de 100 μL par narine avec un volume intranasal maximal de 500 μL.

Cet article se concentre sur l’administration muqueuse du vaccin, en particulier par voie intranasale, mais il existe de multiples méthodes d’immunisation, muqueuses et parentérales, qui ont été démontrées chez le lapin. Ces méthodes supplémentaires incluent, mais ne sont pas limitées à, oral, sous-cutané, intramusculaire, et intradermique. Par conséquent, les échantillons à recueillir et à évaluer varient en fonction des objectifs expérimentaux et de la voie d’immunisation.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier la Division des ressources animales de laboratoire de l’Université Duke et son équipe d’élevage pour leur aide et les grands soins prodigués aux animaux. De plus, les auteurs aimeraient remercier l’équipe de PhotoPath du Département de pathologie pour son aide dans les parties audio et vidéo du manuscrit. Ces travaux ont été soutenus par des fonds de recherche discrétionnaires du laboratoire Staats.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

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Immunologie et infection Numéro 173 Immunisation maternelle Immunisation intranasale Immunisation muqueuse Collecte de lait Lait de lapin Oryctolagus cuniculus.
Vaccination intranasale et collecte de lait dans les études sur l’immunisation maternelle chez le lapin blanc de Nouvelle-Zélande (<em>Oryctolagus cuniculus</em>)
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Landon, C. D., Dancourt, G., Shing,… More

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

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