Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intranasal immunisering och mjölksamling i studier av moderns immunisering i Nya Zeeland Vita Kaniner (Oryctolagus cuniculus)

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

Denna artikel beskriver och visar administrering av intranasala vacciner och insamling av mjölk från lakterande kaniner (Oryctolagus cuniculus) som ett sätt att bedöma slemhinnor immunitet i en översättnings lämpligt modell av moderns immunisering.

Abstract

På grund av likheter i placentation och antikroppsöverföring med människor är kaniner en utmärkt modell av moderns immunisering. Ytterligare fördelar med denna forskningsmodell är enkel avel och provsamling, relativt kort graviditetsperiod och stora kullstorlekar. Allmänt bedömda vägar för immunisering inkluderar subkutan, intramuskulär, intranasal och intradermal. Icke-terminal prov insamling för kronologisk detektion av immunologiska svar på dessa immuniseringar inkluderar insamling av blod, från både dammar och satser, och mjölk från lakterande gör. I den här artikeln kommer vi att demonstrera tekniker som vårt labb har använt i studier av moderns immunisering hos nya zeeland vita kaniner (Oryctolagus cuniculus), inklusive intranasal immunisering och mjölksamling.

Introduction

Studier av moderns immunisering och antikroppsöverföring är ovärderliga av många skäl, eftersom detta är den första vägen för immunitetsöverföring och efterföljande skydd mot patogener och sjukdomar hos nyfödda och spädbarn. Moderns immunisering har potential att positivt påverka både mödra- och spädbarns-/barnhälsan på global nivå genom att minska sjuklighet och dödlighet i samband med vissa patogener under denna sårbara period1. Huvudsyftet med denna strategi är att öka nivåerna av specifika moderns antikroppar under hela graviditeten. Dessa antikroppar kan sedan överföras till nyfödda och spädbarn på nivåer som är tillräckliga för att skydda mot infektioner tills deras immunsystem är tillräckligt moget för att på ett adekvat sättsvara på utmaningar 1,2,3. Tidigare arbete har visat att högre antikroppstitrar vid födseln är förknippade med antingen fullständigt skydd eller en fördröjd inset och minskad svårighetsgrad av många olika infektionssjukdomar hos nyfödda, inklusive stelkramp, kikhosta, respiratoriskt syncytial virus (RSV), influensa och grupp B streptokockinfektioner1,2,3.

Hos människor överförs moderns antikroppar passivt över moderkakan och överförs också genom bröstmjölken via omvårdnad. Tidigare arbete har visat att HIV-specifika IgA nivåer i human bröstmjölk från mödrar smittade med viruset var associerade med minskad postnatala överföring av viruset, vilket tyder på en skyddande roll för bröstmjölk anti-HIV IgA4. Studier på icke-mänskliga primater har visat att immunisering mot HIV kan inducera ett signifikant antikroppssvar i bröstmjölken, och även om liknande serum IgG-svar inducerades efter systemisk kontra slemhinna immunisering, inducerade slemhinna immunisering ett betydligt högre IgA-svar inommjölken 5,6.

Vid fastställandet av en översättningsanpassad djurmodell för dessa studier bör hänsyn tas till placentationstypen och mekanismerna för passiv antikroppsöverföring samt överföringen av antikroppar genom bröstmjölk. Det finns tre huvudtyper av placentation hos däggdjur baserade på vävnadstyperna och lagren vid materno-fetala gränssnittet, inklusive hemokorial (primater, gnagare och kaniner), endotheliochorial (köttätare) och epitheliochorial (hästar, grisar och idisslare). Den hemochorial moderkakan är den mest invasiva typen, vilket möjliggör direkt kommunikation mellan moderns blodtillförsel och chorion, eller det yttersta fetala membranet. Baserat på antalet trophoblast lager, det finns flera variationer av hemochorial placentation, inklusive hemomonochorial moderkakan finns i primater, hemodichorial moderkakan hos kaniner och hemotrichorial moderkakan observeras hos råttor och möss7. Denna direkta kontakt mellan moderns blodtillförsel och chorion möjliggör passiv överföring av antikroppar över moderkakan under dräktigheten. IgG är den enda antikroppsklassen som avsevärt korsar den mänskliga placentan8, medan IgA är den dominerande klassen av Ig som finns i bröstmjölk9. Av de vetenskapligt relevanta modellerna överför endast primater (inklusive människor), kaniner och marsvin IgG in utero och IgA i mjölken10,11. Därför innehåller kaninmodellen faktorer som är jämförbara med de hos människor som kontrollerar transplacental överföring av IgG och laktationell överföring av IgA.

Förutom att fungera som en exceptionell modell för moderns immunitet och vaccinutveckling, gör likheter mellan kaninen och mänskliga näshålor dem till en lämplig modell för intranasal immunisering. Volymen av kaninen nasala hålighet är mer lik människor än gnagare modeller baserade på relativ kroppsmassa12. Dessutom visade Casteleyn et al. 12 att den nasala associerade lymfoida vävnaden (NALT) är mer voluminös hos kaninen jämfört med gnagare. NALT ligger främst vid ventral och ventromedial aspekten av ventrala nasala meatus och vid den laterala och dorsolateral aspekten av nasopharyngeal meatus hos kaniner, medan lymfoida vävnaden hos gnagare endast finns längs den ventrala aspekten av nasopharyngeal meatus12. Hos kaniner liknar strukturen och platsen för intraepitheliala och lamina propria lymfocyter, liksom de isolerade lymfoida folliklarna, människor12.

Ytterligare fördelar med att använda kaninen som modell för moderns och slemhinnor immunitet inkluderar deras höga fecundity och relativt kort graviditetsperiod. Stora auricular blodkärl möjliggör relativt enkel tillgång till stora volymer blod för seriella samlingar. En mängd slemhinnor kan samlas in för antigenspecifika antikroppssvarsanalyser. inklusive bröstmjölk13 (vid laktation), slemhinnor eller tvättar (t.ex. oral14,15,16,bronkolveolär lavage13,17,18,19,vaginal20,21,22) och avföring20,23,24,25. Mjölkprover kan enkelt samlas in under amning för att bedöma förekomsten av antigenspecifika antikroppssvar. Även om det inte är lika rikligt som för människor och möss, finns ett brett utbud av experimentella reagenser tillgängliga för kaninspecifika studier och analyser. I den här artikeln kommer vi att beskriva och demonstrera intranasal immunisering och mjölksamling i Nya Zeeland Vita kaniner (Oryctolagus cuniculus).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer godkändes och utfördes i enlighet med Duke University IACUC:s policyer.

OBS: Material som behövs finns i materialförteckningen.

1. Kanin sedering och anestesi

  1. Sedera den kvinnliga kaninen (sexuellt mogen; cirka 5-30 månader gammal) genom att administrera acepromazin intramuskulärt (IM) med en dos av 1 mg/kg. Beroende på djurets storlek, använd en 1 eller 3 ml spruta med en 25 G nål. Epaxial muskler är den föredragna platsen för intramuskulär injektion.
    OBS: Acepromazin kan också administreras subkutant, men IM föredras av labbet, eftersom det verkar snabbare och minskar förekomsten av hudskador.
  2. Vänta 10-15 minuter för att låta acepromazinet träda i kraft.
  3. Söv kaninen med isofluran genom att placera den anslutna näskonen över djurets näsa. Justera förångaren till upp till 4% isofluran i kombination med upp till 4 liter/minut syre. Kaniner har en hög aversion mot isofluran, så tillräcklig återhållsamhet är nödvändig när man maskerar djuret.
  4. När den är helt bedövad, enligt bedömning av pinna, pedal och/eller palpebral reflex, applicera oftalmiskt smörjmedel på varje öga för att förhindra torkning av ögonen och efterföljande hornhinnans ulceration.
  5. Övervaka kontinuerligt reflexer och andning under anestesi och minska isofluranhastigheten till 1-2% när ett adekvat anestesiplan har nåtts.

2. Intranasal immunisering

  1. Förbered immuniseringslösningen före djurhantering.
  2. Sedera kaninen enligt beskrivningen ovan.
  3. När labbmedlemmen är redo att administrera vaccinet och kaninen är i ett tillräckligt anestesiplan, stäng av isofluran och syre och ta bort näskonen.
  4. Placera kaninen i dorsal kumbency och prop nacke och huvud i en ungefärlig 45° vinkel som möjliggör enkel åtkomst och visualisering av båda nares av labbmedlemmen som administrerar vaccinet.
  5. Ladda pipetten med högst 100 μL vaccinlösningen och administrera snabbt lösningen i varje näsborre. Pipetten ska hållas i ungefär 45° vinkel, vinklad mot den mediala aspekten av näspassagen.
    OBS: Målet med immunisering är att lösningen ska kontakta narernas slemhinnor, så spetsen bör inte placeras inom narerna, eftersom detta kan leda till nötning eller irritation i slemhinnorna och potentiellt påverka immunogeniciteten hos det nasally-administrerade vaccinet. Vaccinet ska administreras snabbt och göras på samma sätt i den andra nare.
  6. Efter administrering i båda näspassagen, behåll kaninen i dorsal recumbency i 30 sekunder för att minimera läckage av vaccinlösningen.
    OBS: Labbet administrerar vanligtvis inte mer än 100 μL per näsborre åt gången. Om en större volym ska administreras, med en maximal totalsumma på 500 μL, kan vaccinet ges i 100 μL alikvoter med en 30 sekunders viloperiod mellan immuniseringar och ytterligare administreringar av vaccin som upprepas, med 30 sekunders vila mellan varje administrering, tills den totala vaccinvolymen levereras.
  7. Efter immunisering, placera kaninen på ventrumet för återhämtning och övervaka djuret noggrant tills det kan upprätthålla sternal försörjning.

3. Mjölkuppsamling

  1. Sedera den lakterande kaninen enligt beskrivningen ovan.
  2. Rengör huden över den marginella öron venen med alkoholpinnen/torkan.
  3. Använd en 1 ml spruta och 25 g nål, administrera cirka 1-2 IE oxytocin intravenöst via den marginella öronvenen för att inducera mjölksvikning.
    OBS: På grund av den smidiga muskelavslappningen är det vanligt att kaninen urinerar eller defekerar efter administrering av oxytocin.
  4. Efter administrering av oxytocin, tryck på injektionsstället med gasväven.
  5. Medan du upprätthåller anestesimasken över kaninens näsa, prop kaninen på bakkvartsparterna.
    OBS: Mjölksamling kan också utföras med djuret i lateral kumbency, men labbet finner att insamling är lättare när kaninen är uppspänd på rumpan med en assistent som håller kaninen upprätt med anestesimasken.
  6. Öppna det sterila röret för att förbereda för mjölkuppsamling och lokalisera bröstvävnaden och tillhörande spenar. Spenarna är vanligtvis omgivna av våt päls från ny omvårdnad, och bröstvävnaden är lätt påtaglig när den är full av mjölk.
  7. Ta tag i bröstvävnaden som är associerad med en spen mellan tummen och pekfingret och applicera ett mjukt, masserande tryck på körtelvävnaden i spenens riktning. Placera uppsamlingsröret över spenen för att samla den uttryckta mjölken.
    OBS: Det kan ibland ta flera minuter för oxytocinet att vara effektivt, och mjölkproduktionen verkar variera mellan bröstkörtlar. Om mjölkuttrycket inte lyckas, vänta flera minuter eller rotera runt till de extra bröstkörtlarna. Mjölk från alla spenar kan samlas i samma flaska. Vanligtvis kan flera milliliter mjölk lätt samlas in från en lakterande doe.
  8. Efter mjölkuppsamling, stäng av isofluran och syre och låt kaninen återhämta sig medan den övervakas noggrant tills djuret kan upprätthålla sternal recumbency.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En översikt över en typisk moderns intranasala immuniseringsstudiedesign avbildas i figur 1, som innehåller immuniseringar, avel, kindling, laktation och antikroppsöverföring. Även om det inte illustreras bör blod samlas in före den första immuniseringen för baslinjemätningar och under resten av studien med jämna mellanrum. Blod erhålls lätt via den centrala öronartären med mild sedering och ett aktuellt smärtstillande medel (t.ex. lidokain 2,5% och prilocaine 2,5% kräm). Förekomsten av antigenspecifika IgG-nivåer kan mätas i dessa prover. Kvinnliga kaniner immuniseras via intranasal vägen, som beskrivs i protokollet och visas i videon. Beroende på studien kan vaccinet kräva ett uppsving eller behöva ges via en ytterligare väg (t.ex. intramuskulär eller subkutan). Efter studieinitiering odlas kaniner; Vi föredrar att köpa beprövade uppfödare från leverantörer att använda för att säkerställa en högre graviditetsfrekvens för dessa studier. Beroende på immuniseringstidslinjen kan kaniner få ytterligare immuniseringar under hela graviditeten. Antigenspecifik IgG överförs transplacentally till satserna, och vid cirka 30-32 dagar efter avel kommer gravida att kindle. Vi rekommenderar att du begränsar hanteringen av satser under de första dagarna för att minimera avstötning från gör. Blodprover kan samlas in från satserna för att bedöma antigenspecifika IgG-nivåer som överfördes övergående (figur 3). Förutom ett brett utbud av näringsämnen får kit IgA från lakterande doe medan du ammar. Kit avvänjs vanligtvis vid 4-8 veckor, men före avvänjning kan mjölk enkelt samlas in från lakterande gör, vilket visas i videon. De insamlade mjölkproverna kan sedan bearbetas för påvisande av totala och antigenspecifika IgA-nivåer(figur 4). Beroende på studien kan vacciner (+/- boosts) administreras till satserna, och seriella blodprover kan samlas in från satserna i mycket tidig ålder med hjälp av den laterala saphenous venen.

För modersstudier är det till hjälp för studiedesignen att bestämma graviditeten så tidigt som möjligt och för att säkerställa att doe inte behöver omrasas. Progesteron mätningar kan användas som ett sätt att upptäcka graviditet. Som visas i figur 2kan förhöjda progesteronnivåer detekteras hos gravida kaniner jämfört med icke-gravida kaniner även efter parning med en bock bekräftades för alla gör. Det finns ytterligare metoder för graviditetsdetektering, inklusive manuell palpation, ultraljud och röntgenundersökningar; Dessa kräver dock välutbildad personlig och korrekt utrustning.

Antigenspecifik IgG som överfördes övergående medan in utero kan mätas i serum av satser. Blod kan samlas in från ett litet antal satser vid eller nära födelsetiden för att bedöma tidiga antigenspecifika antikroppsnivåer, men seriell blodsamling är tekniskt mycket lättare eftersom satserna åldras och ökar är storlek. Som avbildas i figur 3kan serumnivåer av antigenspecifik IgG i satserna mätas med ELISA och jämföras med moderns nivåer. Maternally överförda IgG nivåer tenderar att vara högre vid födseln och minska med tiden.

Som en typ av slemhinnor kan mjölk samlas in och bearbetas för att mäta totala eller antigenspecifika antikroppsnivåer. Som visas i figur 4utgör IgA en betydande del av de totala antikroppsnivåerna i bröstmjölken som överförs till satserna via amning. Våra resultat visar att bröstmjölk IgA producerar en något högre ELISA-signal (relativa ljusenheter, RLU) jämfört med IgG, och både IgA och IgG producerar en signal som är mycket högre än signalen för IgM. Dessa resultat är i samförstånd med resultat från andra som tyder på att kaninmjölk innehåller cirka 4,5 mg/mL IgA, 2,4 mg/mL IgG och 0,1 mg/mL IgM26,27.

Figure 1
Figur 1. Prov tidslinje för en moderns intranasal immunisering studie design i en kanin (Oryctolagus cuniculus) modell. Kvinnliga kaniner immuniseras via intranasal vägen, som beskrivs i protokollet och visas i videon. Beroende på studien kan vaccinet kräva ett uppsving eller behöva ges via en ytterligare väg (t.ex. intramuskulär eller subkutan). Kaniner föds sedan upp. Antigenspecifik IgG överförs transplacentally till satserna, och vid cirka 30-32 dagar efter avel kommer gravida att kindle. IgA skickas till satserna från lakterande doe medan du ammar. Före avrkning kan mjölk enkelt samlas in från laktating gör för att bedöma totala och antigenspecifika IgA nivåer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2. Progesteronnivåer hos gravida och icke-gravida kaniner vid 3 veckor efter avel. Blod samlades in från kaniner vid 3 veckor efter avel. Kaniner bekräftades antingen gravida eller icke-gravida baserat på förmåga att kindle en kull vid 30-32 dagar efter avel. Serum progesteron nivåer mättes genom Michigan State University Veterinary Diagnostic Laboratory med hjälp av en chemiluminescent immunoassay (CLIA) med ett immunoassay system (t.ex. Siemens Healthineers IMMULITE 2000). Felstaplar representerar standardfel av medelvärdet, och provstorleken bestod av 4-6 kaniner per grupp. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3. Antigenspecifika IgG-nivåer i satser (i förhållande till moderns nivåer) vid födseln och vid 3 veckors ålder efter en serie moderns immuniseringar. Blod samlades in från gör och kit strax efter kindling och vid 3 veckors ålder. Antigenspecifika IgG nivåer i serum upptäcktes med hjälp av en fluorescerande ELISA som tidigare beskrivits28. Antigenspecifik IgG ritas som ett förhållande av nivåer som detekteras i kit serum och moderns serum. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4. En jämförelse av IgA- och IgM- och IgG-nivåer i kaninmjölk. Kaninmjölk samlades in enligt beskrivningen och demonstrerades i videon. Mjölk bearbetades av en lång centrifugering (13 000 x g i 4,5 timmar vid 4 °C), och det klara mellanskiktet isolerades efter bearbetning. Totala IgA-, IgG- och IgM-nivåer mättes i detta tydliga lager med fluorescerande ELISA somtidigare beskrivits 28, förutom att plattorna var belagda med polyklonala anti-IgA, anti-IgG eller anti-IgM för att upptäcka total kanin IgA, IgG respektive IgM. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om det inte beskrivs i ovanstående protokoll är framgångsrik uppfödning av kaninerna nödvändig för denna modersmodell och för att möjliggöra mjölkuppsamling. Kaniner odlas lätt av levande skydd i en forskningsmiljö. Det rekommenderas att överföras till bockens bur för avel, liksom kan vara territoriell och aggressiv om den hålls i sin egen bur med bocken. Om kvinnor inte är mottagliga efter 15 minuter (som anges genom att springa iväg bitande eller vokalisera), bör doe placeras tillbaka i sin egen bur. Det finns flera informativa videor och handledningar om kaninuppfödning som kan observeras online29, men efter avel kommer hanen vanligtvis att falla om och kan sjunga. När detta har observerats kan doe returneras till sin bur. En bock kan odla 2-3 gånger om dagen utan minskning av spermieantalet30. I vårt IACUC-godkända protokoll är dollar begränsade till avel 10-12 gör per vecka och tillhandahålls minst två vilodagar per vecka, eftersom källor säger att en enda bock vanligtvis är tillräcklig för att bea 10-15gör 31. Vår grupp föreslår att köpa beprövade uppfödare från säljaren för att förbättra avelsframgångsgraden. Eftersom kaniner induceras ägglossare och ägglossning vanligtvis inträffar 10-13 timmar efter kopulering31, har vi upplevt en högre graviditetsfrekvens i gör som odlas på morgonen och sedan igen på eftermiddagen, eller två gånger inom det 10-13 timmars fönstret (observerad ökning från 75% till 95% framgångsgrad, opublicerad). Baserat på litteraturen varierar typiska avelsframgångar från 57-100%32,33,34,35,36,37,38,39,40och kullstorlekar i genomsnitt cirka 7-9 kit31.

Att bestämma graviditeten så tidigt som möjligt är till hjälp i moderns studier för att bekräfta att doe inte behöver återras eller tas bort från studien. Alternativ för graviditetsdetektering inkluderar palpation (så tidigt som 14 dagar)31, ultraljud (så tidigt som 5-9 dagar)40, röntgenundersökningar (så tidigt som dag 11)31,viktökningochmolekylära tekniker, såsom mätningar avinsulintillväxtfaktorer 41 (IGF) och progesteron34,37,38,42,43. Tidigare arbete har indikerat signifikanta höjningar av IGF- II nivåer hos gravida kaniner jämfört med nivåer hos icke-gravida kaniner41. Men i våra händer kunde vi inte upptäcka en skillnad i IGF-II nivåer mellan gravida och icke-gravida kaniner (opublicerade). Eftersom adekvata progesteronnivåer är nödvändiga för att upprätthålla graviditeten hoskaniner 37,44, har flera studier bedömt progesteronnivåer hos gravida kaniner och visat förhöjda nivåer i förhållande till icke-gravida kaniner, särskilt under organogenes runt mitten av graviditeten34,43,44. Vår grupp kunde inte upptäcka skillnader i progesteronnivåer med hjälp av en ELISA mellan gravida och icke-gravida kaniner, men preliminära resultat med hjälp av en automatiserad kemiluminescerande analys vid Michigan State University Veterinary Diagnostic Laboratory indikerar förhöjda progesteronnivåer hos gravida kaniner jämfört med icke-gravida kaniner även efter parning med en buck bekräftades för alla bedöms (Figur 2).

Lakterande kan producera cirka 250 ml, eller 60 ml/kg, mjölkdagligen 45,46, vilket möjliggör stora volymer för experimentella analyser för att bedöma totala och antigenspecifika antikroppssvar/koncentrationer. Kaninmjölk innehåller höga nivåer av fett och protein, som innehåller 2 och 3 gånger mer koncentrerade nivåer av fett och protein, jämfört med ko- och såmjölk,respektive 45,47. På grund av den höga fetthalten i mjölken kräver proverna betydande bearbetning, beroende på vilka analyser som ska utföras. Efter centrifugation av mjölkprovet separeras tre distinkta skikt, inklusive cellerna i bottenskiktet, klart mellanskikt som innehåller immunglobulinerna och fett i det övrelagret 48. Immunglobuliner, inom det klara mellanskiktet, förekommer vid höga koncentrationer inom råmjölk och mjölk och består främst av IgA, IgG och IgM (figur 4). Även om mjölkprover lätt samlas in för hand, och detta är vår föredragna teknik inom labbet, har vakuumsystem också rapporterats ilitteraturen 13,46,48. Yoshiyama et al.48 samlade mjölkprover med undertryck och beskrev en lång centrifugering (15 000 x g i 4 timmar) för separation av mjölklagren innan det klara mellanskiktet passerade genom en Sepharose 4B-kolumn för avlägsnande av immunglobulin. Med denna metod kunde författarna upptäcka koleratoxinspecifika antikroppar i kaninmjölken hos orally immuniserade kaniner på tillräckliga nivåer för skydd mot Vibrio kolera-inducerad utsöndringitarmarna 48. Peri et al.13 bearbetade mjölkprover som samlats in genom aspiration med ett vattenvakuumsystem genom centrifugering vid 4 °C i 2 timmar vid 24 000 x g. I denna studie kunde författarna upptäcka anti-RSV IgA i kolostrum, mjölk och bronkial och intestinala sekret efter mukosal immunisering (muntlig eller intratrakeal), men inte intravenös immunisering, medan anti-RSV IgG upptäcktes i kolostrum, mjölk och serum oavsett immunisering väg13.

Var försiktig under det intranasala immuniseringsförfarandet för att bekräfta att kaninen är i ett tillräckligt anestesiplan och för att undvika att administrera stora mängder vaccin på en gång. Tidigare arbete från vår grupp har visat att effekten av intranasal immunisering påverkades av användningen av anestesi49. Specifikt, djup anestesi framkallas av kombinationen av ketamin och xylazin korrelerade med ökad immunogenicitet av det nasally administrerade vaccinet och förbättrad nasal retention av lösningen. Dessa nivåer var betydligt högre än retention och immunogenicitet hos kaniner intranasally immuniserade efter sedering med acepromazin och butorphanol49. Liknande resultat har också visats efter intranasal immunisering hos möss50,51. Dessutom visade vårt arbete ökad immunogenicitet efter intranasal immunisering under den djupa anestesin över djur som var helt vakna och över djur som genomgår kortare varaktighet anestesi med en kombination av acepromazin och isofluran. Denna skillnad i IgG immunogenicitet mellan djup kontra kortare varaktighet anestesi var betydande vid 42 dagars tidpunkt men inte vid 56 dagars tidpunkt. Även om ökad immunogenicitet och retention kan bero på djupare anestesi, krävde kaniner minst 30 minuter för att återhämta sig; Kaniner var upprätt och mobila inom 5 minuter efter att ha fått näsvaccinet efter den kortare varaktigheten isofluraninducerad anestesi. Även om anestesi kanske inte är idealisk för att efterlikna den kliniska inställningen för intranasal immunisering hos människor, kan en kortare varaktighet anestesi (t.ex. isofluran) föredras framför en längre, djup anestesi med injicerbara medel (t.ex. ketamin + xylazin). Användningen av en djurmodell, som visas i Gwinn et al.49, kommer ofta att kräva användning av sedering eller anestesi för att möjliggöra säker djurhantering och effektiv och konsekvent vaccinleverans. En potentiell begränsning för anestesianvändning med vaccinadministration i djurmodeller är dess effekt på djurets förmåga att inducera ett lämpligt immunsvar mot vaccinet. Intressant nog tyder rapporter i litteraturen på att isofluran kan dämpa systemiska inflammatoriska svar, ge skydd mot utmaningar52 och minska oxidativ stress och inflammation53.

När det gäller minimering av vaccinförlust och adekvat intranasal leverans rekommenderar vår grupp en viloperiod på 30 sekunder efter administrering av varje alikvot av intranasalvaccinet för att möjliggöra kvarhållande av lösningen i näshålan och för att förhindra att lösningen sipprar ut från näsborrarna om kaninen omedelbart placeras i sternal recumbency och återvänder till buret. Dessutom är det viktigt att begränsa volymen av den alikvot som administreras för att säkerställa intranasal immunisering, eftersom slemhinnor absorption begränsas av ytan på näspassagen. Om en stor volym administreras kan lösningen kringgå nässlemhinnan och leda till inandnings- eller magimmunisering. Vår grupp rekommenderar alikvoter på 100 μL per näsborre med en maximal intranasal volym på 500 μL.

Denna artikel fokuserar på slemhinnor vaccin leverans, särskilt via intranasal väg, men det finns flera metoder för immunisering, både slemhinnan och parenteral som har visats hos kaniner. Dessa ytterligare metoder inkluderar, men är inte begränsade till, muntliga, subkutana, intramuskulära och intradermala. Som sådan varierar prover som ska samlas in och bedömas beroende på immuniseringsmål och immuniseringsväg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna avdelningen för laboratoriedjurresurser vid Duke University och deras djurhållningsteam för deras hjälp och stora omsorg till djuren. Dessutom vill författarna känna igen PhotoPath-teamet inom institutionen för patologi för deras hjälp med ljud- och videodelarna i manuskriptet. Detta arbete stöddes av diskretionära forskningsfonder från Staats-laboratoriet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz, F. M. Current Challenges and Achievements in Maternal Immunization Research. Frontiers in Immunology. 9, 436 (2018).
  2. Kachikis, A., Englund, J. A. Maternal immunization: Optimizing protection for the mother and infant. The Journal of Infection. 72, Suppl 83-90 (2016).
  3. Omer, S. B. Maternal Immunization. The New England Journal of Medicine. 376 (13), 1256-1267 (2017).
  4. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. , 01560 (2015).
  5. Fouda, G. G. A., et al. Mucosal Immunization of Lactating Female Rhesus Monkeys with a Transmitted/Founder HIV-1 Envelope Induces Strong Env-Specific IgA Antibody Responses in Breast Milk. Journal of Virology. 87 (12), 6986-6999 (2013).
  6. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces Robust IgA-Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
  7. Furukawa, S., Kuroda, Y., Sugiyama, A. A comparison of the histological structure of the placenta in experimental animals. Journal of Toxicologic Pathology. 27 (1), 11-18 (2014).
  8. Palmeira, P., Quinello, C., Silveira-Lessa, A. L., Zago, C. A., Carneiro-Sampaio, M. IgG placental transfer in healthy and pathological pregnancies. Clinical & Developmental Immunology. 2012, 985646 (2012).
  9. Macchiaverni, P., et al. Mother to child transfer of IgG and IgA antibodies against Dermatophagoides pteronyssinus. Scandinavian Journal of Immunology. 74 (6), 619-627 (2011).
  10. Pentsuk, N., vander Laan, J. W. An interspecies comparison of placental antibody transfer: new insights into developmental toxicity testing of monoclonal antibodies. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 86 (4), 328-344 (2009).
  11. Butler, J. E., Rainard, P., Lippolis, J., Salmon, H., Kacskovics, I., et al. Mucosal Immunology. Mestecky, J., et al. , Academic Press. Ch. 116 2269-2306 (2015).
  12. Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Vanden Broeck, W. NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit. Veterinary Immunology Immunopathology. 133 (2-4), 212-218 (2010).
  13. Peri, B. A., et al. Antibody content of rabbit milk and serum following inhalation or ingestion of respiratory syncytial virus and bovine serum albumin. Clinical and Experimental Immunology. 48 (1), 91-101 (1982).
  14. Fukuizumi, T., Inoue, H., Tsujisawa, T., Uchiyama, C. Tonsillar application of killed Streptococcus mutans induces specific antibodies in rabbit saliva and blood plasma without inducing a cross-reacting antibody to human cardiac muscle. Infection and Immunity. 65 (11), 4558-4563 (1997).
  15. Saeed, M. I., Omar, A. R., Hussein, M. Z., Elkhidir, I. M., Sekawi, Z. Development of enhanced antibody response toward dual delivery of nano-adjuvant adsorbed human Enterovirus-71 vaccine encapsulated carrier. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (10), 2414-2424 (2015).
  16. Ma, Y., et al. Vaccine delivery to the oral cavity using coated microneedles induces systemic and mucosal immunity. Pharmaceutical Research. 31 (9), 2393-2403 (2014).
  17. Jarvinen, L. Z., Hogenesch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Induction of protective immunity in rabbits by coadministration of inactivated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Infection and Immunity. 66 (8), 3788-3795 (1998).
  18. Suckow, M. A., Bowersock, T. L., Nielsen, K., Grigdesby, C. F. Enhancement of respiratory immunity to Pasteurella multocida by cholera toxin in rabbits. Laboratory Animals. 30 (2), 120-126 (1996).
  19. Jarvinen, L. Z., HogenEsch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Intranasal vaccination of New Zealand white rabbits against pasteurellosis, using alginate-encapsulated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Comparative Medicine. 50 (3), 263-269 (2000).
  20. Winchell, J. M., Routray, S., Betts, P. W., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal and systemic antibody responses to a C4/V3 construct following DNA vaccination of rabbits via the Peyer's patch. The Journal of Infectious Diseases. 178 (3), 850-853 (1998).
  21. Wegmann, F., et al. A novel strategy for inducing enhanced mucosal HIV-1 antibody responses in an anti-inflammatory environment. PLoS One. 6 (1), 15861 (2011).
  22. Winchell, J. M., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal immune response to an HIV C4/V3 peptide following nasal or intestinal immunization of rabbits. AIDS Research and Human Retroviruses. 13 (10), 881-889 (1997).
  23. Knudsen, C., et al. Quantitative feed restriction rather than caloric restriction modulates the immune response of growing rabbits. The Journal of Nutrition. 145 (3), 483-489 (2015).
  24. Ciarlet, M., et al. Subunit rotavirus vaccine administered parenterally to rabbits induces active protective immunity. Journal of Virology. 72 (11), 9233-9246 (1998).
  25. Denchev, V., Mitov, I., Marinova, S., Linde, K. Local and systemic immune response in rabbits after intraintestinal immunization with a double-marker attenuated strain of Salmonella typhimurium. Journal of Hygiene, Epidemiology, Microbiology, and Immunology. 32 (4), 457-465 (1988).
  26. Watson, D. L. Immunological functions of the mammary gland and its secretion--comparative review. Australian Journal of Biological Sciences. 33 (4), 403-422 (1980).
  27. Lascelles, A. K., McDowell, G. H. Localized humoral immunity with particular reference to ruminants. Transplantation Reviews. 19, 170-208 (1974).
  28. Jones, D. I., et al. Optimized Mucosal Modified Vaccinia Virus Ankara Prime/Soluble gp120 Boost HIV Vaccination Regimen Induces Antibody Responses Similar to Those of an Intramuscular Regimen. Journal of Virology. 93 (14), (2019).
  29. Rabbit Tracks: Breeding Techniques and Management. Michigan State University. , Available from: https://www.canr.msu.edu/resources/rabit tracks breeding techniques and management (2020).
  30. Patton, N. M. The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. Ch. 2 27-45 (1994).
  31. Nowland, M. H., Brammer, D. W., Garcia, A., Rush, H. G. Laboratory Animal Medicine. Fox, J. G., et al. , Academic Press. Ch. 10 411-461 (2015).
  32. Attia, Y. A., Al-Hanoun, A., El-Din, A. E., Bovera, F., Shewika, Y. E. Effect of bee pollen levels on productive, reproductive and blood traits of NZW rabbits. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 95 (3), 294-303 (2011).
  33. Feussner, E. L., Lightkep, G. E., Hennesy, R. A., Hoberman, A. M., Christian, M. S. A decade of rabbit fertility data: study of historical control animals. Teratology. 46 (4), 349-365 (1992).
  34. Manal, A. F., Tony, M. A., Ezzo, O. H. Feed restriction of pregnant nulliparous rabbit does: consequences on reproductive performance and maternal behaviour. Animal Reproduction Science. 120 (1-4), 179-186 (2010).
  35. Marai, I. F., Ayyat, M. S., Abd el-Monem, U. M. Growth performance and reproductive traits at first parity of New Zealand white female rabbits as affected by heat stress and its alleviation under Egyptian conditions. Tropical Animal Health and Production. 33 (6), 451-462 (2001).
  36. Rodríguez, M., et al. A diet supplemented with n-3 polyunsaturated fatty acids influences the metabomscic and endocrine response of rabbit does and their offspring. Journal of Animal Science. 95 (6), 2690-2700 (2017).
  37. Salem, A. A., El-Shahawy, N. A., Shabaan, H. M., Kobeisy, M. Effect of punicalagin and human chorionic gonadotropin on body weight and reproductive traits in maiden rabbit does. Veterinary and Animal Science. 10, 100140 (2020).
  38. Sirotkin, A. V., Parkanyi, V., Pivko, J. High temperature impairs rabbit viability, feed consumption, growth and fecundity: examination of endocrine mechanisms. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106478 (2020).
  39. Sun, L., et al. Effect of light intensity on ovarian gene expression, reproductive performance and body weight of rabbit does. Animal Reproduction Science. 183, 118-125 (2017).
  40. El-Gayar, M., et al. Pregnancy detectuib ub rabbits by ultrasonography as compared to manual palpation. Egyptian Journal of Animal Production. 51 (3), 196-199 (2014).
  41. Nason, K. S., Binder, N. D., Labarta, J. I., Rosenfeld, R. G., Gargosky, S. E. IGF-II and IGF-binding proteins increase dramatically during rabbit pregnancy. The Journal of Endocrinology. 148 (1), 121-130 (1996).
  42. Haneda, R., et al. Changes in blood parameters in pregnant Japanese White rabbits. The Journal Toxicological Sciences. 35 (5), 773-778 (2010).
  43. Mizoguchi, Y., et al. Changes in blood parameters in New Zealand White rabbits during pregnancy. Laboratory Animals. 44 (1), 33-39 (2010).
  44. Salem, A. A., Gomaa, Y. A. Effect of combination vitamin E and single long-acting progesterone dose on enhancing pregnancy outcomes in the first two parities of young rabbit does. Animal Reproduction Science. 150 (1-2), 35-43 (2014).
  45. Maertens, L., Lebas, F., Szendro, Z. Rabbit milk: A review of quantity, quality and non-dietary affecting factors. World Rabbit Science. 14 (4), 205-230 (2006).
  46. Pekow, C. A. The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press. 243-258 (2012).
  47. Jenness, R. Lactational Performance of Various Mammalian-Species. Journal of Dairy Science. 69 (3), 869-885 (1986).
  48. Yoshiyama, Y., Brown, W. R. Specific antibodies to cholera toxin in rabbit milk are protective against Vibrio cholerae-induced intestinal secretion. Immunology. 61 (4), 543-547 (1987).
  49. Gwinn, W. M., et al. Effective induction of protective systemic immunity with nasally administered vaccines adjuvanted with IL-1. Vaccine. 28 (42), 6901-6914 (2010).
  50. Sloat, B. R., Cui, Z. Evaluation of the immune response induced by a nasal anthrax vaccine based on the protective antigen protein in anaesthetized and non-anaesthetized mice. Journal of Pharmcy and Pharmacology. 58 (4), 439-447 (2006).
  51. Janakova, L., et al. Influence of intravenous anesthesia on mucosal and systemic antibody responses to nasal vaccines. Infection and Immunity. 70 (10), 5479-5484 (2002).
  52. Fuentes, J. M., et al. General anesthesia delays the inflammatory response and increases survival for mice with endotoxic shock. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (2), 281-288 (2006).
  53. Lee, Y. -M., Song, B. C., Yeum, K. -J. Impact of Volatile Anesthetics on Oxidative Stress and Inflammation. BioMed Research International. 2015, 242709 (2015).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 173 moderns immunisering intranasal immunisering slemhinna immunisering mjölksamling kaninmjölk Oryctolagus cuniculus.
Intranasal immunisering och mjölksamling i studier av moderns immunisering i Nya Zeeland Vita Kaniner (<em>Oryctolagus cuniculus</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing,… More

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter