Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intranasal immunisering og mælkeindsamling i undersøgelser af mødres immunisering hos newzealandske hvide kaniner (Oryctolagus cuniculus)

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

Denne artikel beskriver og demonstrerer indgift af intranasale vacciner og indsamling af mælk fra ammende kaniner (Oryctolagus cuniculus) som et middel til at vurdere slimhindeimmunitet i en translationelt passende model for moderens immunisering.

Abstract

På grund af ligheder i placentation og antistofoverførsel med mennesker er kaniner en fremragende model for moderimmunisering. Yderligere fordele ved denne forskningsmodel er den lette avl og prøvesamling, relativt kort drægtighedsperiode og store kuldstørrelser. Almindeligt vurderede immuniseringsveje omfatter subkutane, intramuskulære, intranasale og intradermale. Nonterminal prøve indsamling til kronologisk påvisning af immunologiske reaktioner på disse immuniseringer omfatter indsamling af blod, fra både dæmninger og kits, og mælk fra amning gør. I denne artikel vil vi demonstrere teknikker, som vores laboratorium har brugt i undersøgelser af moderimpusation hos New Zealand Hvide kaniner (Oryctolagus cuniculus), herunder intranasal immunisering og mælkeindsamling.

Introduction

Undersøgelser af moderens immunisering og antistofoverførsel er uvurderlige af mange grunde, da dette er den første vej til immunitetsoverførsel og efterfølgende beskyttelse mod patogener og sygdomme hos nyfødte og spædbørn. Immunisering af mødre har potentiale til at have en positiv indvirkning på både mødres og spædbørns sundhed på globalt plan ved at reducere sygelighed og dødelighed i forbindelse med visse patogener i denne sårbare periode1. Hovedformålet med denne strategi er at øge niveauet af specifikke moderantistoffer under hele graviditeten. Disse antistoffer kan derefter overføres til den nyfødte og spædbarn på niveauer, der er tilstrækkelige til at beskytte modinfektioner,indtil deres immunsystem er modent nok til at reagere tilstrækkeligt på udfordringer1,2,3. Tidligere arbejde har vist, at højere antistoftitler ved fødslen er forbundet med enten fuldstændig beskyttelse eller en forsinket debut og reduceret sværhedsgrad af mange forskellige smitsomme sygdomme hos den nyfødte, herunder stivkrampe, pertussis, respiratorisk syncytial virus (RSV), influenza og gruppe B streptokokinfektioner1,2,3.

Hos mennesker overføres moderantistoffer passivt over moderkagen og overføres også gennem modermælken via sygepleje. Tidligere arbejde har vist, at HIV-specifikke IgA-niveauer i modermælk fra mødre smittet med virus var forbundet med reduceret postnatal overførsel af virus, hvilket tyder på en beskyttende rolle for modermælk anti-HIV IgA4. Undersøgelser i ikke-menneskelige primater har vist, at immunisering mod HIV kan fremkalde en signifikant antistofrespons i modermælken, og selv om lignende serum-IgG-reaktioner blev induceret efter systemisk versus slimhindevaccination, fremkaldte slimhindevaccination en betydeligt højere IgA-respons i mælken5,6.

Ved identifikationen af en translationelt passende dyremodel for disse undersøgelser bør der tages hensyn til moderkagetypen og mekanismerne for passiv overførsel af antistoffer samt overførsel af antistoffer gennem modermælk. Der er tre hovedtyper af placentation hos pattedyr baseret på vævstyper og lag på materno-føtal interface, herunder hemochorial (primater, gnavere og kaniner), endotheliochorial (kødædende dyr), og epitheliochorial (heste, svin og drøvtyggere). Den hemochoriale moderkage er den mest invasive type, der giver mulighed for direkte kommunikation mellem moderens blodforsyning og chorion, eller den yderste fostermembran. Baseret på antallet af trophoblast lag, der er flere variationer af hemochorial placentation, herunder hæmomonochorial placenta findes i primater, den hæmodale moderkage hos kaniner, og hæmotrichorial placenta observeret hos rotter og mus7. Denne direkte kontakt mellem moderens blodforsyning og chorion giver mulighed for passiv overførsel af antistoffer på tværs af moderkagen under svangerskabet. IgG er den eneste antistofklasse, der i væsentlig grad krydser den menneskelige moderkage8, mens IgA er den fremherskende klasse af Ig, der findes i modermælk9. Af de videnskabeligt relevante modeller overfører kun primater (herunder mennesker), kaniner og marsvin IgG i livmoderen og IgA i mælken10,11. Derfor indeholder kaninmodellen faktorer, der kan sammenlignes med dem hos mennesker, der styrer transplacental overførsel af IgG og amningsoverførsel af IgA.

Ud over at tjene som en ekstraordinær model for moderens immunitet og vaccine udvikling, ligheder mellem kanin og menneskelige næsehulen gør dem til en passende model for intranasal immunisering. Mængden af kaninens næsehulrum ligner mere mennesker end gnavermodeller baseret på relativ kropsmasse12. Derudover viste Casteleyn et al. 12, at det nasal-associerede lymfoide væv (NALT) er mere voluminøst i kaninen sammenlignet med gnavere. NALT er primært placeret på det ventrale og ventromediale aspekt af ventral nasal meatus og på det laterale og dorsolaterale aspekt af nasopharyngeal meatus hos kaniner, mens lymfoidvævet i gnavere kun er til stede langs det ventrale aspekt af nasopharyngeal meatus12. Hos kaniner ligner strukturen og placeringen af intraepithelial og lamina propria lymfocytter samt de isolerede lymfoidsække som mennesker12.

Yderligere fordele ved at bruge kaninen som model for moderens og slimhindeimmunitet omfatter deres høje fecundity og relativt korte drægtighedsperiode. Store auricular blodkar giver mulighed for relativt nem adgang til store mængder blod til serielle samlinger. Der kan indsamles en række slimhindeprøver til antigenspecifikke antistofresponsanalyser herunder modermælk13 (ved amning), slimhindesekretioner eller -vaske (f.eks. oral14,15,16, bronchoalveolar lavage13,17,18,19, vaginal20,21,22) og afføring20,23,24,25. Mælkeprøver kan let indsamles under amning for at vurdere tilstedeværelsen af antigenspecifikke antistofresponser. Selvom det ikke er så rigeligt som for mennesker og mus, en bred vifte af eksperimentelle reagenser er tilgængelige for kanin-specifikke undersøgelser og assays. I denne artikel vil vi beskrive og demonstrere intranasal immunisering og mælkeindsamling i New Zealand Hvide kaniner (Oryctolagus cuniculus).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt og udført i overensstemmelse med Duke University IACUC's politik.

BEMÆRK: De nødvendige materialer findes i materialeoversigten.

1. Kanin sedation og anæstesi

  1. Bedøve den kvindelige kanin (seksuelt moden; ca. 5-30 måneder gammel) ved at administrere acepromazine intramuskulært (IM) ved en dosis på 1 mg/kg. Afhængigt af dyrets størrelse skal du bruge en 1 eller 3 mL sprøjte med en 25 G nål. Epaxial muskler er det foretrukne sted for intramuskulær injektion.
    BEMÆRK: Acepromazine kan også administreres subkutant, men IM foretrækkes af laboratoriet, da det virker hurtigere og reducerer forekomsten af hudlæsioner.
  2. Vent 10-15 minutter, så acepromazinen kan træde i kraft.
  3. Bedøve kaninen med isoflurane ved at placere den tilsluttede næsekegler over dyrets næse. Juster fordamperen til op til 4% isoflurane kombineret med op til 4 liter / minut ilt. Kaniner har en høj modvilje mod isoflurane, så tilstrækkelig tilbageholdenhed er nødvendig, når dyret maskeres.
  4. Når den er fuldt bedøvet, som vurderet af pinna, pedal, og / eller palpebral refleks, anvende oftalmisk smøremiddel til hvert øje for at forhindre tørring af øjnene og efterfølgende hornhindesår.
  5. Løbende overvåge reflekser og vejrtrækning under anæstesi, og reducere isoflurane sats til 1-2%, når et passende plan for anæstesi er nået.

2. Intranasal immunisering

  1. Forbered immuniseringsopløsning inden håndtering af dyr.
  2. Adstad kaninen som beskrevet ovenfor.
  3. Når laboratoriemedlemmet er klar til at administrere vaccinen, og kaninen er i et passende anæstesiplan, skal du slukke for isofluranen og ilten og fjerne næsekeflen.
  4. Placer kaninen i dorsal recumbency, og prop hals og hoved i en omtrentlig 45 ° vinkel, der giver nem adgang til og visualisering af begge nares af lab medlem administrere vaccinen.
  5. Rørtten må ikke fyldes mere end 100 μL af vaccineopløsningen, og opløsningen skal hurtigt administreres i hvert næsebor. Pipetten skal holdes i en omtrentlig vinkel på 45°, vinklet mod det mediale aspekt af næsepassagen.
    BEMÆRK: Målet med immunisering er, at opløsningen skal kontakte slimhinden i narerne, så spidsen bør ikke placeres i narerne, da dette kan resultere i slid eller irritation af slimhindevævet og potentielt påvirke immunogeniciteten af den nasally-administrerede vaccine. Vaccinen skal administreres hurtigt og gøres på samme måde i den anden nare.
  6. Efter administration i begge næsepassager skal kaninen opretholdes i dorsal recumbency i 30 sekunder for at minimere lækage af vaccineopløsningen.
    BEMÆRK: Laboratoriet vil typisk ikke administrere mere end 100 μL per næsebor ad gangen. Hvis der skal gives et større volumen med en maksimal samlet hvileperiode på 500 μL, kan vaccinen gives i 100 μL aliquots med en hvileperiode på 30 sekunder mellem vaccinationer og yderligere administrationer af vaccine gentaget med 30 sekunders hvile mellem hver indgift, indtil det samlede vaccinevolumen er leveret.
  7. Efter immunisering skal du placere kaninen på ventrum til genopretning og nøje overvåge dyret, indtil det kan opretholde sternal recumbency.

3. Indsamling af mælk

  1. Adstadig den ammende kanin som beskrevet ovenfor.
  2. Rengør huden over den marginale øreåre med alkoholprøven/-aftørringen.
  3. Ved hjælp af en 1 ml sprøjte og 25 g nål, administrere ca 1-2 IE af oxytocin intravenøst via den marginale øre vene til at fremkalde mælk letdown.
    BEMÆRK: På grund af den glatte muskelafslapning er det almindeligt, at kaninen tisser eller afføring efter administration af oxytocin.
  4. Efter oxytocin administration, lægge pres på injektionsstedet med det stykke gaze.
  5. Mens du opretholder anæstesimasken over kaninens næse, skal du støtte kaninen på bagfjerdingerne.
    BEMÆRK: Mælkeindsamling kan også udføres med dyret i lateral recumbency, men laboratoriet finder ud af, at indsamling er lettere, når kaninen støttes op på sin gump med en assistent, der holder kaninen oprejst med anæstesimasken.
  6. Åbn det sterile rør for at forberede mælkeopsamlingen og find brystvævet og tilhørende patter. Patterne er typisk omgivet af våd pels fra nyere sygepleje, og brystvævet er let håndgribeligt, når det er fuld af mælk.
  7. Tag fat i brystvævet forbundet med en patte mellem tommelfingeren og pegefingeren og påfør et blidt, masserende tryk på kirtelvævet i retning af patten. Placer opsamlingsrøret over patten for at indsamle den udtrykte mælk.
    BEMÆRK: Det kan nogle gange tage flere minutter for oxytocin at være effektiv, og mælkeproduktionen synes at variere blandt brystkirtlerne. Hvis mælkeudtrykket ikke lykkes, skal du vente flere minutter eller rotere rundt til de ekstra brystkirtler. Mælk fra alle patter kan opsamles i samme hætteglas. Typisk kan flere milliliter mælk let indsamles fra en ammende doe.
  8. Efter mælkeopsamlingen skal du slukke isofluranen og ilten og lade kaninen komme sig, mens den overvåges nøje, indtil dyret er i stand til at opretholde sternal recumbency.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En oversigt over en typisk maternel intranasal immunisering undersøgelse design er afbildet i figur 1, der omfatter immuniseringer, avl, optænding, amning, og antistof overførsel. Selv om det ikke er illustreret, bør blodet indsamles forud for den første immunisering for baseline målinger og i hele resten af undersøgelsen med jævne mellemrum. Blod opnås let via den centrale ørearterie med mild sedation og et aktuelt smertestillende middel (f.eks. lidocain 2,5% og prilocain 2,5% fløde). Tilstedeværelsen af antigenspecifikke IgG-niveauer kan måles i disse prøver. Kvindelige kaniner immuniseres via intranasal ruten, som beskrevet i protokollen og demonstreret i videoen. Afhængigt af undersøgelsen kan vaccinen kræve et løft eller skal muligvis gives ad en ekstra vej (f.eks. intramuskulær eller subkutan). Efter undersøgelsesstart opdrættes kaniner; vi foretrækker at købe dokumenterede opdrættere fra leverandører til brug for at sikre en højere graviditet sats for disse undersøgelser. Afhængigt af immunisering tidslinjen, kaniner kan modtage yderligere vaccinationer under hele graviditeten. Antigenspecifik IgG overføres transplacentally til kits, og på ca 30-32 dage efter avl, gravid gør vil fænge. Vi anbefaler, at du begrænser håndteringen af kits i de første mange dage for at minimere afvisningen fra gør. Blodprøver kan indsamles fra sættene for at vurdere antigenspecifikke IgG-niveauer, der blev overført transplacentally (Figur 3). Ud over en bred vifte af næringsstoffer, kits modtage IgA fra ammende doe, mens sygepleje. Kits er typisk fravænnede på 4-8 uger, men før fravænning, mælk kan nemt indsamles fra amning gør, som det fremgår af videoen. De indsamlede mælkeprøver kan derefter forarbejdes til påvisning af totale og antigenspecifikke IgA-niveauer (figur 4). Afhængigt af undersøgelsen, vacciner (+ / - boosts) kan gives til kits, og serielle blodprøver kan indsamles fra kits i en meget tidlig alder ved hjælp af lateral saphenous vene.

For mødre undersøgelser, bestemmelse graviditet så tidligt som muligt er nyttigt for undersøgelsen design og for at sikre doe behøver ikke at blive rebred. Progesteron målinger kan bruges som et middel til at opdage graviditet. Som vist i figur 2, forhøjede progesteron niveauer kan påvises hos gravide kaniner i forhold til ikke-gravide kaniner, selv efter parringer med en sorteper blev bekræftet for alle gør. Der er yderligere metoder til graviditetsdetektering, herunder manuel palpation, ultralyd og røntgenbilleder; Disse kræver dog veluddannet personligt og korrekt udstyr.

Antigenspecifik IgG, der blev overført transplacentally mens in utero kan måles i serum af kits. Blod kan indsamles fra et lille antal kits på eller nær tidspunktet for fødslen til at vurdere tidlige antigen-specifikke antistof niveauer, men seriel blodopsamling er teknisk meget lettere som kits alder og stigning er størrelse. Som vist i figur 3kan serumniveauer af antigenspecifik IgG i sættene måles ved HJÆLPISA og sammenlignet med moderniveauerne. Maternally overført IgG niveauer tendens til at være højere ved fødslen og falde over tid.

Som en type slimhindeprøve kan mælk opsamles og forarbejdes til måling af total- eller antigenspecifikke antistofniveauer. Som det fremgår af figur 4, udgør IgA en betydelig del af det samlede antistofniveau i modermælken, som overføres til sættene via amning. Vores resultater viser, at modermælk IgA producerer et lidt højere ELISA-signal (relative lysenheder, RLU) sammenlignet med IgG, og både IgA og IgG producerer et signal, der er meget højere end signalet for IgM. Disse resultater er i overensstemmelse med resultaterne fra andre, der tyder på, at kaninmælk indeholder omkring 4,5 mg/mL IgA, 2,4 mg/mL IgG og 0,1 mg/mL IgM26,27.

Figure 1
Figur 1. Prøve tidslinje for en maternel intranasal immunisering undersøgelse design i en kanin (Oryctolagus cuniculus) model. Kvindelige kaniner immuniseres via intranasal ruten, som beskrevet i protokollen og demonstreret i videoen. Afhængigt af undersøgelsen kan vaccinen kræve et løft eller skal muligvis gives ad en ekstra vej (f.eks. intramuskulær eller subkutan). Kaniner opdrættes derefter. Antigenspecifik IgG overføres transplacentally til kits, og på ca 30-32 dage efter avl, gravid gør vil fænge. IgA er videregivet til kits fra ammende doe, mens sygepleje. Før fravænning kan mælk nemt opsamles fra amningsdåserne for at vurdere det samlede og antigenspecifikke IgA-niveau. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Progesteronniveauer hos gravide og ikke-gravide kaniner efter 3 uger efter avl. Blod blev indsamlet fra kaniner på 3 uger efter avl. Kaniner blev bekræftet enten gravide eller ikke-gravide baseret på evnen til at tænde et kuld på 30-32 dage efter avl. Serum progesteron niveauer blev målt gennem Michigan State University Veterinary Diagnostic Laboratory ved hjælp af en chemiluminescent immunoassay (CLIA) med en immunoassay system (f.eks Siemens Healthineers IMMULITE 2000). Fejllinjer repræsenterer standardfejl i middelværdien, og stikprøvestørrelsen bestod af 4-6 kaniner pr. gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Antigenspecifikke IgG-niveauer i kits (i forhold til moderens niveauer) ved fødslen og ved 3 ugers alder efter en række moderlige vaccinationer. Blod blev indsamlet fra gør og kits kort efter optænding og på 3 uger. Antigenspecifikke IgG-niveauer i serumet blev påvist ved hjælp af en fluorescerende ELISA som tidligere beskrevet28. Antigenspecifik IgG afbildes som et forhold mellem niveauer, der påvises i kitserum og moderens serum. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. En sammenligning af IgA-, IgM- og IgG-niveauer i kaninmælk. Kaninmælk blev indsamlet som beskrevet og demonstreret i videoen. Mælk blev forarbejdet ved en lang centrifugering (13.000 x g i 4,5 timer ved 4 °C), og det klare mellemlag blev isoleret efter forarbejdning. IgA-, IgG- og IgM-niveauerne i alt blev målt i dette klare lag ved fluorescerende ELISA som tidligere beskrevet28, bortset fra at pladerne var belagt med henholdsvis polyklonal anti-IgA, anti-IgG eller anti-IgM for at detektere det samlede kanin-IgA, IgG eller IgM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selvom det ikke er beskrevet i ovenstående protokol, er vellykket opdræt af kaninerne nødvendig for denne modermodel og for at give mulighed for mælkeindsamling. Kaniner opdrættes let af levende dækning i en forskningsindstilling. Det anbefales, at der overføres til sorteper bur til avl, som gør kan være territoriale og aggressive, hvis de holdes i deres eget bur med sorteper. Hvis hunnerne ikke er modtagelige efter 15 minutter (som angivet ved at løbe væk bidende, eller vocalizing), skal doe placeres tilbage i sit eget bur. Der er flere informative videoer og tutorials om kaninavl, der kan observeres online29, men efter avl vil hanen typisk falde over og kan vokalisere. Når dette er observeret, kan doe returneres til hendes bur. En sorteper kan opdrætte 2-3 gange om dagen uden fald i sædkvalitet30. I vores IACUC-godkendte protokol, bukke er begrænset til avl 10-12 gør om ugen og leveres mindst to hviledage om ugen, som kilder, at en enkelt sorteper er normalt tilstrækkelig til at servicere 10-15 gør31. Vores gruppe foreslår at købe dokumenterede opdrættere fra sælgeren for at forbedre avlssuccesraten. Da kaniner induceres ægulatorer, og ægløsning typisk forekommer 10-13 timer efter kopulation31, har vi oplevet en højere graviditetsrate i gør det opdrættes om morgenen og derefter igen om eftermiddagen eller to gange inden for det 10-13 timers vindue (observeret stigning fra 75% til 95% succesrate, ikke offentliggjort). Baseret på litteraturen varierer typiske avlssuccesrater fra 57-100%32,33,34,35,36,37,38,39,40og kuldstørrelser i gennemsnit ca. 7-9 kits31.

Bestemmelse af graviditet så tidligt som muligt er nyttigt i moderundersøgelser for at bekræfte, at doe ikke behøver at blive rebred eller fjernet fra undersøgelsen. Muligheder for graviditet afsløring omfatter palpation (så tidligt som 14 dage)31, ultralyd (så tidligt som 5-9 dage)40, røntgenbilleder (så tidligt som dag 11)31, vægtøgning, og molekylære teknikker, såsom målinger af insulin-vækstfaktorer41 (IGF) og progesteron34,37,38,42,43. Tidligere arbejde har indikeret betydelige stigninger i IGF-II-niveauer hos gravide kaniner sammenlignet med niveauer hos ikke-gravide kaniner41. Men i vores hænder var vi ikke i stand til at opdage en forskel i IGF-II-niveauer mellem gravide og ikke-gravide kaniner (ikke offentliggjort). Da der er behov for passende progesteronniveauer til opretholdelse af graviditet hos kaniner37,44, har flere undersøgelser vurderet progesteronniveauer hos gravide kaniner og påvist forhøjede niveauer i forhold til ikke-gravide kaniner , især under organogenese omkring midten af svangerskabet34,43,44. Vores gruppe var ikke i stand til at opdage forskelle i progesteron niveauer ved hjælp af en ELISA mellem gravide og ikke-gravide kaniner, men foreløbige resultater ved hjælp af en automatiseret chemiluminescent assay på Michigan State University Veterinary Diagnostic Laboratory viser forhøjede progesteron niveauer hos gravide kaniner i forhold til ikke-gravide kaniner, selv efter parringer af en sorteper blev bekræftet for alle ikke vurderes(Figur 2).

Amning kan producere ca. 250 mL eller 60 mL/kg mælk dagligt45,46, hvilket giver mulighed for store mængder for eksperimentelle assays til vurdering af totale og antigenspecifikke antistofresponser/koncentrationer. Kaninmælk indeholder høje niveauer af fedt og protein, der indeholder 2 og 3 gange mere koncentrerede niveauer af fedt og protein, sammenlignet med ko og så mælk, henholdsvis45,47. På grund af det høje fedtindhold i mælken kræver prøverne betydelig behandling, afhængigt af de assays, der skal udføres. Efter centrifugering af mælkeprøven adskilles tre forskellige lag, herunder cellerne i det nederste lag, klart mellemlag, der indeholder immunoglobulinerne, og fedt i det øverste lag48. Immunoglobuliner er inden for det klare mellemlag til stede ved høje koncentrationer inden for råmælk og mælk og består primært af IgA, IgG og IgM (figur 4). Selvom mælkeprøver let indsamles i hånden, og dette er vores foretrukne teknik i laboratoriet, vakuumsystemer er også blevet rapporteret i litteraturen13,46,48. Yoshiyama et al.48 indsamlede mælkeprøver ved hjælp af undertryk og beskrev en lang centrifugering (15.000 x g i 4 timer) til adskillelse af mælkelagene, inden det klare mellemlag passerede gennem en Sepharose 4B-kolonne til fjernelse af immunglobulin. Ved hjælp af denne metode var forfatterne i stand til at opdage koleratoksinspecifikke antistoffer i kaninmælken hos oralt immuniserede kaniner på tilstrækkelige niveauer til beskyttelse mod Vibrio cholerae-induceret sekretion i tarmen48. 13 forarbejdede mælkeprøver indsamlet ved aspiration med vandvakuumsystem ved centrifugering ved 4 °C i 2 timer ved 24.000 x g. I denne undersøgelse var forfatterne i stand til at opdage anti-RSV IgA i råmælk, mælk og bronchiale og intestinale sekreter efter slimhindevaccination (oral eller intratracheal), men ikke intravenøs immunisering, mens anti-RSV IgG blev påvist i råmælk, mælk og serum uanset immuniseringsvej13.

Der bør under intranasal immuniseringsproceduren udvises om, at kaninen befinder sig i et passende anæstesiplan, og at store mængder vaccine undgås på én gang. Tidligere arbejde fra vores gruppe har vist, at effekten af intranasal immunisering var påvirket af brugen af anæstesi49. Specifikt, dyb anæstesi fremkaldt af kombinationen af ketamin og xylazin korreleret med øget immunogenicitet af nasally administreret vaccine og forbedret nasal fastholdelse af opløsningen. Disse niveauer var betydeligt højere end fastholdelse og immunogenicitet hos kaniner intranasalt immuniseret efter sedation med acepromazine og butorphanol49. Lignende fund er også blevet påvist efter intranasal immunisering hos mus50,51. Derudover viste vores arbejde øget immunogenicitet efter intranasal immunisering under den dybe anæstesi over dyr, der var helt vågne og over dyr, der gennemgår kortere varighed anæstesi med en kombination af acepromazine og isoflurane. Denne forskel i IgG immunogenicitet mellem dyb versus kortere varighed anæstesi var signifikant på 42 dages tid punkt, men ikke på 56 dages tid punkt. Selv om øget immunogenicitet og fastholdelse kan skyldes den dybere anæstesi, krævede kaniner mindst 30 minutter at komme sig; der henviser til, kaniner var oprejst og mobil inden for 5 minutter efter at have modtaget nasal vaccine efter den kortere varighed isoflurane-induceret anæstesi. Selv om anæstesi måske ikke er ideel til at efterligne den kliniske indstilling for intranasal immunisering hos mennesker, en kortere varighed anæstesi (f.eks isoflurane) kan foretrækkes frem for en længere, dyb anæstesi med injicerbare midler (f.eks ketamin + xylazin). Brugen af en dyremodel, som det fremgår af Gwinn et al.49, vil ofte kræve brug af sedation eller anæstesi for at muliggøre sikker dyrehåndtering og effektiv og konsekvent vaccinelevering. En potentiel begrænsning for anæstesi brug med vaccine administration i dyremodeller er dens virkning på dyrets evne til at fremkalde en passende immunrespons på vaccinen. Interessant nok tyder rapporter i litteraturen på, at isoflurane kan dæmpe systemiske inflammatoriske reaktioner, yde beskyttelse mod udfordringer52 og reducere oxidativ stress ogbetændelse 53.

Med hensyn til minimering af vaccinetab og tilstrækkelig intranasal levering anbefaler vores gruppe en hvileperiode på 30 sekunder efter administration af hver aliquot af intranasal vaccinen for at give mulighed for opbevaring af opløsningen i næsehulen og for at forhindre opløsningen i at sive ud fra næseborene, hvis kaninen straks placeres i strengtal recumbency og returneres til buret. Derudover er det vigtigt at begrænse mængden af den aliquot, der administreres for at sikre intranasal immunisering, da slimhindeabsorptionen er begrænset af næsepassagens overfladeareal. Hvis der gives et stort volumen, kan opløsningen omgå næseslimhinden og resultere i indåndings- eller mavevaccination. Vores gruppe anbefaler aliquots på 100 μL per næsebor med et maksimalt intranasalt volumen på 500 μL.

Denne artikel fokuserer på levering af slimhindevaccine, specifikt via intranasal ruten, men der er flere metoder til immunisering, både slimhinde og parenteral, der er blevet påvist hos kaniner. Disse yderligere metoder omfatter, men er ikke begrænset til, oral, subkutan, intramuskulær og intradermal. Som sådan varierer prøver, der skal indsamles og vurderes, baseret på de eksperimentelle mål og immuniseringsvejen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Division of Laboratory Animal Resources på Duke University og deres opdræt team for deres hjælp og stor omhu til dyrene. Derudover vil forfatterne gerne genkende PhotoPath-teamet i Institut for Patologi for deres hjælp med lyd- og videodelene af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af skønsmæssige forskningsmidler fra Staats-laboratoriet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz, F. M. Current Challenges and Achievements in Maternal Immunization Research. Frontiers in Immunology. 9, 436 (2018).
  2. Kachikis, A., Englund, J. A. Maternal immunization: Optimizing protection for the mother and infant. The Journal of Infection. 72, Suppl 83-90 (2016).
  3. Omer, S. B. Maternal Immunization. The New England Journal of Medicine. 376 (13), 1256-1267 (2017).
  4. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. , 01560 (2015).
  5. Fouda, G. G. A., et al. Mucosal Immunization of Lactating Female Rhesus Monkeys with a Transmitted/Founder HIV-1 Envelope Induces Strong Env-Specific IgA Antibody Responses in Breast Milk. Journal of Virology. 87 (12), 6986-6999 (2013).
  6. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces Robust IgA-Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
  7. Furukawa, S., Kuroda, Y., Sugiyama, A. A comparison of the histological structure of the placenta in experimental animals. Journal of Toxicologic Pathology. 27 (1), 11-18 (2014).
  8. Palmeira, P., Quinello, C., Silveira-Lessa, A. L., Zago, C. A., Carneiro-Sampaio, M. IgG placental transfer in healthy and pathological pregnancies. Clinical & Developmental Immunology. 2012, 985646 (2012).
  9. Macchiaverni, P., et al. Mother to child transfer of IgG and IgA antibodies against Dermatophagoides pteronyssinus. Scandinavian Journal of Immunology. 74 (6), 619-627 (2011).
  10. Pentsuk, N., vander Laan, J. W. An interspecies comparison of placental antibody transfer: new insights into developmental toxicity testing of monoclonal antibodies. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 86 (4), 328-344 (2009).
  11. Butler, J. E., Rainard, P., Lippolis, J., Salmon, H., Kacskovics, I., et al. Mucosal Immunology. Mestecky, J., et al. , Academic Press. Ch. 116 2269-2306 (2015).
  12. Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Vanden Broeck, W. NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit. Veterinary Immunology Immunopathology. 133 (2-4), 212-218 (2010).
  13. Peri, B. A., et al. Antibody content of rabbit milk and serum following inhalation or ingestion of respiratory syncytial virus and bovine serum albumin. Clinical and Experimental Immunology. 48 (1), 91-101 (1982).
  14. Fukuizumi, T., Inoue, H., Tsujisawa, T., Uchiyama, C. Tonsillar application of killed Streptococcus mutans induces specific antibodies in rabbit saliva and blood plasma without inducing a cross-reacting antibody to human cardiac muscle. Infection and Immunity. 65 (11), 4558-4563 (1997).
  15. Saeed, M. I., Omar, A. R., Hussein, M. Z., Elkhidir, I. M., Sekawi, Z. Development of enhanced antibody response toward dual delivery of nano-adjuvant adsorbed human Enterovirus-71 vaccine encapsulated carrier. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (10), 2414-2424 (2015).
  16. Ma, Y., et al. Vaccine delivery to the oral cavity using coated microneedles induces systemic and mucosal immunity. Pharmaceutical Research. 31 (9), 2393-2403 (2014).
  17. Jarvinen, L. Z., Hogenesch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Induction of protective immunity in rabbits by coadministration of inactivated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Infection and Immunity. 66 (8), 3788-3795 (1998).
  18. Suckow, M. A., Bowersock, T. L., Nielsen, K., Grigdesby, C. F. Enhancement of respiratory immunity to Pasteurella multocida by cholera toxin in rabbits. Laboratory Animals. 30 (2), 120-126 (1996).
  19. Jarvinen, L. Z., HogenEsch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Intranasal vaccination of New Zealand white rabbits against pasteurellosis, using alginate-encapsulated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Comparative Medicine. 50 (3), 263-269 (2000).
  20. Winchell, J. M., Routray, S., Betts, P. W., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal and systemic antibody responses to a C4/V3 construct following DNA vaccination of rabbits via the Peyer's patch. The Journal of Infectious Diseases. 178 (3), 850-853 (1998).
  21. Wegmann, F., et al. A novel strategy for inducing enhanced mucosal HIV-1 antibody responses in an anti-inflammatory environment. PLoS One. 6 (1), 15861 (2011).
  22. Winchell, J. M., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal immune response to an HIV C4/V3 peptide following nasal or intestinal immunization of rabbits. AIDS Research and Human Retroviruses. 13 (10), 881-889 (1997).
  23. Knudsen, C., et al. Quantitative feed restriction rather than caloric restriction modulates the immune response of growing rabbits. The Journal of Nutrition. 145 (3), 483-489 (2015).
  24. Ciarlet, M., et al. Subunit rotavirus vaccine administered parenterally to rabbits induces active protective immunity. Journal of Virology. 72 (11), 9233-9246 (1998).
  25. Denchev, V., Mitov, I., Marinova, S., Linde, K. Local and systemic immune response in rabbits after intraintestinal immunization with a double-marker attenuated strain of Salmonella typhimurium. Journal of Hygiene, Epidemiology, Microbiology, and Immunology. 32 (4), 457-465 (1988).
  26. Watson, D. L. Immunological functions of the mammary gland and its secretion--comparative review. Australian Journal of Biological Sciences. 33 (4), 403-422 (1980).
  27. Lascelles, A. K., McDowell, G. H. Localized humoral immunity with particular reference to ruminants. Transplantation Reviews. 19, 170-208 (1974).
  28. Jones, D. I., et al. Optimized Mucosal Modified Vaccinia Virus Ankara Prime/Soluble gp120 Boost HIV Vaccination Regimen Induces Antibody Responses Similar to Those of an Intramuscular Regimen. Journal of Virology. 93 (14), (2019).
  29. Rabbit Tracks: Breeding Techniques and Management. Michigan State University. , Available from: https://www.canr.msu.edu/resources/rabit tracks breeding techniques and management (2020).
  30. Patton, N. M. The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. Ch. 2 27-45 (1994).
  31. Nowland, M. H., Brammer, D. W., Garcia, A., Rush, H. G. Laboratory Animal Medicine. Fox, J. G., et al. , Academic Press. Ch. 10 411-461 (2015).
  32. Attia, Y. A., Al-Hanoun, A., El-Din, A. E., Bovera, F., Shewika, Y. E. Effect of bee pollen levels on productive, reproductive and blood traits of NZW rabbits. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 95 (3), 294-303 (2011).
  33. Feussner, E. L., Lightkep, G. E., Hennesy, R. A., Hoberman, A. M., Christian, M. S. A decade of rabbit fertility data: study of historical control animals. Teratology. 46 (4), 349-365 (1992).
  34. Manal, A. F., Tony, M. A., Ezzo, O. H. Feed restriction of pregnant nulliparous rabbit does: consequences on reproductive performance and maternal behaviour. Animal Reproduction Science. 120 (1-4), 179-186 (2010).
  35. Marai, I. F., Ayyat, M. S., Abd el-Monem, U. M. Growth performance and reproductive traits at first parity of New Zealand white female rabbits as affected by heat stress and its alleviation under Egyptian conditions. Tropical Animal Health and Production. 33 (6), 451-462 (2001).
  36. Rodríguez, M., et al. A diet supplemented with n-3 polyunsaturated fatty acids influences the metabomscic and endocrine response of rabbit does and their offspring. Journal of Animal Science. 95 (6), 2690-2700 (2017).
  37. Salem, A. A., El-Shahawy, N. A., Shabaan, H. M., Kobeisy, M. Effect of punicalagin and human chorionic gonadotropin on body weight and reproductive traits in maiden rabbit does. Veterinary and Animal Science. 10, 100140 (2020).
  38. Sirotkin, A. V., Parkanyi, V., Pivko, J. High temperature impairs rabbit viability, feed consumption, growth and fecundity: examination of endocrine mechanisms. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106478 (2020).
  39. Sun, L., et al. Effect of light intensity on ovarian gene expression, reproductive performance and body weight of rabbit does. Animal Reproduction Science. 183, 118-125 (2017).
  40. El-Gayar, M., et al. Pregnancy detectuib ub rabbits by ultrasonography as compared to manual palpation. Egyptian Journal of Animal Production. 51 (3), 196-199 (2014).
  41. Nason, K. S., Binder, N. D., Labarta, J. I., Rosenfeld, R. G., Gargosky, S. E. IGF-II and IGF-binding proteins increase dramatically during rabbit pregnancy. The Journal of Endocrinology. 148 (1), 121-130 (1996).
  42. Haneda, R., et al. Changes in blood parameters in pregnant Japanese White rabbits. The Journal Toxicological Sciences. 35 (5), 773-778 (2010).
  43. Mizoguchi, Y., et al. Changes in blood parameters in New Zealand White rabbits during pregnancy. Laboratory Animals. 44 (1), 33-39 (2010).
  44. Salem, A. A., Gomaa, Y. A. Effect of combination vitamin E and single long-acting progesterone dose on enhancing pregnancy outcomes in the first two parities of young rabbit does. Animal Reproduction Science. 150 (1-2), 35-43 (2014).
  45. Maertens, L., Lebas, F., Szendro, Z. Rabbit milk: A review of quantity, quality and non-dietary affecting factors. World Rabbit Science. 14 (4), 205-230 (2006).
  46. Pekow, C. A. The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press. 243-258 (2012).
  47. Jenness, R. Lactational Performance of Various Mammalian-Species. Journal of Dairy Science. 69 (3), 869-885 (1986).
  48. Yoshiyama, Y., Brown, W. R. Specific antibodies to cholera toxin in rabbit milk are protective against Vibrio cholerae-induced intestinal secretion. Immunology. 61 (4), 543-547 (1987).
  49. Gwinn, W. M., et al. Effective induction of protective systemic immunity with nasally administered vaccines adjuvanted with IL-1. Vaccine. 28 (42), 6901-6914 (2010).
  50. Sloat, B. R., Cui, Z. Evaluation of the immune response induced by a nasal anthrax vaccine based on the protective antigen protein in anaesthetized and non-anaesthetized mice. Journal of Pharmcy and Pharmacology. 58 (4), 439-447 (2006).
  51. Janakova, L., et al. Influence of intravenous anesthesia on mucosal and systemic antibody responses to nasal vaccines. Infection and Immunity. 70 (10), 5479-5484 (2002).
  52. Fuentes, J. M., et al. General anesthesia delays the inflammatory response and increases survival for mice with endotoxic shock. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (2), 281-288 (2006).
  53. Lee, Y. -M., Song, B. C., Yeum, K. -J. Impact of Volatile Anesthetics on Oxidative Stress and Inflammation. BioMed Research International. 2015, 242709 (2015).

Tags

Immunologi og infektion Maternal immunisering Intranasal immunisering Slimhindevaccination Mælkeindsamling Kaninmælk Oryctolagus cuniculus.
Intranasal immunisering og mælkeindsamling i undersøgelser af mødres immunisering hos newzealandske hvide kaniner (<em>Oryctolagus cuniculus</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing,… More

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter