Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Интраназальная иммунизация и сбор молока в исследованиях материнской иммунизации у новозеландских белых кроликов (Oryctolagus cuniculus)

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

В данной статье описано и демпсесса введение интраназальных вакцин и забор молока у лактирующих кроликов(Oryctolagus cuniculus)в качестве средства оценки иммунитета слизистой оболочки в трансляционно подходящей модели иммунизации матери.

Abstract

Благодаря сходству плацентации и переноса антител с человеком, кролики являются отличной моделью материнской иммунизации. Дополнительными преимуществами этой исследовательской модели являются простота размножения и сбора образцов, относительно короткий период беременности и большие размеры помета. Обычно оцениваемые пути иммунизации включают подкожные, внутримышечные, интраназальные и внутрикожные. Нетерминальный отбор проб для хронологического выявления иммунологических реакций на эти иммунизации включает сбор крови, как из плотин, так и из наборов, и молока из лактирующих. В этой статье мы продемонстрируем методы, которые наша лаборатория использовала в исследованиях материнской иммунизации у новозеландских белых кроликов(Oryctolagus cuniculus),включая интраназальную иммунизацию и сбор молока.

Introduction

Исследования материнской иммунизации и переноса антител имеют неоценимое значение по многим причинам, так как это начальный путь передачи иммунитета и последующей защиты от патогенов и заболеваний у новорожденных и младенцев. Иммунизация матерей может оказать положительное влияние как на здоровье матери, так и ребенка/ребенка на глобальном уровне путем снижения заболеваемости и смертности, связанных с определенными патогенами, в течение этого уязвимого периода1. Основной целью этой стратегии является повышение уровня специфических материнских антител на протяжении всей беременности. Эти антитела затем могут быть переданы новорожденному и младенцу на уровнях, достаточных для защиты от инфекций, пока их иммунная система не станет достаточно зрелой, чтобы адекватно реагировать на проблемы1,2,3. Предыдущая работа показала, что более высокие титры антител при рождении связаны либо с полной защитой, либо с отсроченным началом и уменьшением тяжести многочисленных различных инфекционных заболеваний у новорожденных, включая столбняк, коклюш, респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), грипп и стрептококковые инфекции группы В1,2,3.

У людей материнские антитела пассивно переносятся через плаценту, а также передаются через грудное молоко через кормление грудью. Предыдущая работа показала, что ВИЧ-специфические уровни IgA в грудном молоке человека от матерей, инфицированных вирусом, были связаны с уменьшением постнатальной передачи вируса, что предполагает защитную роль грудного молока против ВИЧ IgA4. Исследования на нечеловеческих приматах показали, что иммунизация против ВИЧ может вызывать значительный ответ антител в грудном молоке, и хотя аналогичные сывороточные ответы IgG были индуцированы после системной иммунизации по сравнению с иммунизацией слизистой оболочки, иммунизация слизистой оболочки вызвала значительно более высокий ответ IgA в молоке5,6.

При выявлении трансляционно подходящей животной модели для этих исследований следует учитывать тип плацентации и механизмы пассивного переноса антител, а также перенос антител через грудное молоко. Существует три основных типа плацентации у млекопитающих, основанных на типах тканей и слоях на границе матери и плода, включая гемохориальную (приматы, грызуны и кролики), эндотелиохориальную (плотоядные) и эпителиохориальную (лошади, свиньи и жвачные животные). Гемохориальная плацента является наиболее инвазивным типом, позволяющим осуществлять прямую связь между материнским кровоснабжением и хорионом или самой внешней плодной оболочкой. Исходя из количества слоев трофобластов, существует несколько вариаций гемохориальной плацентации, включая гемомонохориальную плаценту, обнаруженную у приматов, гемодихориальную плаценту у кроликов и гемотрихориальную плаценту, наблюдаемую у крыс и мышей7. Этот прямой контакт между материнским кровоснабжением и хорионом позволяет пассивно передавать антитела через плаценту во время беременности. IgG является единственным классом антител, который значительно пересекает человеческую плаценту8,тогда как IgA является преобладающим классом Ig, обнаруженным в грудном молоке человека9. Из научно значимых моделей только приматы (включая человека), кролики и морские свинки переносят IgG в утробе матери и IgA в молоке10,11. Таким образом, модель кролика включает факторы, сопоставимые с теми, которые у людей контролируют трансплацентарный перенос IgG и лактационный перенос IgA.

В дополнение к тому, что они служат исключительной моделью для материнского иммунитета и разработки вакцины, сходство между полостями носа кролика и человека делает их подходящей моделью для интраназальной иммунизации. Объем носовой полости кролика больше похож на человеческие, чем на модели грызунов, основанные на относительной массе тела12. Кроме того, Casteleyn et al. 12 продемонстрировали, что носовая ассоциированная лимфоидная ткань (NALT) более объемна у кролика по сравнению с грызунами. NALT расположен в основном в вентральном и вентромедиальном аспекте вентрального носового мяса и в боковом и дорсолатеральном аспекте носоглоточного мяса у кроликов, тогда как у грызунов лимфоидная ткань присутствует только вдоль вентрального аспекта носоглоточного мяса12. У кроликов строение и расположение интраэпителиальных и ламина проприальных лимфоцитов, а также выделенных лимфоидных фолликулов аналогичны человеческим12.

Дополнительные преимущества использования кролика в качестве модели материнского и слизистого иммунитета включают их высокую плодовитость и относительно короткий срок беременности. Крупные ушные кровеносные сосуды обеспечивают относительно легкий доступ к большим объемам крови для серийных сборов. Для анализа реакции антиген-специфических антител могут быть собраны различные образцы слизистой оболочки, включая грудное молоко13 (при кормлении), слизистые выделения или промывки (например, пероральные14,15,16,бронхоальвеолярный лаваж13,17,18,19,влагалищ20,21,22)и кал20,23,24,25. Образцы молока могут быть легко собраны во время лактации для оценки наличия антиген-специфических реакций антител. Хотя это не так распространено, как для людей и мышей, широкий спектр экспериментальных реагентов доступен для исследований и анализов, специфичных для кроликов. В этой статье мы опишем и продемонстрируем интраназальную иммунизацию и сбор молока у новозеландских белых кроликов (Oryctolagus cuniculus).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были одобрены и выполнены в соответствии с политикой Университета Дьюка IACUC.

ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые материалы приведены в Таблице материалов.

1. Зеодация и анестезия кроликов

  1. Седовать самку кролика (половозрелого; примерно 5-30 месяцев) путем введения ацепромазина внутримышечно (в/м) в дозе 1 мг/кг. В зависимости от размера животного, используйте шприц объемом 1 или 3 мл с иглой 25 г. Эпаксиальные мышцы являются предпочтительным местом внутримышечной инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ацепромазин также можно вводить подкожно, но ВМ предпочтительнее лаборатории, так как он действует быстрее и снижает частоту поражений кожи.
  2. Подождите 10-15 минут, чтобы ацепромазин вступить в силу.
  3. Обезболить кролика изофлураном, поместив соединенный носовой конус над носом животного. Отрегулируйте испаритель до 4% изофлурана в сочетании с кислородом до 4 литров в минуту. Кролики обладают высоким отвращением к изофлурану, поэтому при маскировки животного необходима адекватная сдержанность.
  4. После полного обезболивания, оцениваемого по ушному, педальному и / или пальпебральному рефлексу, нанесите офтальмологическую смазку на каждый глаз, чтобы предотвратить высыхание глаз и последующее изъязвление роговицы.
  5. Постоянно контролируйте рефлексы и дыхание во время анестезии и снижайте частоту изофлурана до 1-2%, как только будет достигнута адекватная плоскость анестезии.

2. Интраназальная иммунизация

  1. Подготовьте раствор для иммунизации перед обработкой животных.
  2. Умирать кролика, как описано выше.
  3. Как только член лаборатории будет готов ввести вакцину, а кролик окажется в адекватной плоскости анестезии, выключите изофлуран и кислород и удалите носовой конус.
  4. Поместите кролика в дорсальную ложную клетку и подпирите шею и голову под углом примерно 45°, что обеспечивает легкий доступ и визуализацию обоих нарях членом лаборатории, вводимым вакцину.
  5. Загрузите пипетку не более чем 100 мкл раствора вакцины и быстро ввести раствор в каждую ноздрю. Пипетку следует удерживать под углом приблизительно 45°, под углом к медиаальному аспекту носового прохода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель иммунизации состоит в том, чтобы раствор контактировал со слизистой оболочкой нар, поэтому наконечник не следует помещать внутрь нар, так как это может привести к истиранию или раздражению тканей слизистой оболочки и потенциально повлиять на иммуногенность назально вводимой вакцины. Вакцина должна быть введена быстро и сделана таким же образом в другом наре.
  6. После введения в оба носовых прохода поддерживайте кролика в дорсальной лежачем состоянии в течение 30 секунд, чтобы свести к минимуму утечку раствора вакцины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лаборатория обычно вводит не более 100 мкл на ноздрю за один раз. Если необходимо ввести больший объем, с максимальным общим количеством 500 мкл, вакцина может быть введена в 100 мкл аликвот с 30-секундным периодом отдыха между иммунизациями и повторным введением вакцины с 30 секундами отдыха между каждым введением, до тех пор, пока не будет доставлен общий объем вакцины.
  7. После иммунизации поместите кролика на вентиляционную клетку для восстановления и внимательно следите за животным, пока оно не сможет поддерживать стернальную лежачку.

3. Сбор молока

  1. Умирать кормящего кролика, как описано выше.
  2. Очистите кожу над краевой ушной веной спиртом/салфеткой.
  3. Используя шприц 1 мл и иглу 25 г, вводите примерно 1-2 МЕ окситоцина внутривенно через краевую вену уха, чтобы вызвать выделение молока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за расслабления гладких мышц кролик обычно мочится или испражняется после введения окситоцина.
  4. После введения окситоцина надавите на место инъекции кусочком марли.
  5. Сохраняя анестезионную маску над носом кролика, подпирайте кролика на задние четвертины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор молока также может быть выполнен с животным в боковом положении, но лаборатория обнаруживает, что сбор легче, когда кролик подпирается на крестец с помощником, держащим кролика вертикально с помощью анестезирующей маски.
  6. Откройте стерильную трубку, чтобы подготовиться к сбору молока и найти ткань молочной железы и связанные с ней соски. Соски, как правило, окружены влажным мехом от недавнего кормления, а ткань молочной железы легко прощупываются, когда она полна молока.
  7. Захватите ткань молочной железы, связанную с соском между большим и указательным пальцами, и нанесите мягкое массирование на железистую ткань в направлении соска. Поместите трубку для сбора над сосок, чтобы собрать сцеженное молоко.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда может потребоваться несколько минут, чтобы окситоцин был эффективным, и производство молока, по-видимому, варьируется среди молочных желез. Если скичка молока не увенчался успехом, подождите несколько минут или поверните вокруг дополнительных молочных желез. Молоко из всех сосок можно собирать в один флакон. Как правило, несколько миллилитров молока можно легко собрать у кормящей голени.
  8. После сбора молока выключите изофлуран и кислород и позвольте кролику восстановиться, находясь под тщательным наблюдением, пока животное не сможет поддерживать стернальную удерживаемость.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Обзор типичного дизайна исследования интраназальной иммунизации матери изображен на рисунке 1,включая иммунизацию, разведение, расщепление, лактацию и перенос антител. Хотя это и не проиллюстрировано, кровь должна быть собрана до первоначальной иммунизации для исходных измерений и в течение остальной части исследования через регулярные промежутки времени. Кровь легко получается через центральную ушную артерию с помощью мягкой сакации и местного обезболивающего агента (например, лидокаина 2,5% и прилокаина 2,5% крема). Наличие антиген-специфических уровней IgG может быть измерено в этих образцах. Самки кроликов иммунизируются интраназальным путем, как описано в протоколе и продемонстрировано на видео. В зависимости от исследования, вакцина может потребовать усиления или может потребоваться введение через дополнительный путь (например, внутримышечно или подкожно). После начала исследования кроликов разводят; мы предпочитаем приобретать проверенных заводчиков у продавцов для использования, чтобы обеспечить более высокий уровень беременности для этих исследований. В зависимости от сроков иммунизации кролики могут получать дополнительные прививки на протяжении всей беременности. Антиген-специфический IgG переносится трансплацентально в наборы, и примерно через 30-32 дня после размножения беременная действительно разжигается. Мы рекомендуем ограничить обращение с комплектами в течение первых нескольких дней, чтобы свести к минимуму отказ от этого. Образцы крови могут быть собраны из наборов для оценки антиген-специфических уровней IgG, которые были переданы трансплацентально(рисунок 3). В дополнение к широкому разнообразию питательных веществ, наборы получают IgA от лактирующих лань во время кормления. Наборы обычно отлучают от животных в 4-8 недель, но до отъема молоко можно легко собрать с лактирующих, как показано на видео. Затем собранные образцы молока могут быть обработаны для определения общих и антиген-специфических уровней IgA(рисунок 4). В зависимости от исследования, вакцины (+/- бусти) могут быть введены в наборы, а серийные образцы крови могут быть собраны из наборов в очень раннем возрасте с использованием боковой подкожной вены.

Для материнских исследований определение беременности как можно раньше полезно для дизайна исследования и для обеспечения того, чтобы готь не нуждалась в повторном разведении. Измерения прогестерона могут быть использованы в качестве средства для выявления беременности. Как показано на рисунке 2,повышенный уровень прогестерона может быть обнаружен у беременных кроликов по сравнению с небеременными кроликами даже после того, как спаривание баксом было подтверждено для всех. Существуют дополнительные методы выявления беременности, включая ручную пальпацию, УЗИ и рентгенограммы; однако они требуют хорошо обученного личного и надлежащего оборудования.

Антиген-специфический IgG, который был передан трансплацентально в утробе матери, может быть измерен в сыворотке наборов. Кровь может быть собрана из небольшого количества наборов во время или около времени рождения для оценки ранних уровней антиген-специфических антител, но серийный сбор крови технически намного проще, поскольку наборы стареют и увеличиваются в размерах. Как показано на рисунке 3,сывороточные уровни антиген-специфического IgG в наборах могут быть измерены с помощью ИФА и сопоставлены с материнскими уровнями. Материнские уровни IgG, как правило, выше при рождении и со временем уменьшаются.

В качестве типа образца слизистой оболочки молоко может быть собрано и обработано для измерения общих или антиген-специфических уровней антител. Как показано на рисунке 4,IgA составляет значительную часть общих уровней антител в грудном молоке, которые переносятся в наборы через лактацию. Наши результаты показывают, что грудное молоко IgA производит немного более высокий сигнал ИФА (относительные световые единицы, RLU) по сравнению с IgG, и как IgA, так и IgG производят сигнал, который намного выше, чем сигнал для IgM. Эти результаты согласуются с результатами других, которые предполагают, что кроличье молоко содержит около 4,5 мг / мл IgA, 2,4 мг / мл IgG и 0,1 мг / мл IgM26,27.

Figure 1
Рисунок 1. Пример графика для дизайна исследования интраназальной иммунизации матери в моделикролика (Oryctolagus cuniculus). Самки кроликов иммунизируются интраназальным путем, как описано в протоколе и продемонстрировано на видео. В зависимости от исследования, вакцина может потребовать усиления или может потребоваться введение через дополнительный путь (например, внутримышечно или подкожно). Затем разводят кроликов. Антиген-специфический IgG переносится трансплацентально в наборы, и примерно через 30-32 дня после размножения беременная действительно разжигается. IgA передается в наборы от лактационной голи во время кормления. Перед отлучение отлучения от молока можно легко собрать из лактирующих веществ для оценки общих и антиген-специфических уровней IgA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Уровни прогестерона у беременных и небеременных кроликов на 3 неделе после размножения. Кровь была собрана у кроликов через 3 недели после размножения. Кролики были подтверждены как беременными, так и несеменными на основе способности разжигать помет через 30-32 дня после размножения. Уровни прогестерона в сыворотке крови измерялись через Ветеринарную диагностическую лабораторию Мичиганского государственного университета с использованием хемилюминесцентного иммуноанализа (CLIA) с системой иммуноанализа (например, Siemens Healthineers IMMULITE 2000). Полосы ошибок представляют собой стандартную погрешность среднего значения, а размер выборки состоял из 4-6 кроликов на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Антиген-специфические уровни IgG в наборах (относительно материнских уровней) при рождении и в возрасте 3 недель после серии иммунизации матерей. Кровь была собрана из наборов вскоре после разжигания и в возрасте 3 недель. Антиген-специфические уровни IgG в сыворотке крови были обнаружены с помощью флуоресцентной ИФА, какописано ранее 28. Антиген-специфический IgG строится как соотношение уровней, обнаруженных в сыворотке и материнской сыворотке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Сравнение уровней IgA, IgM и IgG в кроличьем молоке. Кроличье молоко было собрано так, как описано и продемонстрировано на видео. Молоко обрабатывали длительным центрифугированием (13 000 х г в течение 4,5 часов при 4 °C), а прозрачный средний слой изолировали после обработки. Общие уровни IgA, IgG и IgM измеряли в этом прозрачном слое флуоресцентной ИФА, какописано ранее 28,за исключением того, что пластины были покрыты поликлональным анти-IgA, анти-IgG или анти-IgM для обнаружения общего IgA, IgG или IgM кролика соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя это и не описано в приведенном выше протоколе, успешное разведение кроликов необходимо для этой материнской модели и для сбора молока. Кроликов легко разводят по живому укрытию в исследовательской обстановке. Рекомендуется, чтобы его перевели в клетку бакса для размножения, так как он может быть территориальным и агрессивным, если содержится в собственной клетке с баксом. Если самки не восприимчивы через 15 минут (на что указывает убегание, кусание или вокализация), ладь должна быть помещена обратно в ее собственную клетку. Есть несколько информативных видео и учебных пособий по разведению кроликов, которые можно наблюдать онлайн29,но после размножения самец обычно падает и может вокализировать. Как только это будет соблюдено, готь можно вернуть в ее клетку. Бакс может размножаться 2-3 раза в день без снижения количества сперматозоидов30. В нашем протоколе, одобренном IACUC, баксы ограничены разведением 10-12 дел в неделю и обеспечиваются по крайней мере два дня отдыха в неделю, поскольку источники утверждают, что одного бакса обычно достаточно для обслуживания 10-15 делает31. Наша группа предлагает приобрести проверенных заводчиков у продавца, чтобы улучшить уровень успеха разведения. Поскольку кролики являются индуцированными овуляторами, а овуляция обычно происходит через 10-13 часов после совокупления31,мы испытали более высокий уровень беременности в интимах, которые разводятся утром, а затем снова во второй половине дня, или дважды в течение этого 10-13-часового окна (наблюдаемое увеличение с 75% до 95% успеха, не опубликовано). Исходя из литературы, типичные показатели успеха размножения варьируются от 57-100%32,33,34,35,36,37,38,39,40, а размеры помета в среднем составляют примерно 7-9 наборов31.

Определение беременности как можно раньше полезно в исследованиях матерей, чтобы подтвердить, что ладь не нуждается в повторном разведении или удалении из исследования. Варианты выявления беременности включают пальпацию (уже на 14 день)31,УЗИ (уже через 5-9дней) 40,рентгенограммы (уже на 11 день)31,увеличение веса и молекулярные методы, такие как измерения инсулиновых факторов роста41 (ИФР) и прогестерона34,37,38,42,43. Предыдущая работа показала значительное повышение уровней IGF-II у беременных кроликов по сравнению с уровнями у небеременных кроликов41. Однако в наших руках мы не смогли обнаружить разницу в уровнях IGF-II между беременными и небеременными кроликами (не опубликовано). Поскольку адекватные уровни прогестерона необходимы для поддержания беременности у кроликов37,44,в нескольких исследованиях оценивались уровни прогестерона у беременных кроликов и демонстрировались повышенные уровни по сравнению с небеременными кроликами, особенно во время органогенеза около середины беременности34,43,44. Наша группа не смогла обнаружить различия в уровнях прогестерона с помощью ИФА между беременными и небеременными кроликами, но предварительные результаты с использованием автоматизированного хемилюминесцентного анализа в Ветеринарной диагностической лаборатории Мичиганского государственного университета указывают на повышенный уровень прогестерона у беременных кроликов по сравнению с небеременными кроликами даже после того, как спаривание баксом было подтверждено для всех оцененных(рисунок 2).

Лактация может производить приблизительно 250 мл, или 60 мл / кг, молока ежедневно45,46,что позволяет использовать большие объемы для экспериментальных анализов для оценки общих и антиген-специфических реакций / концентраций антител. Кроличье молоко содержит высокий уровень жира и белка, содержащий в 2 и 3 раза более концентрированные уровни жира и белка, по сравнению с коровьим и сеяным молоком, соответственно45,47. Из-за высокого содержания жира в молоке образцы требуют значительной обработки, в зависимости от проводимых анализов. После центрифугирования образца молока выделяют три отдельных слоя, включая клетки в нижнем слое, прозрачный промежуточный слой, содержащий иммуноглобулины, и жир в верхнем слое48. Иммуноглобулины в прозрачном промежуточном слое присутствуют в высоких концентрациях в молозиве и молоке и в основном состоят из IgA, IgG и IgM(рисунок 4). Хотя образцы молока легко собираются вручную, и это наш предпочтительный метод в лаборатории, вакуумные системы также были зарегистрированы в литературе13,46,48. Yoshiyama et al.48 собрали образцы молока с использованием отрицательного давления и описали длительную центрифугирование (15 000 х г в течение 4 часов) для разделения слоев молока перед прохождением прозрачного промежуточного слоя через столбец Sepharose 4B для удаления иммуноглобулина. Используя этот метод, авторы смогли обнаружить специфические антитела к холеринового токсина в кроличьем молоке перорально иммунизированных кроликов на достаточных уровнях для защиты от секреции, вызванной холеро-холерами,в кишечнике48. Peri et al.13 проб обработанного молока, собранных путем аспирации с помощью вакуумной системы воды путем центрифугирования при 4 °C в течение 2 часов при 24 000 х г. В этом исследовании авторы смогли обнаружить анти-RSV IgA в молозиве, молоке, бронхиальной и кишечной секреции после иммунизации слизистой оболочки (пероральной или интратрахеальной), но не внутривенной иммунизации, тогда как анти-RSV IgG был обнаружен в молозиве, молоке и сыворотке независимо от пути иммунизации13.

Во время процедуры интраназальной иммунизации следует проявлять осторожность, чтобы подтвердить, что кролик находится в адекватной плоскости анестезии, и избежать введения больших объемов вакцины сразу. Предыдущая работа из нашей группы показала, что на эффективность интраназальной иммунизации повлияло применение анестезии49. В частности, глубокая анестезия, вызванная комбинацией кетамина и ксилазина, коррелировала с повышенной иммуногенностью назально вводимой вакцины и улучшением удержания раствора в носу. Эти уровни были значительно выше, чем ретенции и иммуногенность у кроликов, интраназально иммунизированных после седации ацепромазином и буторфанолом49. Аналогичные результаты были также продемонстрированы после интраназальной иммунизации у мышей50,51. Кроме того, наша работа продемонстрировала повышенную иммуногенность после интраназальной иммунизации под глубокой анестезией над животными, которые были полностью бодрствующими, и над животными, подвергающимися анестезии более короткой продолжительности с комбинацией ацепромазина и изофлурана. Эта разница в иммуногенности IgG между глубокой и более короткой продолжительностью анестезии была значительной в 42-дневную точку времени, но не в 56-дневную точку времени. Хотя повышенная иммуногенность и задержка могут быть результатом более глубокой анестезии, кроликам потребовалось не менее 30 минут для восстановления; в то время как кролики были вертикальными и подвижными в течение 5 минут после получения назальной вакцины после более короткой продолжительности анестезии, вызванной изофлураном. Хотя анестезия не может быть идеальной для имитации клинических условиях интраназальной иммунизации у людей, анестезия более короткой продолжительности (например, изофлуран) может быть предпочтительнее более длительной глубокой анестезии с инъекционными агентами (например, кетамин + ксилазин). Использование животной модели, как показано в Gwinn et al.49,часто требует использования ксации или анестезии, чтобы обеспечить безопасное обращение с животными и эффективную и последовательную доставку вакцины. Потенциальным ограничением для использования анестезии при введении вакцины на животных моделях является ее влияние на способность животного вызывать соответствующий иммунный ответ на вакцину. Интересно, что сообщения в литературе предполагают, что изофлуран может охладить системные воспалительные реакции, обеспечивая защиту от проблем52 и уменьшая окислительный стресс и воспаление53.

Что касается минимизации потерь вакцины и адекватной интраназальной доставки, наша группа рекомендует период отдыха в 30 секунд после введения каждой аликвоты интраназальной вакцины, чтобы обеспечить удержание раствора в полости носа и предотвратить просачивание раствора из ноздрей, если кролика немедленно помещают в кормовую клетку и возвращают в клетку. Дополнительно важно ограничить объем вводимой аликвоты для обеспечения интраназальной иммунизации, так как абсорбция слизистой оболочки ограничена площадью поверхности носового прохода. При введении большого объема раствор может обойти слизистую оболочку носа и привести к ингаляционной или желудочной иммунизации. Наша группа рекомендует аликвоты 100 мкл на ноздрю с максимальным интраназальным объемом 500 мкл.

Эта статья посвящена доставке вакцины слизистой оболочки, в частности, интраназальным путем, но существует несколько методов иммунизации, как слизистой, так и парентеральной, которые были продемонстрированы у кроликов. Эти дополнительные методы включают, но не ограничиваются ими, пероральные, подкожные, внутримышечные и внутрикожные. Таким образом, образцы, которые должны быть собраны и оценены, варьируются в зависимости от экспериментальных целей и пути иммунизации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Отдел ресурсов лабораторных животных в Университете Дьюка и их команду по разведения за их помощь и большую заботу, оказанную животным. Кроме того, авторы хотели бы отметить команду PhotoPath в отделе патологии за их помощь с аудио- и видео-частями рукописи. Эта работа была поддержана дискреционными исследовательскими фондами лаборатории Staats.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz, F. M. Current Challenges and Achievements in Maternal Immunization Research. Frontiers in Immunology. 9, 436 (2018).
  2. Kachikis, A., Englund, J. A. Maternal immunization: Optimizing protection for the mother and infant. The Journal of Infection. 72, Suppl 83-90 (2016).
  3. Omer, S. B. Maternal Immunization. The New England Journal of Medicine. 376 (13), 1256-1267 (2017).
  4. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. , 01560 (2015).
  5. Fouda, G. G. A., et al. Mucosal Immunization of Lactating Female Rhesus Monkeys with a Transmitted/Founder HIV-1 Envelope Induces Strong Env-Specific IgA Antibody Responses in Breast Milk. Journal of Virology. 87 (12), 6986-6999 (2013).
  6. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces Robust IgA-Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
  7. Furukawa, S., Kuroda, Y., Sugiyama, A. A comparison of the histological structure of the placenta in experimental animals. Journal of Toxicologic Pathology. 27 (1), 11-18 (2014).
  8. Palmeira, P., Quinello, C., Silveira-Lessa, A. L., Zago, C. A., Carneiro-Sampaio, M. IgG placental transfer in healthy and pathological pregnancies. Clinical & Developmental Immunology. 2012, 985646 (2012).
  9. Macchiaverni, P., et al. Mother to child transfer of IgG and IgA antibodies against Dermatophagoides pteronyssinus. Scandinavian Journal of Immunology. 74 (6), 619-627 (2011).
  10. Pentsuk, N., vander Laan, J. W. An interspecies comparison of placental antibody transfer: new insights into developmental toxicity testing of monoclonal antibodies. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 86 (4), 328-344 (2009).
  11. Butler, J. E., Rainard, P., Lippolis, J., Salmon, H., Kacskovics, I., et al. Mucosal Immunology. Mestecky, J., et al. , Academic Press. Ch. 116 2269-2306 (2015).
  12. Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Vanden Broeck, W. NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit. Veterinary Immunology Immunopathology. 133 (2-4), 212-218 (2010).
  13. Peri, B. A., et al. Antibody content of rabbit milk and serum following inhalation or ingestion of respiratory syncytial virus and bovine serum albumin. Clinical and Experimental Immunology. 48 (1), 91-101 (1982).
  14. Fukuizumi, T., Inoue, H., Tsujisawa, T., Uchiyama, C. Tonsillar application of killed Streptococcus mutans induces specific antibodies in rabbit saliva and blood plasma without inducing a cross-reacting antibody to human cardiac muscle. Infection and Immunity. 65 (11), 4558-4563 (1997).
  15. Saeed, M. I., Omar, A. R., Hussein, M. Z., Elkhidir, I. M., Sekawi, Z. Development of enhanced antibody response toward dual delivery of nano-adjuvant adsorbed human Enterovirus-71 vaccine encapsulated carrier. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (10), 2414-2424 (2015).
  16. Ma, Y., et al. Vaccine delivery to the oral cavity using coated microneedles induces systemic and mucosal immunity. Pharmaceutical Research. 31 (9), 2393-2403 (2014).
  17. Jarvinen, L. Z., Hogenesch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Induction of protective immunity in rabbits by coadministration of inactivated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Infection and Immunity. 66 (8), 3788-3795 (1998).
  18. Suckow, M. A., Bowersock, T. L., Nielsen, K., Grigdesby, C. F. Enhancement of respiratory immunity to Pasteurella multocida by cholera toxin in rabbits. Laboratory Animals. 30 (2), 120-126 (1996).
  19. Jarvinen, L. Z., HogenEsch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Intranasal vaccination of New Zealand white rabbits against pasteurellosis, using alginate-encapsulated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Comparative Medicine. 50 (3), 263-269 (2000).
  20. Winchell, J. M., Routray, S., Betts, P. W., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal and systemic antibody responses to a C4/V3 construct following DNA vaccination of rabbits via the Peyer's patch. The Journal of Infectious Diseases. 178 (3), 850-853 (1998).
  21. Wegmann, F., et al. A novel strategy for inducing enhanced mucosal HIV-1 antibody responses in an anti-inflammatory environment. PLoS One. 6 (1), 15861 (2011).
  22. Winchell, J. M., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal immune response to an HIV C4/V3 peptide following nasal or intestinal immunization of rabbits. AIDS Research and Human Retroviruses. 13 (10), 881-889 (1997).
  23. Knudsen, C., et al. Quantitative feed restriction rather than caloric restriction modulates the immune response of growing rabbits. The Journal of Nutrition. 145 (3), 483-489 (2015).
  24. Ciarlet, M., et al. Subunit rotavirus vaccine administered parenterally to rabbits induces active protective immunity. Journal of Virology. 72 (11), 9233-9246 (1998).
  25. Denchev, V., Mitov, I., Marinova, S., Linde, K. Local and systemic immune response in rabbits after intraintestinal immunization with a double-marker attenuated strain of Salmonella typhimurium. Journal of Hygiene, Epidemiology, Microbiology, and Immunology. 32 (4), 457-465 (1988).
  26. Watson, D. L. Immunological functions of the mammary gland and its secretion--comparative review. Australian Journal of Biological Sciences. 33 (4), 403-422 (1980).
  27. Lascelles, A. K., McDowell, G. H. Localized humoral immunity with particular reference to ruminants. Transplantation Reviews. 19, 170-208 (1974).
  28. Jones, D. I., et al. Optimized Mucosal Modified Vaccinia Virus Ankara Prime/Soluble gp120 Boost HIV Vaccination Regimen Induces Antibody Responses Similar to Those of an Intramuscular Regimen. Journal of Virology. 93 (14), (2019).
  29. Rabbit Tracks: Breeding Techniques and Management. Michigan State University. , Available from: https://www.canr.msu.edu/resources/rabit tracks breeding techniques and management (2020).
  30. Patton, N. M. The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. Ch. 2 27-45 (1994).
  31. Nowland, M. H., Brammer, D. W., Garcia, A., Rush, H. G. Laboratory Animal Medicine. Fox, J. G., et al. , Academic Press. Ch. 10 411-461 (2015).
  32. Attia, Y. A., Al-Hanoun, A., El-Din, A. E., Bovera, F., Shewika, Y. E. Effect of bee pollen levels on productive, reproductive and blood traits of NZW rabbits. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 95 (3), 294-303 (2011).
  33. Feussner, E. L., Lightkep, G. E., Hennesy, R. A., Hoberman, A. M., Christian, M. S. A decade of rabbit fertility data: study of historical control animals. Teratology. 46 (4), 349-365 (1992).
  34. Manal, A. F., Tony, M. A., Ezzo, O. H. Feed restriction of pregnant nulliparous rabbit does: consequences on reproductive performance and maternal behaviour. Animal Reproduction Science. 120 (1-4), 179-186 (2010).
  35. Marai, I. F., Ayyat, M. S., Abd el-Monem, U. M. Growth performance and reproductive traits at first parity of New Zealand white female rabbits as affected by heat stress and its alleviation under Egyptian conditions. Tropical Animal Health and Production. 33 (6), 451-462 (2001).
  36. Rodríguez, M., et al. A diet supplemented with n-3 polyunsaturated fatty acids influences the metabomscic and endocrine response of rabbit does and their offspring. Journal of Animal Science. 95 (6), 2690-2700 (2017).
  37. Salem, A. A., El-Shahawy, N. A., Shabaan, H. M., Kobeisy, M. Effect of punicalagin and human chorionic gonadotropin on body weight and reproductive traits in maiden rabbit does. Veterinary and Animal Science. 10, 100140 (2020).
  38. Sirotkin, A. V., Parkanyi, V., Pivko, J. High temperature impairs rabbit viability, feed consumption, growth and fecundity: examination of endocrine mechanisms. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106478 (2020).
  39. Sun, L., et al. Effect of light intensity on ovarian gene expression, reproductive performance and body weight of rabbit does. Animal Reproduction Science. 183, 118-125 (2017).
  40. El-Gayar, M., et al. Pregnancy detectuib ub rabbits by ultrasonography as compared to manual palpation. Egyptian Journal of Animal Production. 51 (3), 196-199 (2014).
  41. Nason, K. S., Binder, N. D., Labarta, J. I., Rosenfeld, R. G., Gargosky, S. E. IGF-II and IGF-binding proteins increase dramatically during rabbit pregnancy. The Journal of Endocrinology. 148 (1), 121-130 (1996).
  42. Haneda, R., et al. Changes in blood parameters in pregnant Japanese White rabbits. The Journal Toxicological Sciences. 35 (5), 773-778 (2010).
  43. Mizoguchi, Y., et al. Changes in blood parameters in New Zealand White rabbits during pregnancy. Laboratory Animals. 44 (1), 33-39 (2010).
  44. Salem, A. A., Gomaa, Y. A. Effect of combination vitamin E and single long-acting progesterone dose on enhancing pregnancy outcomes in the first two parities of young rabbit does. Animal Reproduction Science. 150 (1-2), 35-43 (2014).
  45. Maertens, L., Lebas, F., Szendro, Z. Rabbit milk: A review of quantity, quality and non-dietary affecting factors. World Rabbit Science. 14 (4), 205-230 (2006).
  46. Pekow, C. A. The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press. 243-258 (2012).
  47. Jenness, R. Lactational Performance of Various Mammalian-Species. Journal of Dairy Science. 69 (3), 869-885 (1986).
  48. Yoshiyama, Y., Brown, W. R. Specific antibodies to cholera toxin in rabbit milk are protective against Vibrio cholerae-induced intestinal secretion. Immunology. 61 (4), 543-547 (1987).
  49. Gwinn, W. M., et al. Effective induction of protective systemic immunity with nasally administered vaccines adjuvanted with IL-1. Vaccine. 28 (42), 6901-6914 (2010).
  50. Sloat, B. R., Cui, Z. Evaluation of the immune response induced by a nasal anthrax vaccine based on the protective antigen protein in anaesthetized and non-anaesthetized mice. Journal of Pharmcy and Pharmacology. 58 (4), 439-447 (2006).
  51. Janakova, L., et al. Influence of intravenous anesthesia on mucosal and systemic antibody responses to nasal vaccines. Infection and Immunity. 70 (10), 5479-5484 (2002).
  52. Fuentes, J. M., et al. General anesthesia delays the inflammatory response and increases survival for mice with endotoxic shock. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (2), 281-288 (2006).
  53. Lee, Y. -M., Song, B. C., Yeum, K. -J. Impact of Volatile Anesthetics on Oxidative Stress and Inflammation. BioMed Research International. 2015, 242709 (2015).

Tags

Иммунология и инфекции Выпуск 173 Иммунизация матерей Интраназальная иммунизация Иммунизация слизистой оболочки Сбор молока Кроличье молоко Oryctolagus cuniculus.
Интраназальная иммунизация и сбор молока в исследованиях материнской иммунизации у новозеландских белых кроликов (<em>Oryctolagus cuniculus</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing,… More

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter