Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intranasal immunisering og melkesamling i studier av mors immunisering i New Zealand hvite kaniner (Oryctolagus cuniculus)

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

Denne artikkelen beskriver og demonstrerer administrering av intranasale vaksiner og innsamling av melk fra lakterende kaniner (Oryctolagus cuniculus) som et middel til å vurdere mukosal immunitet i en oversettingsmessig passende modell for mors immunisering.

Abstract

På grunn av likheter i placentation og antistoffoverføring med mennesker, er kaniner en utmerket modell for mors immunisering. Ytterligere fordeler med denne forskningsmodellen er den enkle avl og prøvesamling, relativt kort svangerskapstid og store kullstørrelser. Ofte vurderte ruter for immunisering inkluderer subkutane, intramuskulære, intranasale og intradermale. Ikke-terminal prøvetaking for kronologisk deteksjon av immunologiske responser på disse immuniseringene inkluderer innsamling av blod, fra både dammer og sett, og melk fra lakterende gjør det. I denne artikkelen vil vi demonstrere teknikker laboratoriet vårt har brukt i studier av mors immunisering i New Zealand Hvite kaniner (Oryctolagus cuniculus), inkludert intranasal immunisering og melkesamling.

Introduction

Studier av mors immunisering og antistoffoverføring er uvurderlige av mange grunner, da dette er den første ruten for immunitetsoverføring og etterfølgende beskyttelse mot patogener og sykdommer hos nyfødte og spedbarn. Mors immunisering har potensial til å påvirke både mødre- og spedbarns-/barnehelsen positivt på globalt nivå ved å redusere sykelighet og dødelighet forbundet med visse patogener i denne sårbare perioden1. Hovedmålet med denne strategien er å øke nivåene av spesifikke mors antistoffer gjennom graviditet. Disse antistoffene kan deretter overføres til nyfødte og spedbarn på nivåer som er tilstrekkelige til å beskytte mot infeksjoner til immunforsvaret er modent nok til å reagere tilstrekkelig på utfordringer1,2,3. Tidligere arbeid har vist at høyere antistofftipper ved fødselen er forbundet med enten fullstendig beskyttelse eller forsinket utbrudd og redusert alvorlighetsgrad av mange forskjellige smittsomme sykdommer hos nyfødte, inkludert stivkrampe, pertussis, respiratorisk synytialvirus (RSV), influensa og gruppe B streptokokkinfeksjoner1,2,3.

Hos mennesker overføres mors antistoffer passivt over morkaken og overføres også gjennom morsmelk via sykepleie. Tidligere arbeid har vist at HIV-spesifikke IgA-nivåer i morsmelk hos mennesker fra mødre som er smittet med viruset, var forbundet med redusert postnatal overføring av viruset, noe som tyder på en beskyttende rolle for morsmelk anti-HIV IgA4. Studier hos ikke-menneskelige primater har vist at immunisering mot HIV kan indusere en betydelig antistoffrespons i morsmelken, og selv om lignende serum IgG-responser ble indusert etter systemisk versus mukosal immunisering, induserte mukosal immunisering en betydelig høyere IgA-respons i melken5,6.

Identifisering av en oversettelsesmessig passende dyremodell for disse studiene bør ta hensyn til placentation type og mekanismer for passiv antistoffoverføring, samt overføring av antistoffer gjennom morsmelk. Det er tre hovedtyper av placentation hos pattedyr basert på vevstyper og lag ved materno-fostergrensesnittet, inkludert hemochorial (primater, gnagere og kaniner), endotheliochorial (rovdyr) og epitheliochorial (hester, griser og drøvtyggere). Hemochorial placenta er den mest invasive typen, noe som muliggjør direkte kommunikasjon mellom mors blodtilførsel og korionen, eller den ytterste fostermembranen. Basert på antall trophoblastlag, er det flere variasjoner av hemochorial placentation, inkludert hemomonochorial placenta som finnes i primater, hemodichorial placenta hos kaniner, og hemotrichorial placenta observert hos rotter og mus7. Denne direkte kontakten mellom mors blodtilførsel og korion muliggjør passiv overføring av antistoffer over morkaken under svangerskapet. IgG er den eneste antistoffklassen som betydelig krysser den menneskeligemorkaken 8, mens IgA er den dominerende klassen av Ig som finnes i morsmelk hos mennesker9. Av de vitenskapelig relevante modellene overfører bare primater (inkludert mennesker), kaniner og marsvin IgG i utero og IgA i melken10,11. Derfor inneholder kaninmodellen faktorer som kan sammenlignes med de hos mennesker som kontrollerer transplacental overføring av IgG og laktasjonell overføring av IgA.

I tillegg til å tjene som en eksepsjonell modell for mors immunitet og vaksineutvikling, gjør likheter mellom kaninen og menneskelige nesehuler dem til en passende modell for intranasal immunisering. Volumet av kaninens nesehule er mer lik mennesker enn gnagermodeller basert på relativ kroppsmasse12. I tillegg viste Casteleyn et al. 12 at nese assosiert lymfoidvev (NALT) er mer voluminøst i kaninen sammenlignet med gnagere. NALT ligger hovedsakelig på det ventrale og ventromediale aspektet av det ventrale nesekjøttet og i det laterale og dorsolaterale aspektet av nasopharyngeal meatus hos kaniner, mens i gnagere er lymfoidvevet bare til stede langs det ventrale aspektet av nasopharyngeal meatus12. Hos kaniner er strukturen og plasseringen av intraepithelial og lamina propria lymfocytter, samt isolerte lymfoide follikler, lik mennesker12.

Ytterligere fordeler ved å bruke kaninen som modell for mors- og slimhinneimmunitet inkluderer deres høye fecundity og relativt kort svangerskapstid. Store auricular blodkar gir relativt enkel tilgang til store mengder blod for serielle samlinger. En rekke slimhinneprøver kan samles inn for antigenspesifikke antistoffresponsanalyser, inkludert morsmelk13 (ved amming), slimhinne sekresjoner eller vasker (f.eks. oral14,15,16, bronkoalveolar lavage13,17,18,19, vaginal20,21,22) og avføring20,23,24,25. Melkeprøver kan enkelt samles inn under amming for å vurdere tilstedeværelsen av antigenspesifikke antistoffresponser. Selv om det ikke er så rikelig som for mennesker og mus, er et bredt utvalg av eksperimentelle reagenser tilgjengelige for kaninspesifikke studier og analyser. I denne artikkelen vil vi beskrive og demonstrere intranasal immunisering og melkesamling i New Zealand Hvite kaniner (Oryctolagus cuniculus).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med Duke University IACUC retningslinjer.

MERK: Materialer som trengs finnes i materiallisten.

1. Kanin sedasjon og anestesi

  1. Sedate den kvinnelige kaninen (seksuelt moden; ca. 5-30 måneder gammel) ved å administrere acepromazin intramuskulært (IM) i en dose på 1 mg/kg. Avhengig av dyrets størrelse, bruk en 1 eller 3 ml sprøyte med en 25 G nål. Epaxial muskler er det foretrukne stedet for den intramuskulære injeksjonen.
    MERK: Acepromazin kan også administreres subkutant, men IM foretrekkes av laboratoriet, da det virker raskere og reduserer forekomsten av hudskader.
  2. Vent i 10-15 minutter slik at acepromazin trer i kraft.
  3. Bedøv kaninen med isofluran ved å plassere den tilkoblede nesekjeglen over dyrets nese. Juster fordamperen til opptil 4% isofluran kombinert med opptil 4 liter / minutt oksygen. Kaniner har høy aversjon mot isofluran, så tilstrekkelig selvbeherskelse er nødvendig når du maskerer dyret.
  4. Når du er fullstendig bedøvet, som vurdert av pinna, pedal og / eller palpebral refleks, bruk oftalmisk smøremiddel på hvert øye for å forhindre tørking av øynene og påfølgende hornhinnen sårdannelse.
  5. Overvåk kontinuerlig reflekser og pust under anestesi, og reduser isofluranhastigheten til 1-2% når et tilstrekkelig plan av anestesi er nådd.

2. Intranasal immunisering

  1. Forbered immuniseringsløsning før dyrehåndtering.
  2. Sedate kaninen som beskrevet ovenfor.
  3. Når labmedlemmet er klar til å administrere vaksinen og kaninen er i et tilstrekkelig plan av anestesi, slå av isofluran og oksygen og fjern nesekjeglen.
  4. Plasser kaninen i dorsal recumbency, og prop nakken og hodet i en omtrent 45 ° vinkel som gir enkel tilgang og visualisering av begge nares av labmedlemmet som administrerer vaksinen.
  5. Last pipetten med ikke mer enn 100 μL av vaksineløsningen, og administrer løsningen raskt i hvert nesebor. Pipetten skal holdes i omtrent 45° vinkel, vinklet mot medialaspektet av nesepassasjen.
    MERK: Målet med immunisering er at løsningen skal komme i kontakt med slimhinnen i nares, slik at spissen ikke skal plasseres i nares, da dette kan føre til slitasje eller irritasjon av slimhinnen vev og potensielt påvirke immunogenisiteten til den nasalt administrerte vaksinen. Vaksinen skal administreres raskt og gjøres på samme måte i den andre nare.
  6. Etter administrering i begge nesepassasjene, hold kaninen i dorsal liggende i 30 sekunder for å minimere lekkasje av vaksineløsningen.
    MERK: Laboratoriet vil vanligvis ikke administrere mer enn 100 μL per nesebor om gangen. Hvis et større volum skal administreres, med maksimalt 500 μL, kan vaksinen gis i 100 μL aliquots med en 30 sekunders hvileperiode mellom immuniseringer, og ytterligere administreringer av vaksine gjentatt, med 30 sekunder hvile mellom hver administrasjon, til det totale vaksinevolumet er levert.
  7. Etter immunisering, plasser kaninen på ventrum for utvinning og overvåk dyret nøye til det kan opprettholde sternal liggende.

3. Melk samling

  1. Sedate den lakterende kaninen som beskrevet ovenfor.
  2. Rengjør huden over den marginale ørevenen med alkoholpinnen/-kluten.
  3. Bruk en 1 ml sprøyte og 25 g kanyle, administrer ca. 1-2 IE oksytocin intravenøst via den marginale ørevenen for å indusere melkesluppe.
    MERK: På grunn av den glatte muskelavslapningen er det vanlig at kaninen urinerer eller avfeirer etter administrering av oksytocin.
  4. Etter administrering av oksytocin, bruk trykk på injeksjonsstedet med gasbindstykket.
  5. Mens du opprettholder anestesimasken over kaninens nese, kan du støtte kaninen på bakkvarterene.
    MERK: Melkekolleksjon kan også utføres med dyret i lateral heftelse, men laboratoriet finner at samlingen er lettere når kaninen er proppet opp på rumpa med en assistent som holder kaninen oppreist med anestesimasken.
  6. Åpne det sterile røret for å forberede melkeoppsamling og lokalisere pattedyrvevet og tilhørende teats. Smokkene er vanligvis omgitt av våt pels fra nyere sykepleie, og pattedyrvevet er lett håndgripelig når det er fullt av melk.
  7. Ta tak i brystvevet forbundet med en smokk mellom tommelen og pekefingeren og påfør et forsiktig, massasjetrykk på kjertevevet i retning av smokken. Plasser oppsamlingsrøret over smokken for å samle den uttrykte melken.
    MERK: Det kan noen ganger ta flere minutter før oksytocinet er effektivt, og melkeproduksjonen ser ut til å variere mellom brystkjertlene. Hvis melkeuttrykket ikke lykkes, vent flere minutter eller roter rundt til de ekstra brystkjertlene. Melk fra alle teats kan samles i samme hetteglass. Vanligvis kan flere milliliter melk lett samles fra en lakterende doe.
  8. Etter melkeoppsamling, slå av isofluran og oksygen, og la kaninen komme seg mens den overvåkes nøye til dyret er i stand til å opprettholde sternal liggende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En oversikt over en typisk mors intranasal immuniseringsstudiedesign er avbildet i figur 1, som inkluderer immuniseringer, avl, opptenning, amming og antistoffoverføring. Selv om det ikke er illustrert, bør blod samles inn før den første immuniseringen for baselinemålinger og gjennom resten av studien med jevne mellomrom. Blod oppnås lett via den sentrale ørearterien med mild sedasjon og et aktuelt smertestillende middel (f.eks. lidokain 2,5% og prilocaine 2,5% krem). Tilstedeværelsen av antigenspesifikke IgG-nivåer kan måles i disse prøvene. Kvinnelige kaniner immuniseres via intranasalruten, som beskrevet i protokollen og demonstrert i videoen. Avhengig av studien kan vaksinen kreve et løft eller må kanskje gis gjennom en ekstra rute (f.eks. intramuskulær eller subkutan). Etter studieinitiering blir kaniner avlet; vi foretrekker å kjøpe påviste oppdrettere fra leverandører til bruk for å sikre en høyere graviditetsrate for disse studiene. Avhengig av immuniseringstidslinjen kan kaniner få ytterligere immuniseringer gjennom hele svangerskapet. Antigenspesifikk IgG overføres transplacent til settene, og ca. 30-32 dager etter avl vil gravide tenne. Vi anbefaler å begrense håndteringen av sett de første dagene for å minimere avvisning fra gjør. Blodprøver kan samles inn fra settene for å vurdere antigenspesifikke IgG-nivåer som ble overført transplacentalt (figur 3). I tillegg til et bredt utvalg av næringsstoffer, får kits IgA fra lakterende doe mens sykepleie. Settene avvennes vanligvis på 4-8 uker, men før avvenning kan melk lett samles fra lakterende gjør, som vist i videoen. De innsamlede melkeprøvene kan deretter behandles for påvisning av totale og antigenspesifikke IgA-nivåer (figur 4). Avhengig av studien kan vaksiner (+/- boosts) administreres til settene, og serielle blodprøver kan samles inn fra settene i en svært tidlig alder ved hjelp av lateral saphenous vene.

For mors studier er det nyttig å bestemme graviditet så tidlig som mulig for studiedesignet og for å sikre at doe ikke trenger å bli rebred. Progesteronmålinger kan brukes som et middel til å oppdage graviditet. Som vist i figur 2, kan forhøyede progesteronnivåer oppdages hos gravide kaniner sammenlignet med ikke-gravide kaniner, selv etter at parringer med en dollar ble bekreftet for alle gjør det. Det finnes flere metoder for graviditetsdeteksjon, inkludert manuell palpasjon, ultralyd og radiografer; Disse krever imidlertid godt trent personlig og riktig utstyr.

Antigenspesifikk IgG som ble overført transplacentalt mens i utero kan måles i serum av sett. Blod kan samles fra et lite antall sett på eller i nærheten av fødselstidspunktet for å vurdere tidlige antigenspesifikke antistoffnivåer, men seriell blodoppsamling er teknisk mye lettere ettersom settene alder og økning er størrelse. Som avbildet i figur 3,kan serumnivåer av antigenspesifikk IgG i settene måles av ELISA og sammenlignes med mors nivå. Maternalt overførtE IgG-nivåer har en tendens til å være høyere ved fødselen og reduseres over tid.

Som en type slimhinneprøve kan melk samles inn og behandles for å måle totale eller antigenspesifikke antistoffnivåer. Som vist i figur 4utgjør IgA en betydelig del av de totale antistoffnivåene i morsmelken som overføres til settene via amming. Våre resultater viser at morsmelk IgA produserer et litt høyere ELISA-signal (relative lysenheter, RLU) sammenlignet med IgG, og både IgA og IgG produserer et signal som er mye høyere enn signalet for IgM. Disse resultatene er enige med resultater fra andre som antyder at kaninmelk inneholder rundt 4,5 mg/ml IgA, 2,4 mg/ml IgG og 0,1 mg/ml IgM26,27.

Figure 1
Figur 1. Eksempel tidslinje for en mors intranasal immunisering studie design i en kanin (Oryctolagus cuniculus) modell. Kvinnelige kaniner immuniseres via intranasalruten, som beskrevet i protokollen og demonstrert i videoen. Avhengig av studien kan vaksinen kreve et løft eller må kanskje gis gjennom en ekstra rute (f.eks. intramuskulær eller subkutan). Kaniner blir deretter avlet. Antigenspesifikk IgG overføres transplacent til settene, og ca. 30-32 dager etter avl vil gravide tenne. IgA overføres til settene fra lakterende doe mens sykepleie. Før avvenning kan melk lett samles fra lakterende gjør for å vurdere totalt og antigen-spesifikke IgA nivåer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Progesteronnivåer hos gravide og ikke-gravide kaniner ved 3 uker etter avl. Blod ble samlet inn fra kaniner ved 3 uker etter avl. Kaniner ble bekreftet enten gravide eller ikke-gravide basert på evne til å kindle et søppel på 30-32 dager etter avl. Serum progesteronnivåer ble målt gjennom Michigan State University Veterinary Diagnostic Laboratory ved hjelp av en chemiluminescent immunoassay (CLIA) med et immunoassay system (f.eks. Siemens Healthineers IMMULITE 2000). Feilfelt representerer standardfeil av gjennomsnittet, og prøvestørrelsen besto av 4-6 kaniner per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Antigenspesifikke IgG-nivåer i sett (i forhold til mors nivåer) ved fødselen og ved 3 ukers alder etter en rekke mors immuniseringer. Blod ble samlet inn fra gjør og sett kort tid etter opptennende og ved 3 ukers alder. Antigenspesifikke IgG-nivåer i serumet ble påvist ved hjelp av en fluorescerende ELISA som tidligere beskrevet28. Antigenspesifikk IgG er plottet som et forhold mellom nivåer som oppdages i kit serum og mors serum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. En sammenligning av IgA-, IgM- og IgG-nivåer i kaninmelk. Kaninmelk ble samlet som beskrevet og demonstrert i videoen. Melk ble behandlet med en lang sentrifugering (13.000 x g i 4,5 timer ved 4 °C), og det klare mellomlaget ble isolert etter behandling. Totalt IgA-, IgG- og IgM-nivå ble målt i dette klare laget av fluorescerende ELISA som tidligere beskrevet28, bortsett fra at platene var belagt med henholdsvis polyklonal anti-IgA, anti-IgG eller anti-IgM for å oppdage total kanin IgA, IgG eller IgM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om det ikke er beskrevet i ovennevnte protokoll, er vellykket avl av kaninene nødvendig for denne morsmodellen og for å tillate melkeoppsamling. Kaniner blir lett avlet av levende deksel i en forskningsinnstilling. Det anbefales at det overføres til bukkens bur for avl, som det kan være territorialt og aggressivt hvis det holdes i sitt eget bur med bukken. Hvis kvinner ikke er mottakelige etter 15 minutter (som indikert ved å løpe bort biting eller vokalisering), bør doe plasseres tilbake i sitt eget bur. Det er flere informative videoer og opplæringsprogrammer om kaninavl som kan observeres online29, men etter avl vil hanen vanligvis falle over og kan vokalisere. Når dette er observert, kan doe returneres til buret hennes. En dollar kan avle 2-3 ganger om dagen uten reduksjon i sædkvaliteten30. I vår IACUC-godkjente protokoll er bukker begrenset til avl 10-12 gjør per uke og leveres minst to hviledager per uke, da kilder sier at en enkelt dollar vanligvis er tilstrekkelig til å betjene 10-15 gjør31. Vår gruppe foreslår å kjøpe påviste oppdrettere fra leverandøren for å forbedre avlssuksessraten. Som kaniner er indusert ovulatorer og eggløsning oppstår vanligvis 10-13 timer etter kopiering31, har vi opplevd en høyere grad av graviditet i gjør som er avlet om morgenen og deretter igjen om ettermiddagen, eller to ganger innenfor det 10-13 timers vinduet (observert økning fra 75% til 95% suksessrate, upublisert). Basert på litteraturen varierer typiske hekkesuksessrater fra 57-100%32,33,34,35,36,37,38,39,40og kullstørrelser i gjennomsnitt ca 7-9 sett31.

Å bestemme graviditet så tidlig som mulig er nyttig i mors studier for å bekrefte at doe ikke trenger å bli rebred eller fjernet fra studien. Alternativer for graviditet deteksjon inkluderer palpasjon (så tidlig som 14 dager)31, ultralyd (så tidlig som 5-9 dager)40, radiografer (så tidlig som dag 11)31, vektøkning og molekylære teknikker, for eksempel målinger av insulinvekstfaktorer41 (IGF) og progesteron34,37,38,42,43. Tidligere arbeid har indikert betydelige høyder av IGF-II nivåer hos gravide kaniner sammenlignet med nivåer hos ikke-gravide kaniner41. Men i våre hender klarte vi ikke å oppdage en forskjell i IGF-II-nivåer mellom gravide og ikke-gravide kaniner (upublisert). Som tilstrekkelig progesteron nivåer er nødvendig for vedlikehold av graviditet hos kaniner37,44, flere studier har vurdert progesteron nivåer hos gravide kaniner og vist forhøyede nivåer i forhold til ikke-gravide kaniner, spesielt under organogenese rundt midten av svangerskapet34,43,44. Vår gruppe var ikke i stand til å oppdage forskjeller i progesteronnivåer ved hjelp av en ELISA mellom gravide og ikke-gravide kaniner, men foreløpige resultater ved hjelp av en automatisert chemiluminescent analyse ved Michigan State University Veterinary Diagnostic Laboratory indikerer forhøyede progesteronnivåer hos gravide kaniner sammenlignet med ikke-gravide kaniner, selv etter at parringer med en dollar ble bekreftet for alle vurdert (Figur 2).

Lakterende kan produsere ca. 250 ml, eller 60 ml/kg, melk daglig45,46, noe som gjør det mulig for store volumer for eksperimentelle analyser å vurdere totale og antigenspesifikke antistoffresponser/konsentrasjoner. Kaninmelk inneholder høye nivåer av fett og protein, som inneholder 2 og 3 ganger mer konsentrerte nivåer av fett og protein, sammenlignet med ku og såmelk, henholdsvis45,47. På grunn av det høye fettinnholdet i melken krever prøvene betydelig behandling, avhengig av analysene som skal utføres. Etter sentrifugering av melkeprøven skilles tre forskjellige lag ut, inkludert cellene i bunnlaget, klart mellomlag som inneholder immunglobuliner og fett i topplaget48. Immunglobuliner, innenfor det klare mellomlaget, er tilstede ved høye konsentrasjoner i kolostrum og melk og består hovedsakelig av IgA, IgG og IgM (figur 4). Selv om melkeprøver lett samles for hånd, og dette er vår foretrukne teknikk i laboratoriet, har vakuumsystemer også blitt rapportert i litteraturen13,46,48. Yoshiyama et al.48 samlet melkeprøver ved hjelp av negativt trykk og beskrev en lang sentrifugering (15 000 x g i 4 timer) for separasjon av melkelagene før de passerte det klare mellomlaget gjennom en Sepharose 4B-kolonne for fjerning av immunglobulin. Ved hjelp av denne metoden var forfattere i stand til å oppdage koleratoksinspesifikke antistoffer i kaninmelken til oralt immuniserte kaniner på tilstrekkelige nivåer for beskyttelse mot Vibrio koleraeindusertsekresjon i tarmen48. Peri et al.13 bearbeidede melkeprøver samlet inn ved aspirasjon med et vannvakuumsystem ved sentrifugering ved 4 °C i 2 timer ved 24 000 x g. I denne studien var forfattere i stand til å oppdage anti-RSV IgA i kolostrum, melk og bronkial- og tarmsekretjoner etter mukosal immunisering (oral eller intratrakeal), men ikke intravenøs immunisering, mens anti-RSV IgG ble påvist i kolostrum, melk og serum uavhengig av immuniseringsrute13.

Det bør utvises forsiktighet under intranasal immuniseringsprosedyren for å bekrefte at kaninen er i et tilstrekkelig anestesiplan og for å unngå å administrere store mengder vaksine samtidig. Tidligere arbeid fra vår gruppe har vist at effekten av intranasal immunisering ble påvirket av bruk av anestesi49. Spesielt dyp anestesi indusert av kombinasjonen av ketamin og xylazin korrelert med økt immunogenisitet av den neseadministrerte vaksinen og forbedret neseretensjon av løsningen. Disse nivåene var betydelig høyere enn oppbevaring og immunogenisitet hos kaniner intranasalt immunisert etter sedasjon med acepromazin og butorphanol49. Lignende funn er også vist etter intranasal immunisering hos mus50,51. I tillegg viste vårt arbeid økt immunogenisitet etter intranasal immunisering under dypbedøvelse over dyr som var helt våken og over dyr som gjennomgikk kortere varighet anestesi med en kombinasjon av acepromazin og isofluran. Denne forskjellen i IgG-immunogenisitet mellom dyp kontra kortere varighet anestesi var signifikant på 42 dagers tid, men ikke på 56 dagers tidspunkt. Selv om økt immunogenisitet og oppbevaring kan skyldes dypere anestesi, krevde kaniner minst 30 minutter å gjenopprette; mens kaniner var oppreist og mobile innen 5 minutter etter å ha mottatt nesevaksinen etter den kortere varigheten isofluranindusert anestesi. Selv om anestesi kanskje ikke er ideell for å etterligne den kliniske innstillingen for intranasal immunisering hos mennesker, kan en anestesi med kortere varighet (f.eks. isofluran) foretrekkes fremfor en lengre, dyp anestesi med injiserbare midler (f.eks. ketamin + xylazin). Bruken av en dyremodell, som vist i Gwinn et al.49, vil ofte kreve bruk av sedasjon eller anestesi for å muliggjøre sikker dyrehåndtering og effektiv og konsistent vaksinelevering. En potensiell begrensning for anestesibruk med vaksineadministrasjon i dyremodeller er dens effekt på dyrets evne til å indusere en passende immunrespons på vaksinen. Interessant nok antyder rapporter i litteraturen at isofluran kan dempe systemiske inflammatoriske responser, gi beskyttelse mot utfordringer52 og redusere oksidativt stress og betennelse53.

Med hensyn til minimering av vaksinetap og tilstrekkelig intranasal levering, anbefaler vår gruppe en hvileperiode på 30 sekunder etter administrering av hvert aliquot av intranasalvaksinen for å tillate oppbevaring av løsningen i nesehulen og for å forhindre at løsningen siver ut fra neseborene hvis kaninen umiddelbart plasseres i sternal recumbency og returneres til buret. I tillegg er det viktig å begrense volumet av aliquot administrert for å sikre intranasal immunisering, da slimhinneabsorpsjon er begrenset av neseområdet. Hvis et stort volum administreres, kan løsningen omgå neseslimhinnen og resultere i innåndings- eller mageimmunisering. Vår gruppe anbefaler aliquots på 100 μL per nesebor med et maksimalt intranasalt volum på 500 μL.

Denne artikkelen fokuserer på mucosal vaksine levering, spesielt via intranasal rute, men det er flere metoder for immunisering, både mucosal og parenteral som har blitt demonstrert hos kaniner. Disse ekstra metodene inkluderer, men er ikke begrenset til, orale, subkutane, intramuskulære og intradermale. Som sådan varierer prøver som skal samles inn og vurderes, basert på eksperimentelle mål og trasé for immunisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne Divisjon for laboratorie dyreressurser ved Duke University og deres husdyrholdsteam for deres hjelp og stor omsorg gitt til dyrene. I tillegg vil forfatterne gjerne gjenkjenne PhotoPath-teamet i Avdeling for patologi for deres hjelp med lyd- og videodelene av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av skjønnsmessige forskningsmidler fra Staats-laboratoriet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz, F. M. Current Challenges and Achievements in Maternal Immunization Research. Frontiers in Immunology. 9, 436 (2018).
  2. Kachikis, A., Englund, J. A. Maternal immunization: Optimizing protection for the mother and infant. The Journal of Infection. 72, Suppl 83-90 (2016).
  3. Omer, S. B. Maternal Immunization. The New England Journal of Medicine. 376 (13), 1256-1267 (2017).
  4. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. , 01560 (2015).
  5. Fouda, G. G. A., et al. Mucosal Immunization of Lactating Female Rhesus Monkeys with a Transmitted/Founder HIV-1 Envelope Induces Strong Env-Specific IgA Antibody Responses in Breast Milk. Journal of Virology. 87 (12), 6986-6999 (2013).
  6. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces Robust IgA-Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
  7. Furukawa, S., Kuroda, Y., Sugiyama, A. A comparison of the histological structure of the placenta in experimental animals. Journal of Toxicologic Pathology. 27 (1), 11-18 (2014).
  8. Palmeira, P., Quinello, C., Silveira-Lessa, A. L., Zago, C. A., Carneiro-Sampaio, M. IgG placental transfer in healthy and pathological pregnancies. Clinical & Developmental Immunology. 2012, 985646 (2012).
  9. Macchiaverni, P., et al. Mother to child transfer of IgG and IgA antibodies against Dermatophagoides pteronyssinus. Scandinavian Journal of Immunology. 74 (6), 619-627 (2011).
  10. Pentsuk, N., vander Laan, J. W. An interspecies comparison of placental antibody transfer: new insights into developmental toxicity testing of monoclonal antibodies. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 86 (4), 328-344 (2009).
  11. Butler, J. E., Rainard, P., Lippolis, J., Salmon, H., Kacskovics, I., et al. Mucosal Immunology. Mestecky, J., et al. , Academic Press. Ch. 116 2269-2306 (2015).
  12. Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Vanden Broeck, W. NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit. Veterinary Immunology Immunopathology. 133 (2-4), 212-218 (2010).
  13. Peri, B. A., et al. Antibody content of rabbit milk and serum following inhalation or ingestion of respiratory syncytial virus and bovine serum albumin. Clinical and Experimental Immunology. 48 (1), 91-101 (1982).
  14. Fukuizumi, T., Inoue, H., Tsujisawa, T., Uchiyama, C. Tonsillar application of killed Streptococcus mutans induces specific antibodies in rabbit saliva and blood plasma without inducing a cross-reacting antibody to human cardiac muscle. Infection and Immunity. 65 (11), 4558-4563 (1997).
  15. Saeed, M. I., Omar, A. R., Hussein, M. Z., Elkhidir, I. M., Sekawi, Z. Development of enhanced antibody response toward dual delivery of nano-adjuvant adsorbed human Enterovirus-71 vaccine encapsulated carrier. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (10), 2414-2424 (2015).
  16. Ma, Y., et al. Vaccine delivery to the oral cavity using coated microneedles induces systemic and mucosal immunity. Pharmaceutical Research. 31 (9), 2393-2403 (2014).
  17. Jarvinen, L. Z., Hogenesch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Induction of protective immunity in rabbits by coadministration of inactivated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Infection and Immunity. 66 (8), 3788-3795 (1998).
  18. Suckow, M. A., Bowersock, T. L., Nielsen, K., Grigdesby, C. F. Enhancement of respiratory immunity to Pasteurella multocida by cholera toxin in rabbits. Laboratory Animals. 30 (2), 120-126 (1996).
  19. Jarvinen, L. Z., HogenEsch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Intranasal vaccination of New Zealand white rabbits against pasteurellosis, using alginate-encapsulated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Comparative Medicine. 50 (3), 263-269 (2000).
  20. Winchell, J. M., Routray, S., Betts, P. W., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal and systemic antibody responses to a C4/V3 construct following DNA vaccination of rabbits via the Peyer's patch. The Journal of Infectious Diseases. 178 (3), 850-853 (1998).
  21. Wegmann, F., et al. A novel strategy for inducing enhanced mucosal HIV-1 antibody responses in an anti-inflammatory environment. PLoS One. 6 (1), 15861 (2011).
  22. Winchell, J. M., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal immune response to an HIV C4/V3 peptide following nasal or intestinal immunization of rabbits. AIDS Research and Human Retroviruses. 13 (10), 881-889 (1997).
  23. Knudsen, C., et al. Quantitative feed restriction rather than caloric restriction modulates the immune response of growing rabbits. The Journal of Nutrition. 145 (3), 483-489 (2015).
  24. Ciarlet, M., et al. Subunit rotavirus vaccine administered parenterally to rabbits induces active protective immunity. Journal of Virology. 72 (11), 9233-9246 (1998).
  25. Denchev, V., Mitov, I., Marinova, S., Linde, K. Local and systemic immune response in rabbits after intraintestinal immunization with a double-marker attenuated strain of Salmonella typhimurium. Journal of Hygiene, Epidemiology, Microbiology, and Immunology. 32 (4), 457-465 (1988).
  26. Watson, D. L. Immunological functions of the mammary gland and its secretion--comparative review. Australian Journal of Biological Sciences. 33 (4), 403-422 (1980).
  27. Lascelles, A. K., McDowell, G. H. Localized humoral immunity with particular reference to ruminants. Transplantation Reviews. 19, 170-208 (1974).
  28. Jones, D. I., et al. Optimized Mucosal Modified Vaccinia Virus Ankara Prime/Soluble gp120 Boost HIV Vaccination Regimen Induces Antibody Responses Similar to Those of an Intramuscular Regimen. Journal of Virology. 93 (14), (2019).
  29. Rabbit Tracks: Breeding Techniques and Management. Michigan State University. , Available from: https://www.canr.msu.edu/resources/rabit tracks breeding techniques and management (2020).
  30. Patton, N. M. The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. Ch. 2 27-45 (1994).
  31. Nowland, M. H., Brammer, D. W., Garcia, A., Rush, H. G. Laboratory Animal Medicine. Fox, J. G., et al. , Academic Press. Ch. 10 411-461 (2015).
  32. Attia, Y. A., Al-Hanoun, A., El-Din, A. E., Bovera, F., Shewika, Y. E. Effect of bee pollen levels on productive, reproductive and blood traits of NZW rabbits. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 95 (3), 294-303 (2011).
  33. Feussner, E. L., Lightkep, G. E., Hennesy, R. A., Hoberman, A. M., Christian, M. S. A decade of rabbit fertility data: study of historical control animals. Teratology. 46 (4), 349-365 (1992).
  34. Manal, A. F., Tony, M. A., Ezzo, O. H. Feed restriction of pregnant nulliparous rabbit does: consequences on reproductive performance and maternal behaviour. Animal Reproduction Science. 120 (1-4), 179-186 (2010).
  35. Marai, I. F., Ayyat, M. S., Abd el-Monem, U. M. Growth performance and reproductive traits at first parity of New Zealand white female rabbits as affected by heat stress and its alleviation under Egyptian conditions. Tropical Animal Health and Production. 33 (6), 451-462 (2001).
  36. Rodríguez, M., et al. A diet supplemented with n-3 polyunsaturated fatty acids influences the metabomscic and endocrine response of rabbit does and their offspring. Journal of Animal Science. 95 (6), 2690-2700 (2017).
  37. Salem, A. A., El-Shahawy, N. A., Shabaan, H. M., Kobeisy, M. Effect of punicalagin and human chorionic gonadotropin on body weight and reproductive traits in maiden rabbit does. Veterinary and Animal Science. 10, 100140 (2020).
  38. Sirotkin, A. V., Parkanyi, V., Pivko, J. High temperature impairs rabbit viability, feed consumption, growth and fecundity: examination of endocrine mechanisms. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106478 (2020).
  39. Sun, L., et al. Effect of light intensity on ovarian gene expression, reproductive performance and body weight of rabbit does. Animal Reproduction Science. 183, 118-125 (2017).
  40. El-Gayar, M., et al. Pregnancy detectuib ub rabbits by ultrasonography as compared to manual palpation. Egyptian Journal of Animal Production. 51 (3), 196-199 (2014).
  41. Nason, K. S., Binder, N. D., Labarta, J. I., Rosenfeld, R. G., Gargosky, S. E. IGF-II and IGF-binding proteins increase dramatically during rabbit pregnancy. The Journal of Endocrinology. 148 (1), 121-130 (1996).
  42. Haneda, R., et al. Changes in blood parameters in pregnant Japanese White rabbits. The Journal Toxicological Sciences. 35 (5), 773-778 (2010).
  43. Mizoguchi, Y., et al. Changes in blood parameters in New Zealand White rabbits during pregnancy. Laboratory Animals. 44 (1), 33-39 (2010).
  44. Salem, A. A., Gomaa, Y. A. Effect of combination vitamin E and single long-acting progesterone dose on enhancing pregnancy outcomes in the first two parities of young rabbit does. Animal Reproduction Science. 150 (1-2), 35-43 (2014).
  45. Maertens, L., Lebas, F., Szendro, Z. Rabbit milk: A review of quantity, quality and non-dietary affecting factors. World Rabbit Science. 14 (4), 205-230 (2006).
  46. Pekow, C. A. The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press. 243-258 (2012).
  47. Jenness, R. Lactational Performance of Various Mammalian-Species. Journal of Dairy Science. 69 (3), 869-885 (1986).
  48. Yoshiyama, Y., Brown, W. R. Specific antibodies to cholera toxin in rabbit milk are protective against Vibrio cholerae-induced intestinal secretion. Immunology. 61 (4), 543-547 (1987).
  49. Gwinn, W. M., et al. Effective induction of protective systemic immunity with nasally administered vaccines adjuvanted with IL-1. Vaccine. 28 (42), 6901-6914 (2010).
  50. Sloat, B. R., Cui, Z. Evaluation of the immune response induced by a nasal anthrax vaccine based on the protective antigen protein in anaesthetized and non-anaesthetized mice. Journal of Pharmcy and Pharmacology. 58 (4), 439-447 (2006).
  51. Janakova, L., et al. Influence of intravenous anesthesia on mucosal and systemic antibody responses to nasal vaccines. Infection and Immunity. 70 (10), 5479-5484 (2002).
  52. Fuentes, J. M., et al. General anesthesia delays the inflammatory response and increases survival for mice with endotoxic shock. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (2), 281-288 (2006).
  53. Lee, Y. -M., Song, B. C., Yeum, K. -J. Impact of Volatile Anesthetics on Oxidative Stress and Inflammation. BioMed Research International. 2015, 242709 (2015).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 173 Maternal immunisering Intranasal immunisering Mucosal immunisering Melk samling Kanin melk Oryctolagus cuniculus.
Intranasal immunisering og melkesamling i studier av mors immunisering i New Zealand hvite kaniner (<em>Oryctolagus cuniculus</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing,… More

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter