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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Intranasale Immunisierung und Milchsammlung in Studien zur mütterlichen Immunisierung bei neuseeländischen Weißen Kaninchen (Oryctolagus cuniculus)

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

Dieser Artikel beschreibt und demonstriert die Verabreichung von intranasalen Impfstoffen und die Sammlung von Milch von stillenden Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) als Mittel zur Beurteilung der Schleimhautimmunität in einem translational geeigneten Modell der mütterlichen Immunisierung.

Abstract

Aufgrund von Ähnlichkeiten in der Plazentation und dem Antikörpertransfer mit dem Menschen sind Kaninchen ein hervorragendes Modell für die mütterliche Immunisierung. Weitere Vorteile dieses Forschungsmodells sind die einfache Züchtung und Probenentnahme, die relativ kurze Tragzeit und die großen Wurfgrößen. Häufig bewertete Immunisierungswege umfassen subkutane, intramuskuläre, intranasale und intradermale. Die nichtterminale Probenentnahme zum chronologischen Nachweis der immunologischen Reaktionen auf diese Impfungen umfasst die Entnahme von Blut sowohl von Muttertieren als auch von Kits sowie von Milch von der Stillzeit. In diesem Artikel werden wir Techniken demonstrieren, die unser Labor in Studien zur mütterlichen Immunisierung bei neuseeländischen Weißen Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) verwendet hat, einschließlich intranatale Immunisierung und Milchsammlung.

Introduction

Studien zur mütterlichen Immunisierung und zum Antikörpertransfer sind aus zahlreichen Gründen von unschätzbarem Wert, da dies der erste Weg des Immunitätstransfers und des anschließenden Schutzes vor Krankheitserregern und Krankheiten bei Neugeborenen und Säuglingen ist. Die Immunisierung von Müttern hat das Potenzial, sowohl die Gesundheit von Müttern als auch von Säuglingen/ Kindern auf globaler Ebene positiv zu beeinflussen, indem die Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit bestimmten Krankheitserregern während dieser anfälligen Periode reduziert wird1. Das Hauptziel dieser Strategie ist es, die Spiegel spezifischer mütterlicher Antikörper während der Schwangerschaft zu erhöhen. Diese Antikörper können dann auf das Neugeborene und den Säugling in einem Niveau übertragen werden, das ausreicht, um vor Infektionen zu schützen, bis sein Immunsystem reif genug ist, um angemessen auf die Herausforderungen1,2,3zu reagieren. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass höhere Antikörpertiter bei der Geburt entweder mit einem vollständigen Schutz oder einem verzögerten Auftreten und einer reduzierten Schwere zahlreicher verschiedener Infektionskrankheiten beim Neugeborenen verbunden sind, einschließlich Tetanus, Pertussis, respiratorisches Synzytialvirus (RSV), Influenza und Streptokokkeninfektionen der Gruppe B1,2,3.

Beim Menschen werden mütterliche Antikörper passiv über die Plazenta übertragen und über das Stillen auch durch die Muttermilch übertragen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass HIV-spezifische IgA-Spiegel in der mutterstillenden Muttermilch von müttern, die mit dem Virus infiziert waren, mit einer reduzierten postnatalen Übertragung des Virus verbunden waren, was auf eine schützende Rolle für Muttermilch gegen HIV IgA4hindeutet. Studien an nichtmenschlichen Primaten haben gezeigt, dass eine Immunisierung gegen HIV eine signifikante Antikörperreaktion in der Muttermilch auslösen kann, und obwohl ähnliche Serum-IgG-Reaktionen nach systemischer versus Schleimhautimmunisierung induziert wurden, induzierte die Schleimhautimmunisierung eine signifikant höhere IgA-Reaktion in der Milch5,6.

Bei der Identifizierung eines translational geeigneten Tiermodells für diese Studien sollten die Plazentationsart und die Mechanismen des passiven Antikörpertransfers sowie der Transfer von Antikörpern durch die Muttermilch berücksichtigt werden. Es gibt drei Haupttypen der Plazentation bei Säugetieren, basierend auf den Gewebetypen und Schichten an der materno-fetalen Grenzfläche, einschließlich Hämochorial (Primaten, Nagetiere und Kaninchen), Endotheliochorial (Fleischfresser) und Epitheliochorial (Pferde, Schweine und Wiederkäuer). Die hämochoriale Plazenta ist der invasivste Typ, der eine direkte Kommunikation zwischen der mütterlichen Blutversorgung und dem Chorion oder der äußersten fetalen Membran ermöglicht. Basierend auf der Anzahl der Trophoblastenschichten gibt es mehrere Variationen der hämochorialen Plazentation, einschließlich der hämomonochorialen Plazenta bei Primaten, der hämodichorialen Plazenta bei Kaninchen und der hämotrichorialen Plazenta, die bei Ratten und Mäusen beobachtet wird7. Dieser direkte Kontakt zwischen mütterlicher Blutversorgung und Chorion ermöglicht den passiven Transfer von Antikörpern über die Plazenta während der Schwangerschaft. IgG ist die einzige Antikörperklasse, die die menschliche Plazenta8signifikant durchquert, während IgA die vorherrschende Klasse von Ig in der menschlichen Muttermilchist 9. Von den wissenschaftlich relevanten Modellen übertragen nur Primaten (einschließlich Menschen), Kaninchen und Meerschweinchen IgG in utero und IgA in der Milch10,11. Daher enthält das Kaninchenmodell Faktoren, die mit denen beim Menschen vergleichbar sind, die den transplazentaren Transfer von IgG und den Laktationstransfer von IgA steuern.

Neben der Funktion als außergewöhnliches Modell für die mütterliche Immunität und Impfstoffentwicklung machen Ähnlichkeiten zwischen dem Kaninchen und den menschlichen Nasenhöhlen sie zu einem geeigneten Modell für die intranasale Immunisierung. Das Volumen der Kaninchennasenhöhle ist dem Menschen ähnlicher als Nagetiermodelle, die auf der relativen Körpermasse basieren12. Darüber hinaus zeigten Casteleyn et al. 12, dass das nasenbegbundene lymphatische Gewebe (NALT) beim Kaninchen im Vergleich zu Nagetieren voluminöser ist. Die NALT befindet sich hauptsächlich am ventralen und ventromedialen Aspekt des ventralen Nasenfleisches und am lateralen und dorsolateralen Aspekt des Nasopharynxfleisches bei Kaninchen, während bei Nagetieren das lymphatische Gewebe nur entlang des ventralen Aspekts des nasopharyngealen meatus vorhanden ist12. Bei Kaninchen ähneln strukturell und lage der intraepithelialen und lamina propria lymphatischen Lymphozyten sowie der isolierten lymphatischen Follikel dem Menschen12.

Weitere Vorteile der Verwendung des Kaninchens als Modell für die mütterliche und mukosale Immunität sind ihre hohe Fruchtbarkeit und relativ kurze Tragzeit. Große aurikuläre Blutgefäße ermöglichen einen relativ einfachen Zugang zu großen Blutmengen für serielle Sammlungen. Eine Vielzahl von Schleimhautproben kann für antigenspezifische Antikörper-Response-Assays gesammelt werden, einschließlich Muttermilch13 (beim Stillen), Schleimhautsekreten oder Waschungen (z. B. oral14,15,16, bronchoalveoläre Lavage13,17,18,19, vaginal20,21,22) und Kot20,23,24,25. Milchproben können während der Stillzeit leicht gesammelt werden, um das Vorhandensein antigenspezifischer Antikörperreaktionen zu beurteilen. Obwohl nicht so reichlich wie bei Menschen und Mäusen, steht eine Vielzahl von experimentellen Reagenzien für kaninchenspezifische Studien und Assays zur Verfügung. In diesem Artikel werden wir die intranasale Immunisierung und Milchsammlung bei neuseeländischen Weißen Kaninchen (Oryctolagus cuniculus )beschreiben und demonstrieren.

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Protocol

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den IACUC-Richtlinien der Duke University genehmigt und durchgeführt.

HINWEIS: Benötigte Materialien sind in der Materialtabelle angegeben.

1. Kaninchensedierung und Anästhesie

  1. Sedieren Sie das weibliche Kaninchen (geschlechtsreif; ca. 5-30 Monate alt) durch intramuskuläre Verabreichung von Acepromazin (IM) in einer Dosis von 1 mg/kg. Je nach Größe des Tieres verwenden Sie eine 1 oder 3 ml Spritze mit einer 25 G Nadel. Die Epaxialmuskulatur ist die bevorzugte Stelle der intramuskulären Injektion.
    HINWEIS: Acepromazin kann auch subkutan verabreicht werden, aber IM wird vom Labor bevorzugt, da es schneller wirkt und die Inzidenz von Hautläsionen reduziert.
  2. Warten Sie 10-15 Minuten, damit das Acepromazin wirksam wird.
  3. Betäuben Sie das Kaninchen mit Isofluran, indem Sie den verbundenen Nasenkegel über die Nase des Tieres legen. Stellen Sie den Vaporizer auf bis zu 4% Isofluran in Kombination mit bis zu 4 Litern / Minute Sauerstoff ein. Kaninchen haben eine hohe Abneigung gegen Isofluran, so dass bei der Maskierung des Tieres eine angemessene Zurückhaltung erforderlich ist.
  4. Nach der vollständigen Betäubung, wie durch die Pinna, das Pedal und / oder den palpebralen Reflex beurteilt, tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf jedes Auge auf, um das Austrocknen der Augen und nachfolgende Hornhautgeschwüre zu verhindern.
  5. Überwachen Sie kontinuierlich die Reflexe und die Atmung während der Anästhesie und reduzieren Sie die Isofluranrate auf 1-2%, sobald eine angemessene Anästhesieebene erreicht wurde.

2. Intranasale Immunisierung

  1. Bereiten Sie die Impflösung vor dem Umgang mit Tieren vor.
  2. Sedieren Sie das Kaninchen wie oben beschrieben.
  3. Sobald das Labormitglied bereit ist, den Impfstoff zu verabreichen und sich das Kaninchen in einer angemessenen Anästhesieebene befindet, schalten Sie das Isofluran und den Sauerstoff aus und entfernen Sie den Nasenkegel.
  4. Legen Sie das Kaninchen in die dorsale Liege und stützen Sie Hals und Kopf in einem Winkel von etwa 45 °, der einen einfachen Zugang und die Visualisierung beider Nares durch das Labormitglied ermöglicht, das den Impfstoff verabreicht.
  5. Laden Sie die Pipette mit nicht mehr als 100 μL der Impfstofflösung und verabreichen Sie die Lösung schnell in jedes Nasenloch. Die Pipette sollte in einem Winkel von etwa 45° gehalten werden, der zum medialen Aspekt des Nasengangs geneigt ist.
    HINWEIS: Das Ziel der Immunisierung ist es, dass die Lösung die Schleimhaut der Nares berührt, daher sollte die Spitze nicht in den Nares platziert werden, da dies zu Abrieb oder Reizung des Schleimhautgewebes führen und möglicherweise die Immunogenität des nasal verabreichten Impfstoffs beeinflussen kann. Der Impfstoff sollte schnell verabreicht und auf die gleiche Weise in der anderen Nare durchgeführt werden.
  6. Nach der Verabreichung in beiden Nasengängen halten Sie das Kaninchen 30 Sekunden lang in dorsaler Liege, um das Austreten der Impfstofflösung zu minimieren.
    HINWEIS: Das Labor verabreicht in der Regel nicht mehr als 100 μL pro Nasenloch gleichzeitig. Wenn ein größeres Volumen mit einer maximalen Gesamtmenge von 500 μL verabreicht werden soll, kann der Impfstoff in 100 μL Aliquoten mit einer 30-sekundenigen Ruhezeit zwischen den Impfungen und zusätzlichen Impfstoffverabreichungen wiederholt werden, wobei 30 Sekunden Ruhe zwischen jeder Verabreichung erfolgen, bis das gesamte Impfstoffvolumen abgegeben wird.
  7. Legen Sie das Kaninchen nach der Immunisierung zur Genesung auf das Ventrum und überwachen Sie das Tier genau, bis es die sternale Liegehaltung aufrechterhalten kann.

3. Milchabholung

  1. Sedieren Sie das stillende Kaninchen wie oben beschrieben.
  2. Reinigen Sie die Haut über der Randvene des Ohres mit dem Alkoholtupfer / -tuch.
  3. Mit einer 1 ml Spritze und einer 25 g Nadel ca. 1-2 IE Oxytocin intravenös über die marginale Ohrvene verabreichen, um eine Milchentlassung zu induzieren.
    HINWEIS: Aufgrund der Entspannung der glatten Muskulatur ist es üblich, dass das Kaninchen nach der Verabreichung von Oxytocin uriniert oder defäkiert.
  4. Nach der Verabreichung von Oxytocin mit dem Stück Gaze Druck auf die Injektionsstelle ausüben.
  5. Während Sie die Anästhesiemaske über der Nase des Kaninchens halten, stützen Sie das Kaninchen auf seine Hinterhand.
    HINWEIS: Die Milchsammlung kann auch mit dem Tier in seitlicher Liege durchgeführt werden, aber das Labor stellt fest, dass die Sammlung einfacher ist, wenn das Kaninchen auf seinem Hintern gestützt wird, wobei ein Assistent das Kaninchen mit der Anästhesiemaske aufrecht hält.
  6. Öffnen Sie das sterile Röhrchen, um sich auf die Milchsammlung vorzubereiten, und lokalisieren Sie das Brustgewebe und die zugehörigen Zitzen. Die Zitzen sind typischerweise von nassem Fell aus der jüngsten Stillzeit umgeben, und das Brustgewebe ist leicht tastbar, wenn es voller Milch ist.
  7. Greifen Sie das Brustgewebe, das mit einer Zitze zwischen Daumen und Zeigefinger verbunden ist, und drücken Sie einen sanften, massierenden Druck auf das Drüsengewebe in Richtung der Zitze aus. Legen Sie das Auffangrohr über die Zitze, um die abgepumpte Milch zu sammeln.
    HINWEIS: Es kann manchmal mehrere Minuten dauern, bis das Oxytocin wirksam ist, und die Milchproduktion scheint zwischen den Brustdrüsen zu variieren. Wenn die Milchexpression nicht erfolgreich ist, warten Sie einige Minuten oder drehen Sie sich zu den zusätzlichen Brustdrüsen. Milch aus allen Zitzen kann in derselben Durchstechflasche gesammelt werden. Typischerweise können mehrere Milliliter Milch leicht von einem stillenden Doe gesammelt werden.
  8. Schalten Sie nach der Milchsammlung das Isofluran und den Sauerstoff aus und lassen Sie das Kaninchen sich erholen, während es engmaschig überwacht wird, bis das Tier in der Lage ist, die sternale Liege zu erhalten.

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Representative Results

Ein Überblick über ein typisches design einer mütterlichen intranasalen Immunisierungsstudie ist in Abbildung 1dargestellt, die die Immunisierungen, Züchtung, Anzündung, Laktation und Antikörpertransfer umfasst. Obwohl nicht dargestellt, sollte Blut vor der ersten Immunisierung für Baseline-Messungen und während des restlichen Verlaufs der Studie in regelmäßigen Abständen entnommen werden. Blut wird leicht über die zentrale Ohrarterie mit leichter Sedierung und einem topischen Analgetikum (z. B. Lidocain 2,5% und Prilocain 2,5% Creme) gewonnen. Das Vorhandensein von antigenspezifischen IgG-Spiegeln kann in diesen Proben gemessen werden. Weibliche Kaninchen werden über den intranasalen Weg immunisiert, wie im Protokoll beschrieben und im Video demonstriert. Abhängig von der Studie kann der Impfstoff einen Schub erfordern oder über einen zusätzlichen Weg (z. B. intramuskulär oder subkutan) verabreicht werden. Nach Studienbeginn werden Kaninchen gezüchtet; Wir ziehen es vor, bewährte Züchter von Anbietern zu kaufen, um eine höhere Schwangerschaftsrate für diese Studien zu gewährleisten. Abhängig vom Impfzeitplan können Kaninchen während der Schwangerschaft zusätzliche Impfungen erhalten. Antigenspezifisches IgG wird transplazent auf die Kits übertragen, und etwa 30-32 Tage nach der Zucht entzündet sich die Trächtige. Wir empfehlen, die Handhabung von Kits für die ersten Tage zu begrenzen, um die Ablehnung durch die Does zu minimieren. Aus den Kits können Blutproben entnommen werden, um antigenspezifische IgG-Spiegel zu beurteilen, die transplazent übertragen wurden (Abbildung 3). Zusätzlich zu einer Vielzahl von Nährstoffen erhalten Kits IgA vom stillenden Doe während der Stillzeit. Kits werden normalerweise nach 4-8 Wochen entsät, aber vor dem Absetzen kann Milch leicht aus der Stillzeit gesammelt werden, wie im Video gezeigt. Die gesammelten Milchproben können dann zum Nachweis von Gesamt- und antigenspezifischen IgA-Spiegeln verarbeitet werden (Abbildung 4). Abhängig von der Studie können Impfstoffe (+/- Boosts) an die Kits verabreicht werden, und serienmäßige Blutproben können in einem sehr frühen Alter mit der lateralen Vena saphena aus den Kits entnommen werden.

Bei mütterlichen Studien ist die frühstmögliche Feststellung der Schwangerschaft hilfreich für das Studiendesign und um sicherzustellen, dass das Refe nicht rebred werden muss. Progesteronmessungen können als Mittel zur Erkennung einer Schwangerschaft verwendet werden. Wie in Abbildung 2gezeigt, können bei trächtigen Kaninchen im Vergleich zu nicht trächtigen Kaninchen erhöhte Progesteronspiegel nachgewiesen werden, selbst nachdem die Paarung durch einen Bock für alle Bestände bestätigt wurde. Es gibt zusätzliche Methoden zur Schwangerschaftserkennung, einschließlich manueller Palpation, Ultraschall und Röntgenaufnahmen; Diese erfordern jedoch eine gut ausgebildete persönliche und angemessene Ausrüstung.

Antigenspezifisches IgG, das transplazent in utero übertragen wurde, kann im Serum von Kits gemessen werden. Blut kann aus einer kleinen Anzahl von Kits zum oder in der Nähe der Geburt entnommen werden, um frühe antigenspezifische Antikörperspiegel zu beurteilen, aber die serielle Blutentnahme ist technisch viel einfacher, da die Kits altern und die Größe zunehmen. Wie in Abbildung 3dargestellt, können die Serumspiegel von antigenspezifischem IgG in den Kits mittels ELISA gemessen und mit den mütterlichen Spiegeln verglichen werden. Mütterlich übertragene IgG-Spiegel neigen dazu, bei der Geburt höher zu sein und im Laufe der Zeit abzunehmen.

Als eine Art Schleimhautprobe kann Milch gesammelt und verarbeitet werden, um den Gesamt- oder Antigen-spezifischen Antikörperspiegel zu messen. Wie in Abbildung 4gezeigt, macht IgA einen signifikanten Teil der gesamten Antikörperspiegel in der Muttermilch aus, die über die Laktation auf die Kits übertragen werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Muttermilch-IgA im Vergleich zu IgG ein etwas höheres ELISA-Signal (Relative Light Units, RLU) erzeugt, und sowohl IgA als auch IgG erzeugen ein Signal, das viel höher ist als das Signal für IgM. Diese Ergebnisse stehen im Einvernehmen mit den Ergebnissen anderer, die darauf hindeuten, dass Kaninchenmilch etwa 4,5 mg / ml IgA, 2,4 mg / ml IgG und 0,1 mg / ml IgM26,27 enthält.

Figure 1
Abbildung 1. Stichprobenzeitplan für ein mütterliches intranatalen Immunisierungsstudiendesign in einem Kaninchenmodell (Oryctolagus cuniculus). Weibliche Kaninchen werden über den intranasalen Weg immunisiert, wie im Protokoll beschrieben und im Video demonstriert. Abhängig von der Studie kann der Impfstoff einen Schub erfordern oder auf einem zusätzlichen Weg (z. B. intramuskulär oder subkutan) verabreicht werden. Kaninchen werden dann gezüchtet. Antigenspezifisches IgG wird transplazent auf die Kits übertragen, und etwa 30-32 Tage nach der Zucht entzündet sich die Trächtige. IgA wird während der Stillzeit vom stillenden Doe an die Kits weitergegeben. Vor dem Absetzen kann Milch leicht aus den stillenden Does gesammelt werden, um den Gesamt- und antigenspezifischen IgA-Spiegel zu beurteilen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Progesteronspiegel bei trächtigen und nicht trächtigen Kaninchen 3 Wochen nach der Zucht. Blut wurde von Kaninchen in 3 Wochen nach der Zucht gesammelt. Kaninchen wurden entweder schwanger oder nicht trächtig bestätigt, basierend auf der Fähigkeit, einen Wurf 30-32 Tage nach der Zucht zu entfachen. Der Serumprogesteronspiegel wurde durch das Michigan State University Veterinary Diagnostic Laboratory mit einem chemilumineszenz-Immunoassay (CLIA) mit einem Immunoassay-System (z. B. Siemens Healthineers IMMULITE 2000) gemessen. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar, und die Stichprobengröße bestand aus 4-6 Kaninchen pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. Antigenspezifische IgG-Spiegel in Kits (relativ zu mütterlichen Spiegeln) bei der Geburt und im Alter von 3 Wochen nach einer Reihe von mütterlichen Impfungen. Blut wurde aus den Ents und Kits kurz nach dem Anzünden und im Alter von 3 Wochen gesammelt. Antigenspezifische IgG-Spiegel im Serum wurden mit einem fluoreszierenden ELISA nachgewiesen, wie zuvor beschrieben28. Antigenspezifisches IgG wird als Verhältnis der im Kit-Serum und im mütterlichen Serum nachgewiesenen Werte dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4. Ein Vergleich der IgA-, IgM- und IgG-Spiegel in Kaninchenmilch. Kaninchenmilch wurde wie im Video beschrieben und demonstriert gesammelt. Die Milch wurde durch eine lange Zentrifugation (13.000 x g für 4,5 Stunden bei 4 °C) verarbeitet und die klare Mittelschicht nach der Verarbeitung isoliert. Die Gesamt-IgA-, IgG- und IgM-Werte wurden in dieser klaren Schicht durch fluoreszierenden ELISA gemessen, wie zuvor beschrieben28,mit der Ausnahme, dass Platten mit polyklonalem Anti-IgA, Anti-IgG oder Anti-IgM beschichtet wurden, um Gesamtkaninchen-IgA, IgG oder IgM zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Obwohl im obigen Protokoll nicht beschrieben, ist eine erfolgreiche Zucht der Kaninchen für dieses mütterliche Modell und für die Milchsammlung notwendig. Kaninchen können leicht durch Live-Deckung in einer Forschungsumgebung gezüchtet werden. Es wird empfohlen, dass sie zur Zucht in den Käfig des Bocks überführt werden, da dies territorial und aggressiv sein kann, wenn sie mit dem Bock in ihrem eigenen Käfig gehalten werden. Wenn Weibchen nach 15 Minuten nicht empfänglich sind (wie durch Weglaufen oder Vokalisieren angezeigt), sollte das Reiz wieder in seinen eigenen Käfig gebracht werden. Es gibt mehrere informative Videos und Tutorials zur Kaninchenzucht, die online beobachtet werden können29, aber nach der Zucht fällt das Männchen typischerweise um und kann lauten. Sobald dies beobachtet wird, kann das Resi in seinen Käfig zurückgebracht werden. Ein Bock kann 2-3 mal am Tag ohne Abnahme der Spermienzahl30 brüten. In unserem IACUC-zugelassenen Protokoll sind Böcke auf die Zucht von 10-12 Pro Woche beschränkt und werden mindestens zwei Ruhetage pro Woche zur Verfügung gestellt, da Quellen angeben, dass ein einzelner Bock normalerweise ausreicht, um 10-15zu bedienen 31. Unsere Gruppe schlägt vor, bewährte Züchter vom Anbieter zu kaufen, um die Zuchterfolgsrate zu verbessern. Da Kaninchen induzierte Eigänger sind und der Eisprung typischerweise 10-13 Stunden nach derKopulation 31auftritt, haben wir eine höhere Schwangerschaftsrate bei Tun erlebt, die morgens und dann wieder nachmittags oder zweimal innerhalb dieses 10-13-Stunden-Fensters gezüchtet werden (beobachteter Anstieg von 75% auf 95% Erfolgsrate, unveröffentlicht). Basierend auf der Literatur variieren die typischen Bruterfolgsraten zwischen 57-100%32,33,34,35,36,37,38,39,40und Wurfgrößen durchschnittlich etwa 7-9 Kits31.

Die Bestimmung der Schwangerschaft so früh wie möglich ist in mütterlichen Studien hilfreich, um zu bestätigen, dass das Reze nicht aus der Studie entfernt oder entfernt werden muss. Optionen für die Schwangerschaftserkennung umfassen Palpation (bereits ab 14 Tagen)31, Ultraschall (bereits 5-9 Tage)40, Röntgenaufnahmen (bereits am Tag 11)31, Gewichtszunahme und molekulare Techniken, wie Messungen der Insulinwachstumsfaktoren41 (IGF) und Progesteron34,37,38,42,43. Frühere Arbeiten haben signifikante Erhöhungen der IGF-II-Spiegel bei trächtigen Kaninchen im Vergleich zu Werten bei nicht trächtigen Kaninchen gezeigt41. In unseren Händen konnten wir jedoch keinen Unterschied in den IGF-II-Spiegeln zwischen trächtigen und nicht trächtigen Kaninchen feststellen (unveröffentlicht). Da ausreichende Progesteronspiegel für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft bei Kaninchen erforderlich sind37,44, haben mehrere Studien den Progesteronspiegel bei trächtigen Kaninchen untersucht und erhöhte Spiegel im Vergleich zu nicht trächtigen Kaninchen gezeigt, insbesondere während der Organogenese um die Mitte der Schwangerschaft34,43,44. Unsere Gruppe war nicht in der Lage, Unterschiede in den Progesteronspiegeln mit einem ELISA zwischen trächtigen und nicht trächtigen Kaninchen zu erkennen, aber vorläufige Ergebnisse mit einem automatisierten Chemilumineszenz-Assay am Michigan State University Veterinary Diagnostic Laboratory deuten auf erhöhte Progesteronspiegel bei trächtigen Kaninchen im Vergleich zu nicht trächtigen Kaninchen hin, selbst nach der Paarung durch einen Bock wurden für alle bewerteten Bestände bestätigt (Abbildung 2).

Die Laktierung kann täglich etwa 250 ml oder 60 ml/kg Milch produzieren45 , 46,was große Mengen für experimentelle Assays zur Beurteilung der Gesamt- und antigenspezifischen Antikörperreaktionen / -konzentrationen ermöglicht. Kaninchenmilch enthält einen hohen Gehalt an Fett und Protein, enthält 2 und 3 mal mehr konzentrierte Mengen an Fett und Protein im Vergleich zu Kuh- und Sauenmilch, jeweils45,47. Aufgrund des hohen Fettgehalts in der Milch erfordern die Proben je nach durchzuführenden Assays eine signifikante Verarbeitung. Nach der Zentrifugation der Milchprobe werden drei verschiedene Schichten getrennt, darunter die Zellen innerhalb der unteren Schicht, die klare Zwischenschicht mit den Immunglobulinen und das Fett in der oberen Schicht48. Immunglobuline innerhalb der klaren Zwischenschicht sind in hohen Konzentrationen im Kolostrum und in der Milch vorhanden und bestehen hauptsächlich aus IgA, IgG und IgM (Abbildung 4). Obwohl Milchproben leicht von Hand gesammelt werden können, und dies ist unsere bevorzugte Technik im Labor, wurden Vakuumsysteme auch in der Literatur13,46,48beschrieben. Yoshiyama et al.48 sammelten Milchproben unter Unterdruck und beschrieben eine lange Zentrifugation (15.000 x g für 4 Stunden) zur Trennung der Milchschichten, bevor die klare Zwischenschicht durch eine Sepharose 4B-Säule zur Immunglobulinentfernung passiert wurde. Mit dieser Methode konnten die Autoren Choleratoxin-spezifische Antikörper in der Kaninchenmilch von oral immunisierten Kaninchen in ausreichenden Konzentrationen zum Schutz vor Vibrio Cholerae-induzierterSekretion im Darm nachweisen48. Peri et al.13 verarbeitete Milchproben, die durch Aspiration mit einem Wasservakuumsystem durch Zentrifugation bei 4 °C für 2 Stunden bei 24.000 x g gesammelt wurden. In dieser Studie konnten die Autoren Anti-RSV-IgA im Kolostrum, in der Milch sowie in bronchialem und intestinalen Sekreten nach Schleimhautimmunisierung (oral oder intratracheal), aber nicht intravenöser Immunisierung nachweisen, während Anti-RSV-IgG in Kolostrum, Milch und Serum unabhängig vom Immunisierungsweg nachgewiesen wurde13.

Während des intranasalen Immunisierungsverfahrens sollte darauf geachtet werden, dass sich das Kaninchen in einer angemessenen Anästhesieebene befindet und dass keine großen Mengen Impfstoff auf einmal verabreicht werden. Frühere Arbeiten aus unserer Gruppe haben gezeigt, dass die Wirksamkeit der intranasalen Immunisierung durch den Einsatz von Anästhesie beeinflusst wurde49. Insbesondere die durch die Kombination von Ketamin und Xylazin induzierte Tiefenanästhesie korrelierte mit einer erhöhten Immunogenität des nasal verabreichten Impfstoffs und einer verbesserten nasalen Retention der Lösung. Diese Werte waren signifikant höher als Retention und Immunogenität bei Kaninchen, die nach Sedierung mit Acepromazin und Butorphanol intranasal immunisiert wurden49. Ähnliche Befunde wurden auch nach intranataner Immunisierung bei Mäusen50,51nachgewiesen. Darüber hinaus zeigte unsere Arbeit eine erhöhte Immunogenität nach intranataner Immunisierung unter Tiefenanästhesie über Tiere, die vollständig wach waren, und über Tiere, die sich einer kürzeren Anästhesie mit einer Kombination aus Acepromazin und Isofluran unterzogen. Dieser Unterschied in der IgG-Immunogenität zwischen tiefer und kürzerer Anästhesie war zum 42-Tage-Zeitpunkt signifikant, aber nicht zum 56-Tage-Zeitpunkt. Obwohl eine erhöhte Immunogenität und Retention aus der tieferen Anästhesie resultieren kann, benötigten Kaninchen mindestens 30 Minuten, um sich zu erholen; während Kaninchen innerhalb von 5 Minuten nach Erhalt des Nasenimpfstoffs nach der kürzeren Dauer der Isofluran-induzierten Anästhesie aufrecht und mobil waren. Obwohl die Anästhesie möglicherweise nicht ideal ist, um das klinische Setting für die intranasale Immunisierung beim Menschen nachzuahmen, kann eine kürzere Anästhesie (z. B. Isofluran) einer längeren, tiefen Anästhesie mit injizierbaren Mitteln (z. B. Ketamin + Xylazin) vorgezogen werden. Die Verwendung eines Tiermodells, wie in Gwinn et al.49gezeigt, erfordert oft die Verwendung von Sedierung oder Anästhesie, um einen sicheren Umgang mit Tieren und eine effektive und konsistente Impfstoffabgabe zu ermöglichen. Eine mögliche Einschränkung für die Anästhesie bei der Verabreichung von Impfstoffen in Tiermodellen ist ihre Wirkung auf die Fähigkeit des Tieres, eine angemessene Immunantwort auf den Impfstoff zu induzieren. Interessanterweise deuten Berichte in der Literatur darauf hin, dass Isofluran systemische Entzündungsreaktionen abschwächen kann, Schutz vor Herausforderungenbietet 52 und oxidativen Stress und Entzündungen reduziert53.

In Bezug auf die Minimierung des Impfstoffverlustes und eine angemessene intranasale Verabreichung empfiehlt unsere Gruppe eine Ruhezeit von 30 Sekunden nach Verabreichung jedes Aliquots des intranasalen Impfstoffs, um die Retention der Lösung in der Nasenhöhle zu ermöglichen und zu verhindern, dass die Lösung aus den Nasenlöchern ausstritt, wenn das Kaninchen sofort in die Brustlage gelegt und in den Käfig zurückgebracht wird. Darüber hinaus ist es wichtig, das Volumen des verabreichten Aliquots zu begrenzen, um eine intranasale Immunisierung zu gewährleisten, da die Schleimhautabsorption durch die Oberfläche des Nasengangs begrenzt ist. Wenn ein großes Volumen verabreicht wird, kann die Lösung die Nasenschleimhaut umgehen und zu einer Inhalations- oder Magenimmunisierung führen. Unsere Gruppe empfiehlt Aliquoten von 100 μL pro Nasenloch mit einem maximalen intranasalen Volumen von 500 μL.

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verabreichung von Schleimhautimpfstoffen, insbesondere über den intranasalen Weg, aber es gibt mehrere Immunisierungsmethoden, sowohl Schleimhaut- als auch parenterale, die bei Kaninchen nachgewiesen wurden. Diese zusätzlichen Methoden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, orale, subkutane, intramuskuläre und intradermale. Daher variieren die zu sammelnden und zu bewertenden Proben je nach den experimentellen Zielen und dem Weg der Immunisierung.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Die Autoren möchten der Abteilung für Labortierressourcen an der Duke University und ihrem Haltungsteam für ihre Unterstützung und große Sorgfalt für die Tiere danken. Darüber hinaus möchten die Autoren das PhotoPath-Team innerhalb der Abteilung für Pathologie für ihre Unterstützung bei den Audio- und Videoabschnitten des Manuskripts anerkennen. Diese Arbeit wurde durch diskretionäre Forschungsmittel des Staatslabors unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 173 Mütterliche Immunisierung Intranasale Immunisierung Schleimhautimmunisierung Milchsammlung Kaninchenmilch Oryctolagus cuniculus.
Intranasale Immunisierung und Milchsammlung in Studien zur mütterlichen Immunisierung bei neuseeländischen Weißen Kaninchen (<em>Oryctolagus cuniculus</em>)
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Landon, C. D., Dancourt, G., Shing,… More

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

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