Summary
この記事では、母体免疫の翻訳的に適切なモデルで粘膜免疫を評価する手段として、鼻腔内ワクチンの投与と授乳中ウサギ(Oryctolagus cuniculus)からのミルクの採取について説明し、実証する。
Abstract
ヒトとの胎盤および抗体の伝達の類似性により、ウサギは母親の免疫の優れたモデルです。この研究モデルの追加の利点は、繁殖とサンプル採取の容易さ、比較的短い妊娠期間、および大きなごみサイズです。一般的に評価される予防接種の経路には、皮下、筋肉内、鼻腔内、皮内が含まれる。これらの免疫に対する免疫応答の時系列的な検出のための非末端サンプル収集には、血液の収集、ダムおよびキットの両方からの採取、および授乳中からのミルクが含まれる。本稿では、ニュージーランド白ウサギ(眼球状闘菌)の鼻腔内免疫やミルク採取などでの母体免疫の研究で、当研究室が利用した技術を紹介します。
Introduction
これは、免疫伝達の初期経路であり、新生児および乳児の病原体および疾患からの保護であるため、母親の免疫化および抗体の移動に関する研究は、多くの理由から非常に貴重である。母体免疫は、この脆弱な期間1の間に特定の病原体に関連する罹患率および死亡率を減少させることによって、母体と乳児/小児の両方の健康に世界的なレベルでプラスの影響を与える可能性を有する。この戦略の主な目標は、妊娠中の特定の母体抗体のレベルを増加させることです。これらの抗体は、免疫系が十分に成熟して課題1、2、3に適切に対応するまで、感染症から保護するのに十分なレベルで新生児と乳児に移すことができる。以前の研究では、出生時の高い抗体力力は、破傷風、百日膜、呼吸器間性ウイルス(RSV)、インフルエンザ、およびグループBレンサ球菌感染症1、2、3を含む新生児の多数の異なる感染症の完全な保護または発症および減少した重症度のいずれかに関連していることを実証した。
ヒトでは、母体抗体は胎盤を横切って受動的に移動し、授乳を介して母乳を介して移動される。以前の研究では、ウイルスに感染した母親からのヒト母乳中のHIV特異的IgAレベルが、ウイルスの出生後感染の減少に関連していたことを示しており、母乳抗HIV IgA4の保護的役割を示唆している。非ヒト霊長類の研究は、HIVに対する免疫が母乳中に有意な抗体応答を誘導できることを実証しており、同様の血清IgG応答は全身性対粘膜免疫に続いて誘導されたが、粘膜免疫はミルク5,6内で有意に高いIgA応答を誘発した。
これらの研究のための翻訳的に適切な動物モデルを特定することは、胎盤の種類と受動抗体の移動のメカニズム、ならびに母乳を介した抗体の伝達を考慮に入れるべきである。哺乳類には、ヘモコリアル(霊長類、げっ歯類、ウサギ)、内皮交帯(食用動物)、上皮(馬、豚、反すう物)を含む、マテルノ胎児界面の組織タイプと層に基づく3つの主なタイプの胎盤があります。血血性胎盤は最も侵襲的なタイプであり、母体の血液供給と絨毛膜、または最も外側の胎児膜との間の直接的なコミュニケーションを可能にする。栄養芽細胞層の数に基づいて、霊長類に見られるヘモモノコアル胎盤、ウサギの血液透析胎盤、およびラットおよびマウスで観察される血液胞子胎盤を含む、いくつかの変化がある。母親の血液供給と絨毛の間のこの直接接触は、妊娠の間に胎盤を渡る抗体の受動的な移動を可能にする。IgGは、ヒト胎盤8を有意に交差する唯一の抗体クラスであるが、IgAはヒト母乳9に見られるIgの主要クラスである。科学的に関連するモデルのうち、霊長類(ヒトを含む)、ウサギ、モルモットだけが乳10,11の子宮とIgAでIgGを移す。したがって、ウサギモデルは、IgGの経胎盤移動およびIgAの授乳伝達を制御するヒトと同等の因子を組み込んでいる。
母親の免疫とワクチンの開発のための例外的なモデルとして機能することに加えて、ウサギと人間の鼻腔の間の類似点は、彼らが鼻腔内免疫のための適切なモデルになります。ウサギの鼻腔の体積は、相対体重12に基づくげっ歯類モデルよりもヒトに似ている。さらに、Casteleynら 12 は、鼻関連リンパ組織(NALT)がげっ歯類と比較してウサギでよりボリュームが多いことを実証した。NALTは主に腹側鼻腔の腹側および腹室の側面に位置し、ウサギの鼻咽頭肉の側側および側側方に位置し、げっ歯類ではリンパ組織は鼻咽頭肉12の腹側に沿ってのみ存在する。ウサギでは、上皮内および層状菌の構造および位置、および単離されたリンパ卵胞と同様に、ヒト12に類似している。
母体免疫と粘膜免疫のモデルとしてウサギを使用する追加の利点は、それらの高い胎児性と比較的短い妊娠期間が含まれます。大きな耳介血管は、連続コレクションのための大量の血液への比較的容易なアクセスを可能にする。さまざまな粘膜サンプルを、母乳13(授乳時)、粘膜分泌または洗浄(例えば、経口14、15、16、気管支肺胞洗浄13、17、18、19、膣20、21、22)、および203、203、およびfeces 203を含む、抗原特異的抗体応答アッセイのために収集することができる。乳サンプルは、授乳中に容易に収集して、抗原特異的抗体応答の存在を評価することができます。ヒトやマウスほど豊富ではありませんが、ウサギ特有の研究やアッセイには多種多様な実験試薬が用意されています。本稿では、ニュージーランド白ウサギ(オリクトラグス・クニキュラス)における鼻腔内予防接種とミルクコレクションについて説明し、デモンストレーションを行います。
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Protocol
すべての手順は、デューク大学IACUCポリシーに従って承認され、実行されました.
注: 必要な資料は、 資料一覧に記載されています。
1. ウサギの沈下と麻酔
- 1mg/kgの用量でアセプロマジンを筋肉内(IM)に投与することによって、雌ウサギ(性的に成熟し、約5〜30ヶ月)を鎮静させる。動物の大きさに応じて、25G針を用いて1mLまたは3mLの注射器を使用してください。エパキシアル筋肉は筋肉内注射の好ましい部位である。
注:アセプロマジンはまた皮下投与することができるが、IMは、それがより迅速に作用し、皮膚病変の発生率を減少させるので、ラボによって好ましい。 - アセプロマジンが有効になるまで10〜15分待ちます。
- 動物の鼻の上に接続された鼻コーンを置くことによってイオブルランでウサギを麻酔します。最大4%のイオブルランと最大4リットル/分の酸素を組み合わせるまで気化器を調整してください。ウサギはイソフルランに対して高い嫌悪感を持っているので、動物をマスキングする際には十分な拘束が必要です。
- ピナ、ペダル、および/またはパルペブラル反射によって評価されるように完全麻酔が完了したら、眼の乾燥とその後の角膜潰瘍を防ぐために、各目に眼用潤滑剤を適用します。
- 麻酔中の反射神経と呼吸を継続的に監視し、十分な麻酔面に達するとイソフルラン速度を1〜2%に下げる。
2. 鼻腔内予防接種
- 動物の取り扱い前に免疫液を準備する。
- 上述のようにウサギを鎮静する。
- ラボメンバーがワクチンを投与する準備ができ、ウサギが麻酔の適切な平面に入ったら、イオブルランと酸素をオフにして鼻コーンを取り除きます。
- ウサギを後回しにし、ワクチンを投与するラボメンバーによる両方のナレスの容易なアクセスと視覚化を可能にする約45°の角度で首と頭を支えます。
- ワクチン溶液の100 μL以下でピペットをロードし、各鼻孔で溶液を迅速に投与します。ピペットは、鼻通路の内側の側面に向かって角度を付けて、およそ45°の角度で保持する必要があります。
注:免疫の目的は、溶液がナレスの粘膜に接触するため、粘膜組織の摩耗または刺激をもたらし、鼻腔投与ワクチンの免疫原性に影響を与える可能性があるため、先端をナレス内に配置してはならない。ワクチンは迅速に投与され、他のナレでも同様に行われるべきである。 - 両方の鼻腔で投与後、ウサギを30秒間後部の不順に維持し、ワクチン溶液の漏れを最小限に抑える。
注: 通常、ラボは一度に 100 μL 以下の単位で管理します。より大きな容積を投与する場合、最大合計500μLで、ワクチンは予防接種の間に30秒の休息期間を有する100μLアリコートで与えられ、ワクチンの追加投与は各投与の間に30秒間休息し、総ワクチン量が送達されるまで与えることができる。 - 免疫化後、ウサギを心室に置いて回復し、胸骨の持続性を維持できるまで動物を注意深く監視する。
3. ミルクコレクション
- 上述のように授乳ウサギを鎮静する。
- アルコール綿棒/ワイプで限界耳静脈の上の皮膚をきれいにします。
- 1 mLシリンジと25gの針を使用して、乳の失望を誘発するために、限界耳静脈を介して静脈内に約1〜2IUのオキシトシンIUを投与する。
注:平滑筋弛緩のために、ウサギはオキシトシンの投与後に排尿または排便することが一般的です。 - オキシトシン投与後、ガーゼの一部を用いて注射部位に圧力をかける。
- ウサギの鼻の上に麻酔マスクを維持しながら、その後部にウサギを支えます。
注:ミルクコレクションは、横の遅れで動物と一緒に行うこともできますが、ラボは、ウサギが麻酔マスクでウサギを直立したままのアシスタントと一緒にそのランプに突き上げられると、コレクションが簡単であることを発見しました。 - 無菌チューブを開いてミルクの採取の準備をし、乳腺組織と関連する乳酸塩を見つけます。乳酸塩は通常、最近の看護から湿った毛皮に囲まれており、乳腺組織はミルクでいっぱいになると容易に触知可能である。
- 親指と人差し指の間の乳頭に関連する乳腺組織をつかみ、乳頭の方向に腺組織に穏やかでマッサージ圧を加える。コレクションチューブを乳の上に置き、表現された牛乳を回収します。
注:オキシトシンが有効になるのに数分かかることがあり、乳腺によって乳の生産が異なるように見えます。ミルクの発現が成功しない場合は、数分待つか、追加の乳腺に回します。すべての乳酸塩からのミルクは同じバイアルで集めることができる。典型的には、数ミリリットルの牛乳を授乳中のドエから容易に採取することができる。 - ミルクコレクションに続いて、イオブルランと酸素をオフにし、動物が胸骨の不順を維持できるようになるまで注意深く監視しながらウサギが回復できるようにします。
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Representative Results
典型的な母体の鼻腔内免疫研究の設計の概要を 図1に示し、予防接種、繁殖、種分、授乳、抗体伝達を取り入れています。図示されていないが、血液はベースライン測定のための最初の予防接種の前に、そして一定の間隔で研究の残りの部分を通して収集されるべきである。血液は、軽度の沈下および局所鎮痛剤(例えば、リドカイン2.5%およびプリロカイン2.5%クリーム)を有する中央耳動脈を介して容易に得られる。抗原特異的IgGレベルの存在は、これらのサンプルで測定することができる。雌ウサギは、プロトコルに記載されているように、鼻腔内経路を介して免疫され、ビデオで実証される。研究に応じて、ワクチンはブーストを必要とするか、追加のルート(例えば、筋肉内または皮下)を介して与えられる必要があるかもしれません。研究開始に続いて、ウサギは飼育されます。我々は、これらの研究のためのより高い妊娠率を確保するために使用するベンダーから実績のあるブリーダーを購入することを好む。予防接種のタイムラインに応じて、ウサギは妊娠中に追加の予防接種を受ける可能性があります。抗原特異的IgGはキットにトランスサプレイスに移され、繁殖後約30〜32日で、妊娠は親切になります。最初の数日間はキットの取り扱いを制限して、拒否を最小限に抑えることをお勧めします。血液サンプルは、トランス胎盤に移された抗原特異的IgGレベルを評価するためにキットから採取することができる(図3)。多種多様な栄養素に加えて、キットは授乳中に授乳中に授乳中の作業からIgAを受け取ります。キットは通常4-8週間で離乳しますが、離乳する前に、ビデオで示されているように、授乳からミルクを簡単に収集することができます。採取した乳サンプルは、その後、全抗原特異的IgAレベルの検出のために処理することができる(図4)。研究に応じて、ワクチン(+/-ブースト)をキットに投与することができ、連続血液サンプルは横型サフェヌス静脈を使用して非常に早い時期にキットから採取することができる。
母親の研究では、できるだけ早く妊娠を決定することは、研究の設計と、ドエを再繁殖する必要がないようにするのに役立ちます。プロゲステロン測定は、妊娠を検出する手段として使用することができる。 図2に示すように、プロゲステロンレベルの上昇は、すべての人に対して、金による交配が確認された後でも、妊娠していないウサギと比較して、妊娠ウサギで検出することができる。手動触診、超音波、およびX線写真を含む妊娠検出のための追加の方法があります。しかし、これらは十分な訓練を受けた個人的かつ適切な機器を必要とします。
子宮内でトランスサクロス的に転写された抗原特異的IgGは、キットの血清中で測定することができる。出生時または出生時近くの少数のキットから血液を採取して初期の抗原特異的抗体レベルを評価することができますが、キットの年齢と増加が大きくなるにつれて、連続採血は技術的にはるかに簡単です。図3に示すように、キット中の抗原特異的IgGの血清レベルはELISAによって測定され、母体レベルと比較することができる。母体的に移されたIgGレベルは出生時に高くなり、時間の経過とともに減少する傾向がある。
粘膜試料の一種として、ミルクを採取して処理して、全量または抗原特異的抗体レベルを測定することができます。図4に示すように、IgAは授乳によってキットに移される母乳内の全抗体レベルのかなりの部分を構成しています。我々の結果は、母乳IgAがIgGと比較してわずかに高いELISA信号(相対光単位、RLU)を生成し、IgAとIgGの両方がIgMの信号よりもはるかに高い信号を生成することを示している。これらの結果は、ウサギのミルクが約含まれていることを示唆する他の結果と一致しています 4.5 mg/mL IgA, 2.4 mg/mL IgG, および 0.1 mg/mL IgM26,27.
図 1.ウサギ(オリクトラグス・クニキュラス)モデルにおける母体の鼻腔内免疫研究の設計のサンプルタイムライン。 雌ウサギは、プロトコルに記載されているように、鼻腔内経路を介して免疫され、ビデオで実証される。研究に応じて、ワクチンはブーストを必要とするか、追加の経路(例えば筋肉内または皮下)を介して与えられる必要があるかもしれない。ウサギは、その後飼育されます。抗原特異的IgGはキットにトランスサプレイスに移され、繁殖後約30〜32日で、妊娠は親切になります。IgAは授乳中に授乳中に授乳中のキットに渡されます。離乳する前に、乳は授乳から容易に収集することができ、総および抗原特異的IgAレベルを評価する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.妊娠および非妊娠ウサギのプロゲステロンレベルは、3週後の繁殖後に。 ウサギから採血したのは、飼育後3週間です。ウサギは、繁殖後30〜32日でごみを親切にする能力に基づいて、妊娠または非妊娠のいずれかが確認された。血清プロゲステロンレベルは、免疫測定システムを用いた化学発光免疫測定法(CLIA)を用いてミシガン州立大学獣医診断研究所を通じて測定した(例えば、シーメンス・シヒニナーIMMULITE 2000)。誤差範囲は平均の標準誤差を表し、サンプルサイズはグループごとに4~6匹のウサギで構成されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.一連の母親の予防接種の後、出生時および3週齢におけるキット内の抗原特異的IgGレベル(母性レベルに対する)。 血液は、親切の直後と生後3週で行い、キットから採取されました。血清中の抗原特異的IgGレベルは、前述の28の蛍光ELISAを用いて検出した。抗原特異的IgGは、キット血清と母体血清中で検出されたレベルの比率としてプロットされる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.ウサギミルクにおけるIgA、IgM、IgGレベルの比較 ウサギのミルクは、ビデオで説明し、実証したように収集されました。牛乳は長い遠心分離(4°Cで4.5時間13,000 x g)で処理し、透明な中間層を処理後に分離した。全IgA、IgG、およびIgMのレベルは、前述の蛍光ELISAによってこの透明層で測定した28、プレートをポリクローナル抗IgA、抗IgG、または抗IgMでコーティングし、全ウサギIgA、IgG、またはIgMをそれぞれ検出した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
上記のプロトコルでは説明されていませんが、ウサギの繁殖は、この母体モデルのために、ミルクの収集を可能にするために必要です。ウサギは研究環境でライブカバーで簡単に飼育されます。それは、バックで自分のケージに保管されている場合、領土と攻撃的なことができますように、繁殖のためにバックのケージに転送することをお勧めします。女性が15分後に受容性がなくなる場合(噛み付き、または発声によって示されるように)、おしっこは自分のケージに戻す必要があります。オンラインで観察することができるウサギの繁殖に関するいくつかの有益なビデオやチュートリアルがあります29しかし、繁殖後、男性は通常転倒し、発声することがあります。これが観察されると、doeは彼女のケージに戻すことができます。バックは精子数30の減少なしで1日2〜3回繁殖するかもしれない。私たちのIACUC承認プロトコルでは、バックは週に10-12を繁殖させることに制限されており、ソースが通常10-15にサービスを提供するのに十分であると述べているように、週に少なくとも2つの休息日を提供されます。私たちのグループは、繁殖成功率を向上させるためにベンダーから実績のあるブリーダーを購入することを提案します。ウサギは排卵誘発体であり、排卵は通常10〜13時間の交尾後に起こるので、我々は午前中に飼育され、午後に再び、またはその10-13時間のウィンドウ内で2回(75%から95%の成功率、未発表の増加を観察した)でより高い妊娠率を経験しました。文献に基づいて、典型的な繁殖成功率は57-100%32、33、34、35、36、37、38、39、40、およびごみサイズは平均約7-9キット31から変化する。
できるだけ早く妊娠を決定することは、おしっこを再繁殖または研究から取り除く必要がないことを確認するために母親の研究に役立ちます。妊娠検出のためのオプションは、触診(早くも14日)31、超音波(早ければ5-9日)40、X線写真(早ければ11日目)31、体重増加、およびインスリン成長因子41(IGF)およびプロゲステロン34、37、38、42、43の測定などの分子技術を含む。以前の研究は、妊娠していないウサギのレベルと比較して妊娠ウサギのIGF-IIレベルの有意な上昇を示している41.しかし、私たちの手の中では、妊娠中と非妊娠のウサギ(未発表)の間のIGF-IIレベルの違いを検出することができませんでした。十分なプロゲステロンレベルは、ウサギ37、44の妊娠の維持のために必要であるとして、いくつかの研究は、妊娠中のウサギのプロゲステロンレベルを評価し、特に妊娠34、43、44の周りの有機的な形成中に、非妊娠ウサギに対して上昇レベルを実証している。私たちのグループは、妊娠中と妊娠していないウサギの間のELISAを使用してプロゲステロンレベルの違いを検出できませんでしたが、ミシガン州立大学獣医診断研究所で自動化学発光アッセイを使用した予備的な結果は、1ドルによる交配後でも妊娠していないウサギのプロゲステロンレベルの上昇を示しています(図2)。
授乳は、毎日45、46の牛乳の約250 mL、つまり60 mL/kgを生成することができ、実験アッセイのための大量の総および抗原特異的抗体応答/濃度を評価することができます。ウサギのミルクは、それぞれ45、47、牛と雌乳と比較して、脂肪とタンパク質の2と3倍の濃縮レベルを含む脂肪とタンパク質の高レベルが含まれています。牛乳中の脂肪分が高いため、サンプルは、実施されるアッセイに応じて、かなりの処理を必要とします。乳試料の遠心分離後、下層内の細胞を含む3つの異なる層が分離され、免疫グロブリンを含む透明な中間層、および最上層48内の脂肪が含まれる。免疫グロブリンは、透明な中間層内に、初乳および乳内に高濃度で存在し、主にIgA、IgG、およびIgMで構成されている(図4)。ミルクサンプルは手で簡単に収集できるが、これが実験室内での好ましい技術であるが、真空システムは文献13、46、48にも報告されている。吉山ら48は、陰圧を用いて乳試料を採取し、免疫グロブリン除去のために透明な中間層を通してセファローズ4Bカラムを通過する前に、乳層を分離するための長い遠心分離(4時間15,000×g)を記載した。この方法を用いて、著者らは、腸内のビブリオコレラ誘導分泌に対する保護のために十分なレベルで経口免疫ウサギのウサギミルク内のコレラ毒素特異的抗体を検出することができた。Peri et al.13処理乳サンプルは、24,000 x gで2時間4°Cでの遠心分離により水真空システムで吸引によって収集された。本研究では、粘膜免疫(口腔内または気管内)に続く初乳、乳、気管支および腸分泌物中の抗RSV IgAを検出することができたが、静脈内免疫はできなかったのに対し、抗RSV IgGは予防接種経路13に関係なく、初乳、乳および血清中で検出された。
鼻腔内免疫術では、ウサギが麻酔の適切な平面にあることを確認し、大量のワクチンを一度に投与することを避けるために注意する必要があります。我々のグループからの以前の研究は、鼻腔内免疫の有効性が麻酔49の使用によって影響を受けたことを示している。具体的には、ケタミンとキシラジンの組み合わせによって誘発される深部麻酔は、鼻投与ワクチンの免疫原性の増加および溶液の鼻の保持の改善と相関した。これらのレベルは、アセプロマジンおよびブタフェノール49による沈下後に鼻腔内免疫化されたウサギにおける保持および免疫原性よりも有意に高かった。同様の知見は、マウス50,51における鼻腔内免疫に続くことも実証されている。さらに、我々の研究は、完全に目を覚ましていた動物に対する深い麻酔下での鼻内免疫化後の免疫原性の増加を実証し、アセプロマジンとイゾフルランの組み合わせで短い期間の麻酔を受けている動物に対して。深い期間と短い持続時間麻酔の間のIgG免疫原性のこの差は、42日の時点では有意であったが、56日の時点では有意ではなかった。免疫原性と保持の増加は、より深い麻酔から生じるかもしれないが、ウサギは回復するために少なくとも30分を必要とします。一方、ウサギは、イオブルラン誘発麻酔の持続時間が短い後に鼻ワクチンを受けてから5分以内に直立し、移動性であった。麻酔はヒトの鼻腔内免疫の臨床設定を模倣するのに理想的ではないかもしれないが、より短い持続時間麻酔(例えば、イゾフルラン)は、より長く、注射剤(例えばケタミン+キシラジン)を用いる深部麻酔に好ましいかもしれない。Gwinnら49で示されているように、動物モデルの使用は、多くの場合、安全な動物の取り扱いと効果的かつ一貫したワクチンの送達を可能にするために、セデレーションまたは麻酔の使用を必要とする。動物モデルにおけるワクチン投与による麻酔使用の潜在的な制限は、ワクチンに適切な免疫応答を誘導する動物の能力に及ぼす影響である。興味深いことに、文献の報告は、イオブルランが全身的な炎症反応を減衰させ、課題52に対する保護を提供し、酸化ストレスおよび炎症を軽減できることを示唆している。
ワクチンの損失の最小化と十分な鼻腔内送達に関して、我々のグループは、鼻腔内の溶液の保持を可能にし、ウサギが直ちに胸部精液に入れられ、ケージに戻された場合に、溶液が鼻孔から抜け出すことを防ぐために、鼻腔内ワクチンの各アリコートを投与した後、30秒の休息期間を推奨する。さらに、鼻腔の表面積によって粘膜吸収が制限されるので、鼻腔内免疫を確実にするために投与されるアリコートの量を制限することが重要である。大量投与された場合、溶液は鼻粘膜をバイパスし、吸入または胃の免疫をもたらす。当社グループは、鼻腔内容積が500μLの最大鼻腔を有する、鼻孔当たり100μLのアリコートを推奨しています。
この記事では、特に鼻腔内経路を介した粘膜ワクチンの送達に焦点を当てていますが、ウサギで実証されている粘膜と非経口の両方の免疫方法が複数あります。これらの追加の方法は、限定されないが、経口、皮下、筋肉内、および皮内を含む。したがって、収集および評価されるサンプルは、試験的目標および予防接種経路に基づいて変化する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、デューク大学の実験動物資源部門とその畜産チームが動物に提供する支援と細心の注意を払っていることを認めたいと考えています。さらに、著者たちは、原稿の音声およびビデオ部分に関する支援を病理学部門内のPhotoPathチームに認識したいと考えています。この研究は、Staats研究所の裁量的な研究資金によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intranasal Immunization | |||
| Anesthesia Machine/Vaporizer | Vet Equip | 901807 | |
| Hypodermic Needle (25 g) | Terumo | 07-806-7584 | |
| Isoflurane (250 mL Bottle) | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | 2-4% |
| Luer Lock Syringe (1 mL) | Air-Tite | 07-892-7410 | |
| Mucosal Vaccine | N/A | N/A | Experimental Vaccine |
| Nose Cone | McCulloch Medical | 07891-1097 | |
| Pipette Tips | VWR | 53503-290 | |
| Pipettor | VWR | 89079-962 | |
| PromAce (Acepromazine maleate) | Boehringer Ingelheim | 07-893-5734 | 1mg/kg IM |
| Puralube Sterile Ophthalmic Ointment | Dechra | 07-888-2572 | |
| Milk Collection | |||
| Alcohol Prep 2-ply | Covidien | 07-839-8871 | |
| Anesthesia Machine/Vaporizer | Vet Equip | 901807 | |
| Hypodermic Needles (25 g) | Terumo | 07-806-7584 | |
| Isoflurane (250 mL Bottle) | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | 2-4% |
| Luer Lock Syringe (1 mL) | Air-Tite | 07-892-7410 | |
| Non-Woven Sponge (4x4) | Covidien | 07-891-5815 | |
| Nose Cone | McCulloch Medical | 07891-1097 | |
| PromAce (Acepromazine Maleate) | Boehringer Ingelheim | 07-893-5734 | 1mg/kg IM |
| Puralube Sterile Ophthalmic Ointment | Dechra | 07-888-2572 | |
| Sterile Conical Vial (15 mL) | Falcon | 14-959-49B |
References
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