Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Yeni Zelanda Beyaz Tavşanlarında Anne Bağışıklama Çalışmalarında İntranazal Bağışıklama ve Süt Toplama (Oryctolagus cuniculus)

Published: July 31, 2021 doi: 10.3791/62317
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 2,3,4
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Summary

Bu makale, intranazal aşıların ve emziren tavşanlardan(Oryctolagus cuniculus)süt toplanmasının, dil bağışıklığını çeviriye uygun bir anne bağışıklama modelinde değerlendirmenin bir yolu olarak tanımlanmaktadır ve göstermektedir.

Abstract

Plasentasyon ve insanlarla antikor transferinde benzerlikler nedeniyle, tavşanlar mükemmel bir anne bağışıklama modelidir. Bu araştırma modelinin ek avantajları üreme ve numune toplama kolaylığı, nispeten kısa gebelik süresi ve büyük çöp boyutlarıdır. Yaygın olarak değerlendirilen bağışıklama yolları deri altı, intramüsküler, intranazal ve intradermaldir. Bu bağışıklamalara verilen immünolojik yanıtların kronolojik olarak tespiti için nonterminal örnek toplama, hem barajlardan hem de kitlerden kan toplanması ve emzirmeden elde edilen sütü içerir. Bu yazıda, laboratuvarımızın Yeni Zelanda'da anne bağışıklama çalışmalarında kullandığı teknikleri göstereceğiz Beyaz tavşanlar (Oryctolagus cuniculus), intranazal bağışıklama ve süt toplama dahil.

Introduction

Anne bağışıklama ve antikor transferi çalışmaları, bağışıklık transferinin ilk yolu ve daha sonra yenidoğanlarda ve bebeklerde patojenlerden ve hastalıklardan korunma olduğu için birçok nedenden dolayı paha biçilmezdir. Maternal bağışıklama, bu hassas dönemde belirli patojenlerle ilişkili morbidite ve mortaliteyi azaltarak küresel düzeyde hem anne hem de bebek/çocuk sağlığını olumlu yönde etkileme potansiyeline sahiptir1. Bu stratejinin temel amacı, gebelik boyunca spesifik maternal antikor seviyelerini artırmaktır. Bu antikorlar daha sonra yenidoğan ve bebeğe, bağışıklık sistemleri zorluklara yeterince yanıt verebilecek kadar olgunlaşana kadar enfeksiyonlara karşı koruyacak kadar yeterli seviyelerde aktarılabilir1,2,3. Önceki çalışmalar, doğumda daha yüksek antikor titrelerinin, tetanoz, boğmaç, solunum senksiyal virüsü (RSV), grip ve B grubu streptokok enfeksiyonları1,2,3dahil olmak üzere yenidoğanda çok sayıda farklı bulaşıcı hastalığın tam korunması veya gecikmeli başlangıcı ve azaltılmış şiddeti ile ilişkili olduğunu göstermiştir.

İnsanlarda, anne antikorları plasnta boyunca pasif olarak aktarılır ve ayrıca emzirme yoluyla anne sütü yoluyla aktarılır. Önceki çalışmalar, virüsle enfekte olmuş annelerden insan anne sütündeki HIV'e özgü IgA seviyelerinin virüsün doğum sonrası bulaşmasının azalmasıyla ilişkili olduğunu göstermiştir, bu da anne sütü anti-HIV IgA4için koruyucu bir rol önermektedir. İnsan olmayan primatlarda yapılan çalışmalar, HIV'e karşı bağışıklamanın anne sütünde önemli bir antikor yanıtına neden olabileceğini göstermiştir ve benzer serum IgG yanıtları sistemik ve mukozal bağışıklamadan sonra indüklenmiş olsa da, mukozal bağışıklama süt içinde önemli ölçüde daha yüksek bir IgA yanıtına neden oldu5,6.

Bu çalışmalar için çeviriye uygun bir hayvan modelinin belirlenmesi, pasif antikor transferinin plasentasyon türünü ve mekanizmalarını ve ayrıca antikorların anne sütü yoluyla transferini dikkate almalıdır. Memelilerde, hemochorial (primatlar, kemirgenler ve tavşanlar), endoteliochorial (etoburlar) ve epitelochorial (atlar, domuzlar ve ruminantlar) dahil olmak üzere, materno-fetal arayüzdeki doku tiplerine ve katmanlarına dayanan üç ana plasentasyon türü vardır. Hemokorial plasenta, anne kan kaynağı ve koroyon veya en dış fetal membran arasında doğrudan iletişime izin sağlayan en invaziv tiptir. Trophoblast katmanlarının sayısına bağlı olarak, primatlarda bulunan hemomonochorial plasenta, tavşanlarda hemodikhorial plasenta ve sıçanlarda ve farelerde gözlenen hemotrichorial plasenta dahil olmak üzere hemochorial plasentasyonun çeşitli varyasyonları vardır7. Anne kan akışı ve koroyon arasındaki bu doğrudan temas, gebelik sırasında antikorların plaseta boyunca pasif olarak aktarılmasını sağlar. IgG, insan plaseta8'iönemli ölçüde geçen tek antikor sınıfıdır, oysa IgA, insan anne sütünde bulunan baskın Ig sınıfıdır9. Bilimsel olarak ilgili modellerden sadece primatlar (insanlar dahil), tavşanlar ve kobaylar IgG'yi rahim ve IgA'yı sütte aktarır 10,11. Bu nedenle, tavşan modeli, IgG'nin transplacental transferini ve IgA'nın laktasyonsal transferini kontrol eden insanlardakilerle karşılaştırılabilir faktörleri içerir.

Anne bağışıklığı ve aşı gelişimi için olağanüstü bir model olarak hizmet lanmasının yanı sıra, tavşan ve insan burun boşlukları arasındaki benzerlikler onları intranazal bağışıklama için uygun bir model haline getirir. Tavşan burun boşluğunun hacmi, göreceli vücut kütlesine dayanan kemirgen modellerinden daha insanlara daha benzer12. Ek olarak, Casteleyn ve ark. 12, burun ilişkili lenfoid dokunun (NALT) tavşanda kemirgenlere kıyasla daha hacimli olduğunu göstermiştir. NALT öncelikle ventral burun meatusunun ventral ve ventromedial yönünde ve tavşanlarda nazofarengeal meatus'un lateral ve dorsolateral yönünde bulunurken, kemirgenlerde lenfoid doku sadece nazofarengeal meatus12'ninventral yönü boyunca bulunur. Tavşanlarda, intraepithelial ve lamina propria lenfositlerin ve izole lenfoid foliküllerin yapısı ve konumu insanlara benzer12.

Tavşanı anne ve mukozal bağışıklık için bir model olarak kullanmanın ek avantajları arasında yüksek doğurganlıkları ve nispeten kısa gebelik süreleri bulunur. Büyük auriküler kan damarları, seri koleksiyonlar için büyük hacimli kanlara nispeten kolay erişim sağlar. Antijene özgü antikor yanıt tahlilleri için çeşitli mukozal örnekler toplanabilir, anne sütü13 (emzirirken), mukozal salgılar veya yıkamalar (örneğin, oral14 , 15,16, bronkoalveolar lavaj13,17,18,19, vajinal20,21,22) ve dışkı 20,23,24,25. Süt örnekleri, antijene özgü antikor yanıtlarının varlığını değerlendirmek için emzirme döneminde kolayca toplanabilir. İnsanlar ve fareler için olduğu kadar bol olmasa da, tavşana özgü çalışmalar ve tahliller için çok çeşitli deneysel reaktifler mevcuttur. Bu yazıda, Yeni Zelanda Beyaz tavşanlarında(Oryctolagus cuniculus)intranazal bağışıklama ve süt toplamayı açıklayacağız ve göstereceğiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm prosedürler Duke Üniversitesi IACUC politikalarına uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi.

NOT: İhtiyaç duyulan malzemeler Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Tavşan Sedasyonu ve Anestezi

  1. Asepromazin intramüsküler (IM) 1 mg / kg dozda uygulayarak dişi tavşanı (cinsel olarak olgun; yaklaşık 5-30 aylık) yatıştırın. Hayvanın büyüklüğüne bağlı olarak, 25 G iğneli 1 veya 3 mL şırınga kullanın. Apolikal kaslar kas içi enjeksiyonun tercih edilen bölgesidir.
    NOT: Asepromazin deri altı olarak da uygulanabilir, ancak daha hızlı hareket ettiği ve cilt lezyonlarının görülme sıklığını azalttığı için IM laboratuvar tarafından tercih edilir.
  2. Asepromazinin etkisini geçmesi için 10-15 dakika bekleyin.
  3. Bağlı burun konisini hayvanın burnunun üzerine yerleştirerek tavşanı izofluran ile uyuşturun. Buharlaştırıcıyı 4 litreye/dakika oksijene kadar birleştirilmiş %4 izoflurane kadar ayarlayın. Tavşanlar izoflurana karşı yüksek bir nefrete sahiptir, bu nedenle hayvanı maskelerken yeterli kısıtlama gereklidir.
  4. Pinna, pedal ve/veya palpebral refleks tarafından değerlendirildiği gibi tamamen uyuşturulduktan sonra, gözlerin kurumasını ve ardından kornea ülserasyonunu önlemek için her göze oftalmik yağlayıcı uygulayın.
  5. Anestezi sırasında refleksleri ve solunumları sürekli izleyin ve yeterli bir anestezi düzlemine ulaşıldıktan sonra izofluran oranını% 1-2'ye düşürün.

2. İntranazal bağışıklama

  1. Hayvan işlemeden önce bağışıklama çözeltisi hazırlayın.
  2. Tavşanı yukarıda açıklandığı gibi yatıştırın.
  3. Laboratuvar üyesi aşıyı vermeye hazır olduğunda ve tavşan yeterli bir anestezi düzlemine girdiğinde, izofluran ve oksijeni kapatın ve burun konisini çıkarın.
  4. Tavşanı dorsal reumbency'ye yerleştirin ve boynu ve başı, aşıyı uygulayan laboratuvar üyesi tarafından her iki narın kolay erişmesini ve görselleştirilmesini sağlayan yaklaşık 45 ° açıyla destekleyin.
  5. Pipetleri aşı çözeltisinin en fazla 100 μL'si ile yükleyin ve çözeltiyi her burun deliğinde hızlı bir şekilde uygulayın. Pipet, burun geçişinin medial yönüne doğru açılı yaklaşık 45 ° açıyla tutulmalıdır.
    NOT: Bağışıklamanın amacı, çözeltinin narların mukozal zarına temas etmesidir, bu nedenle uç narların içine yerlendirilmemelidir, çünkü bu mukozal dokuların aşınmasına veya tahrişine neden olabilir ve nazal olarak uygulanan aşının immünojenikliğini potansiyel olarak etkileyebilir. Aşı hızlı bir şekilde uygulanmalı ve diğer narede aynı şekilde yapılmalıdır.
  6. Her iki burun pasajında da uygulamadan sonra, aşı çözeltisinin sızıntısını en aza indirmek için tavşanı 30 saniye boyunca dorsal reumbency'de saklayın.
    NOT: Laboratuvar genellikle burun deliği başına aynı anda en fazla 100 μL uygular. Maksimum toplam 500 μL ile daha büyük bir hacim uygulanacaksa, aşı, bağışıklamalar arasında 30 saniyelik bir dinlenme süresi ile 100 μL aliquots olarak verilebilir ve aşının ek uygulamaları, toplam aşı hacmi teslim edilene kadar her uygulama arasında 30 saniye dinlenme ile tekrarlanabilir.
  7. Bağışıklamadan sonra, tavşanı iyileşme için ventrum üzerine yerleştirin ve sternal recumbency'yi koruyabilene kadar hayvanı yakından izleyin.

3. Süt toplama

  1. Emziren tavşanı yukarıda açıklandığı gibi yatıştırın.
  2. Alkol çubuğu/mendil ile cildi marjinal kulak damarı üzerinde temizleyin.
  3. 1 mL şırınga ve 25 g iğne kullanarak, sütün hayal kırıklığına uğratılmasına neden olmak için marjinal kulak damarı aracılığıyla intravenöz olarak yaklaşık 1-2 IU oksitosin verin.
    NOT: Düz kas gevşemesi nedeniyle, tavşanın oksitosin yönetimini takiben idrar yapması veya dışkılaması yaygındır.
  4. Oksitosin uygulamasını takiben, gazlı bez parçası ile enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın.
  5. Anestezi maskesini tavşanın burnu üzerinde tutarken, tavşanı arka ayaklarına destekleyin.
    NOT: Süt toplama, hayvanla yanal rekumbens olarak da yapılabilir, ancak laboratuvar, tavşanı anestezi maskesiyle dik tutan bir asistanla yumruğuna desteklendiğinde toplamanın daha kolay olduğunu bulur.
  6. Süt toplamaya hazırlanmak için steril tüpü açın ve meme dokusunu ve ilgili memeleri bulun. Meme uçları tipik olarak son hemşirelikten ıslak kürk ile çevrilidir ve meme dokusu sütle dolduğunda kolayca hissedilebilir.
  7. Başparmak ve işaret parmağı arasındaki meme ucu ile ilişkili meme dokusunu kavrayın ve meme ucu yönünde glandüler dokuya hafif, masaj basıncı uygulayın. İfade edilen sütü toplamak için toplama tüpünü meme ucunun üzerine yerleştirin.
    NOT: Oksitosinin etkili olması bazen birkaç dakika sürebilir ve süt üretiminin meme bezleri arasında değiştiği görülmektedir. Süt ifadesi başarılı olmazsa, birkaç dakika bekleyin veya ek meme bezlerine dönün. Tüm tiklerden elde edilen süt aynı şişede toplanabilir. Tipik olarak, emziren bir doe'dan birkaç mililitre süt kolayca toplanabilir.
  8. Süt toplamayı takiben, izofluran ve oksijeni kapatın ve hayvan sternal rekumbensi koruyabilene kadar yakından izlenirken tavşanın iyileşmesine izin verin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tipik bir anne intranazal bağışıklama çalışması tasarımına genel bir bakış Şekil 1'de, bağışıklamalar, üreme, kindling, emzirme ve antikor transferini içeren bir şekilde tasvir edilir. Resimli olmasa da, temel ölçümler için ilk bağışıklamadan önce ve çalışmanın geri kalanı boyunca düzenli aralıklarla kan toplanmalıdır. Kan, hafif sedasyon ve topikal analjezik bir ajan (örneğin, lidokrin% 2.5 ve prilocaine% 2.5 krem) ile merkezi kulak atardamarı yoluyla kolayca elde edilir. Bu örneklerde antijene özgü IgG seviyelerinin varlığı ölçülebilir. Dişi tavşanlar, protokolde açıklandığı ve videoda gösterildiği gibi intranazal rota üzerinden bağışıklanır. Çalışmaya bağlı olarak, aşı bir takviye gerektirebilir veya ek bir yoldan (örneğin, kas içi veya deri altı) verilmesi gerekebilir. Çalışmanın başlatılmasından sonra, tavşanlar yetiştirilir; bu çalışmalar için daha yüksek bir gebelik oranı sağlamak için satıcılardan kanıtlanmış yetiştiriciler satın almayı tercih ediyoruz. Bağışıklama zaman çizelgesine bağlı olarak, tavşanlar hamilelik boyunca ek bağışıklamalar alabilir. Antijene özgü IgG kitlere transenntally olarak aktarılır ve üreme sonrası yaklaşık 30-32 gün içinde hamileler ürer. İlk birkaç gün boyunca kitlerin kullanımını sınırlandırmanızı öneririz. Transenktif olarak aktarılan antijene özgü IgG seviyelerini değerlendirmek için kitlerden kan örnekleri toplanabilir (Şekil 3). Çok çeşitli besinlere ek olarak, kitler emzirirken emziren doe'dan IgA alır. Kitler tipik olarak 4-8 haftada sütten keser, ancak sütten süt, videoda gösterildiği gibi emzirmeden kolayca toplanabilir. Toplanan süt numuneleri daha sonra toplam ve antijene özgü IgA seviyelerinin tespiti için işlenebilir (Şekil 4). Çalışmaya bağlı olarak, kitlere aşılar (+/- takviyeler) uygulanabilir ve lateral saphenöz damar kullanılarak çok erken yaşlarda kitlerden seri kan örnekleri toplanabilir.

Anne çalışmaları için, hamileliğin mümkün olduğunca erken belirlenmesi, çalışma tasarımı ve doe'nun yeniden yetiştirilmesine gerek kalmamasını sağlamak için faydalıdır. Progesteron ölçümleri gebeliği tespit etmek için bir araç olarak kullanılabilir. Şekil 2'degösterildiği gibi, hamile tavşanlarda, bir dolar ile çiftleşmeler herkes için onaylandıktan sonra bile hamile olmayan tavşanlara kıyasla yüksek progesteron seviyeleri tespit edilebilir. Gebelik tespiti için manuel palpasyon, ultrason ve radyografi dahil olmak üzere ek yöntemler vardır; ancak, bunlar iyi eğitimli kişisel ve uygun ekipman gerektirir.

Rahimdeyken transenktif olarak aktarılan antijene özgü IgG kitlerin serumunda ölçülebilir. Erken antijene özgü antikor seviyelerini değerlendirmek için doğum anında veya yakınında az sayıda kitten kan toplanabilir, ancak kitler yaşlandıkça ve arttıkça seri kan toplanması teknik olarak çok daha kolaydır. Şekil 3'tegösterildiği gibi, kitlerdeki antijene özgü IgG serum seviyeleri ELISA ile ölçülebilir ve anne seviyeleri ile karşılaştırılabilir. Doğumsal olarak transfer edilen IgG seviyeleri doğumda daha yüksek olma ve zamanla azalma eğilimindedir.

Bir tür mukozal örnek olarak, toplam veya antijene özgü antikor seviyelerini ölçmek için süt toplanabilir ve işlenebilir. Şekil 4'tegösterildiği gibi, IgA, laktasyon yoluyla kitlere aktarılan anne sütü içindeki toplam antikor seviyelerinin önemli bir kısmını oluşturur. Sonuçlarımız, anne sütü IgA'nın IgG ile karşılaştırıldığında biraz daha yüksek bir ELISA sinyali (göreceli ışık birimleri, RLU) ürettiğini ve hem IgA hem de IgG'nin IgM sinyalinden çok daha yüksek bir sinyal ürettiğini göstermektedir. Bu sonuçlar, tavşan sütünün yaklaşık 4,5 mg / mL IgA, 2,4 mg / mL IgG ve 0,1 mg / mL IgM26,27içerdiğini öne süren diğerlerinden gelen sonuçlarla aynı fikirdedir.

Figure 1
Şekil 1. Bir tavşanda(Oryctolagus cuniculus)bir anne intranazal bağışıklama çalışması tasarımı için örnek zaman çizelgesi. Dişi tavşanlar, protokolde açıklandığı ve videoda gösterildiği gibi intranazal rota üzerinden bağışıklanır. Çalışmaya bağlı olarak, aşı bir takviye gerektirebilir veya ek bir yoldan (örneğin kas içi veya deri altı) verilmesi gerekebilir. Tavşanlar daha sonra yetiştirilir. Antijene özgü IgG kitlere transenntally olarak aktarılır ve üreme sonrası yaklaşık 30-32 gün içinde hamileler ürer. IgA, emzirirken emziren doe'dan kitlere geçirilir. Sütten sütten uzak kalmadan önce, toplam ve antijene özgü IgA seviyelerini değerlendirmek için emzirmeden kolayca toplanabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. Üreme sonrası 3 haftada hamile ve hamile olmayan tavşanlarda progesteron seviyeleri. Üremeden 3 hafta sonra tavşanlardan kan toplandı. Tavşanlar, üreme sonrası 30-32 günde bir çöpü yetiştirme yeteneğine dayanarak hamile veya hamile olmayan olarak doğrulandı. Serum progesteron düzeyleri Michigan Eyalet Üniversitesi Veteriner Tanı Laboratuvarı aracılığıyla immünoassay sistemine sahip bir chemiluminescent immunoassay (CLIA) kullanılarak ölçüldü (örneğin, Siemens Healthineers IMMULITE 2000). Hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil eder ve örnek boyutu grup başına 4-6 tavşandan oluşurdu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Doğumda ve 3 haftalıkken bir dizi anne bağışıklamasını takiben kitlerde (anne seviyelerine göre) antijene özgü IgG seviyeleri. Kinddan kısa bir süre sonra ve 3 haftalıkken yapılanlardan ve kitlerden kan toplandı. Serum içindeki antijene özgü IgG seviyeleri, daha önce açıklandığı gibi floresan elisa kullanılarak tespit edildi28. Antijene özgü IgG, kit serumu ve maternal serumda saptanan düzeylerin bir oranı olarak çizilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. Tavşan sütünde IgA, IgM ve IgG seviyelerinin karşılaştırılması. Tavşan sütü, videoda açıklandığı ve gösterildiği gibi toplandı. Süt uzun bir santrifüjleme ile işlendi (4 °C'de 4,5 saat boyunca 13.000 x g) ve net orta tabaka işlemden sonra izole edildi. Toplam IgA, IgG ve IgM seviyeleri bu açık katmanda floresan ELISA tarafından daha önce açıklandığı gibi28, plakaların sırasıyla toplam tavşan IgA, IgG veya IgM'yi tespit etmek için poliklonal anti-IgA, anti-IgG veya anti-IgM ile kaplanması dışında ölçüldüğü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıdaki protokolde açıklanmasa da, tavşanların başarılı bir şekilde yetiştirimesi bu anne modeli ve süt toplanmasına izin vermek için gereklidir. Tavşanlar, bir araştırma ortamında canlı kapakla kolayca yetiştirilir. Buck ile kendi kafeslerinde tutulursa bölgesel ve agresif olabileceği gibi, üreme için buck'ın kafesine aktarılması önerilir. Dişiler 15 dakika sonra alıcı değilse (ısırma veya seslendirmeden kaçma ile belirtildiği gibi), doe kendi kafesine geri yerleştirilmelidir. Tavşan yetiştiriciliği hakkında çevrimiçi olarak gözlemlenebilen birkaç bilgilendirici video ve öğreticivardır 29, ancak üremeden sonra, erkek tipik olarak düşer ve vokal yapabilir. Bu gözlendikten sonra, doe kafesine geri döndürülebilir. Bir buck, sperm sayısında azalma olmadan günde 2-3 kez üreyebilir30. IACUC onaylı protokolümüzde, dolarlar haftada 10-12 üreme ile sınırlıdır ve kaynaklar genellikle 10-15 hizmet vermek için tek bir buck'ın31yaptığını belirttiği için haftada en az iki dinlenme günü sağlanır. Grubumuz, üreme başarı oranını artırmak için satıcıdan kanıtlanmış yetiştiriciler satın almanızı önermektedir. Tavşanlar indüklenen yumurtlayıcılar ve yumurtlama tipik olarak çiftleşme sonrası31 10-13saat meydana geldiğinden, sabah ve öğleden sonra tekrar yetiştirilen veya bu 10-13 saatlik süre içinde iki kez (% 75'ten% 95 başarı oranına, yayınlanmamış) daha yüksek bir hamilelik oranı yaşadık. Literatüre göre, tipik üreme başarı oranları% 57-10032,33,34,35,36, 37,38,39,40ve çöp boyutları ortalama yaklaşık 7-9 kit31arasında değişmektedir.

Gebeliğin mümkün olduğunca erken belirlenmesi, doe'nun yeniden yetiştirilmesine veya çalışmadan çıkarılmasına gerek olmadığını doğrulamak için anne çalışmalarında yardımcı olur. Gebelik tespiti için seçenekler arasında palpasyon (14 gün kadar erken)31,ultrason (5-9 gün kadar erken)40,radyografi (11 gün kadar erken)31, kilo alımı ve insülin büyüme faktörleri41 (IGF) ve progesteron ölçümleri gibi moleküler teknikler34,37,38,42,43. Önceki çalışmalar, hamile tavşanlarda IGF-II seviyelerinin hamile olmayan tavşanlardaki seviyelere kıyasla önemli yükselmeler gösterdiğini belirtmiştir41. Bununla birlikte, elimizde, hamile ve hamile olmayan tavşanlar (yayınlanmamış) arasında IGF-II seviyelerinde bir fark tespit edemedik. Tavşanlarda gebeliğin sürdürülmesi için yeterli progesteron seviyeleri gerekli olduğundan37,44, çeşitli çalışmalar hamile tavşanlarda progesteron seviyelerini değerlendirmiş ve özellikle gebelik ortası civarında organogenez sırasında hamile olmayan tavşanlara göre yüksek seviyeler göstermiştir 34,43,44. Grubumuz hamile ve hamile olmayan tavşanlar arasında bir ELISA kullanarak progesteron seviyelerindeki farklılıkları tespit edemedi, ancak Michigan Eyalet Üniversitesi Veteriner Teşhis Laboratuvarı'nda otomatik bir chemiluminescent testi kullanılarak elde edilen ilk sonuçlar, bir dolar ile çiftleşmeler onaylandıktan sonra bile hamile tavşanlarda yüksek progesteron seviyelerinin arttığını göstermektedir (Şekil 2).

Emzirme günlük 45 , 46 , toplam ve antijene özgü antikor yanıtlarını / konsantrasyonlarını değerlendirmek için deneysel tahliller için büyük hacimlerde izin vererek yaklaşık250mL veya60mL / kg süt üretebilir. Tavşan sütü, ve ekmek sütüne kıyasla 2 ve 3 kat daha konsantre yağ ve protein içeren yüksek düzeyde yağ ve protein içerir, sırasıyla45,47. Sütteki yüksek yağ içeriği nedeniyle, numuneler yapılacak tahlillere bağlı olarak önemli ölçüde işlem gerektirir. Süt örneğinin santrifüjlenmesinden sonra, alt katmandaki hücreler, immünoglobulinleri içeren şeffaf ara tabaka ve üst katmandaki yağ dahil olmak üzere üç ayrı katman ayrılır48. İmmünoglobulinler, açık ara tabaka içinde, kolostrum ve süt içinde yüksek konsantrasyonlarda bulunur ve öncelikle IgA, IgG ve IgM'den oluşur (Şekil 4). Süt örnekleri elle kolayca toplansa da ve laboratuvar içinde tercih edilen tekniğimiz bu olsa da, vakum sistemleri literatürde de bildirilmiştir13,46,48. Yoshiyama ve ark.48 negatif basınç kullanarak süt örnekleri topladı ve immünoglobulin çıkarılması için açık ara tabakayı sepharose 4B kolondan geçirmeden önce süt katmanlarının ayrılması için uzun bir santrifüjleme (4 saat boyunca 15.000 x g) tanımladı. Bu yöntemi kullanarak, yazarlar ağızdan aşılanmış tavşanların tavşan sütü içindeki kolera toksine özgü antikorları bağırsakta Vibrio kolerakaynaklı salgıya karşı koruma için yeterli seviyelerde tespit edebildiler48. Peri ve ark.13 işlenmiş süt numunesi, 24.000 x g'da 2 saat boyunca 4 °C'de santrifüjleme ile su vakum sistemi ile aspirasyon ile toplanmıştır. Bu çalışmada yazarlar kolostrum, süt ve bronş ve bağırsak salgılarında mukozal bağışıklama (oral veya intratracheal) takiben anti-RSV IgA tespit edebildiler, ancak intravenöz bağışıklama değil, anti-RSV IgG ise bağışıklama rotası13'ebakılmaksızın kolostrum, süt ve serumda tespit edildi.

Tavşanın yeterli bir anestezi düzleminde olduğunu doğrulamak ve aynı anda büyük miktarlarda aşı uygulanmasından kaçınmak için intranazal bağışıklama prosedürü sırasında dikkatli olunmalıdır. Grubumuzun önceki çalışmaları intranazal bağışıklamanın etkinliğinin anestezi kullanımından etkilendiğini göstermiştir49. Özellikle, ketamin ve ksilazinin kombinasyonu ile indüklenen derin anestezi, nazal olarak uygulanan aşının artan immünojenikliği ve çözeltinin iyileştirilmiş burun tutulması ile ilişkilidir. Bu seviyeler, asepromazin ve butorphanol49ile sedasyondan sonra intranazal olarak aşılanan tavşanlarda tutma ve immünojeniklikten önemli ölçüde daha yüksekti. Benzer bulgular farelerde intranazal bağışıklamanın ardından da gösterilmiştir50,51. Ek olarak, çalışmamız tamamen uyanık olan hayvanlar ve asepromazin ve izofluran kombinasyonu ile daha kısa süreli anestezi uygulanan hayvanlar üzerinde derin anestezi altında intranazal bağışıklama sonrasında immünojenikliğin arttığını göstermiştir. IgG immünojenikliğinde derin ile daha kısa süreli anestezi arasındaki bu fark 42 günlük zaman noktasında anlamlıydı, ancak 56 günlük zaman noktasında anlamlı değildi. Artan immünojeniklik ve elde tutma daha derin anesteziden kaynaklansa da, tavşanların iyileşmesi için en az 30 dakika gerekir; tavşanlar ise daha kısa süreli izotiyolüran kaynaklı anesteziyi takiben burun aşısını aldıktan sonraki 5 dakika içinde dik ve hareketliydi. Anestezi, insanlarda intranazal bağışıklama için klinik ayarı taklit etmek için ideal olmasa da, enjekte edilebilir ajanlarla (örneğin, ketamin + ksilazin) daha uzun süreli anestezi (örneğin izofluran) tercih edilebilir. Gwinn ve ark.49'dagösterildiği gibi bir hayvan modelinin kullanılması, genellikle güvenli hayvan kullanımına ve etkili ve tutarlı aşı teslimatına izin vermek için sedasyon veya anestezi kullanılmasını gerektirecektir. Hayvan modellerinde aşı uygulama ile anestezi kullanımı için potansiyel bir sınırlama, hayvanın aşıya uygun bir bağışıklık tepkisi verme yeteneği üzerindeki etkisidir. İlginçtir ki, literatürdeki raporlar izofluranların sistemik enflamatuar yanıtları azaltabileceğini,zorluklara karşı koruma sağlayabileceğini ve oksidatif stresi ve iltihabı azaltabileceğini göstermektedir53.

Aşı kaybının en aza indirilmesi ve yeterli intranazal doğum ile ilgili olarak grubumuz, çözeltinin burun boşluğu içinde tutulmasını sağlamak ve tavşan hemen sternal rekumbensite yerlere yerleştirilmiş ve kafese geri döndürülürse çözeltinin burun deliklerinden sızmasını önlemek için intranazal aşının her bir aliquotunu uyguladıktan sonra 30 saniyelik bir dinlenme süresi önermektedir. Ek olarak, mukozal emilimi burun geçişinin yüzey alanı ile sınırlı olduğundan, intranazal bağışıklamayı sağlamak için uygulanan aliquot hacmini sınırlamak önemlidir. Büyük bir hacim uygulanırsa, çözelti burun mukozasını atlayabilir ve inhalasyonal veya mide bağışıklaması ile sonuçlanabilir. Grubumuz, burun deliği başına 100 μL'lik aliquots'u 500 μL maksimum intranazal hacimle önermektedir.

Bu makale, özellikle intranazal rota üzerinden mukozal aşı teslimatına odaklanmaktadır, ancak tavşanlarda gösterilen hem mukozal hem de parenteral olmak üzere birden fazla bağışıklama yöntemi vardır. Bu ek yöntemler oral, deri altı, intramüsküler ve intradermaldir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Bu nedenle, toplanacak ve değerlendirilecek örnekler deneysel hedeflere ve bağışıklama rotasına bağlı olarak değişir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar, Duke Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Kaynakları Bölümü'nü ve hayvancılık ekibini hayvanlara sağladıkları yardım ve büyük bakım için kabul etmek istiyor. Ayrıca, yazarlar Makalenin ses ve video bölümleriyle ilgili yardımlarından dolayı Patoloji Bölümü bünyesindeki PhotoPath ekibini tanımak isterler. Bu çalışma Staats laboratuvarından isteğe bağlı araştırma fonları ile desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needle (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Mucosal Vaccine N/A N/A Experimental Vaccine
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
Pipette Tips VWR 53503-290
Pipettor VWR 89079-962
PromAce (Acepromazine maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-ply Covidien 07-839-8871
Anesthesia Machine/Vaporizer Vet Equip 901807
Hypodermic Needles (25 g) Terumo 07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle) Patterson Veterinary 07-893-1389 2-4%
Luer Lock Syringe (1 mL) Air-Tite 07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4) Covidien 07-891-5815
Nose Cone McCulloch Medical 07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate) Boehringer Ingelheim 07-893-5734 1mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic Ointment Dechra 07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL) Falcon 14-959-49B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz, F. M. Current Challenges and Achievements in Maternal Immunization Research. Frontiers in Immunology. 9, 436 (2018).
  2. Kachikis, A., Englund, J. A. Maternal immunization: Optimizing protection for the mother and infant. The Journal of Infection. 72, Suppl 83-90 (2016).
  3. Omer, S. B. Maternal Immunization. The New England Journal of Medicine. 376 (13), 1256-1267 (2017).
  4. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. , 01560 (2015).
  5. Fouda, G. G. A., et al. Mucosal Immunization of Lactating Female Rhesus Monkeys with a Transmitted/Founder HIV-1 Envelope Induces Strong Env-Specific IgA Antibody Responses in Breast Milk. Journal of Virology. 87 (12), 6986-6999 (2013).
  6. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces Robust IgA-Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
  7. Furukawa, S., Kuroda, Y., Sugiyama, A. A comparison of the histological structure of the placenta in experimental animals. Journal of Toxicologic Pathology. 27 (1), 11-18 (2014).
  8. Palmeira, P., Quinello, C., Silveira-Lessa, A. L., Zago, C. A., Carneiro-Sampaio, M. IgG placental transfer in healthy and pathological pregnancies. Clinical & Developmental Immunology. 2012, 985646 (2012).
  9. Macchiaverni, P., et al. Mother to child transfer of IgG and IgA antibodies against Dermatophagoides pteronyssinus. Scandinavian Journal of Immunology. 74 (6), 619-627 (2011).
  10. Pentsuk, N., vander Laan, J. W. An interspecies comparison of placental antibody transfer: new insights into developmental toxicity testing of monoclonal antibodies. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 86 (4), 328-344 (2009).
  11. Butler, J. E., Rainard, P., Lippolis, J., Salmon, H., Kacskovics, I., et al. Mucosal Immunology. Mestecky, J., et al. , Academic Press. Ch. 116 2269-2306 (2015).
  12. Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Vanden Broeck, W. NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit. Veterinary Immunology Immunopathology. 133 (2-4), 212-218 (2010).
  13. Peri, B. A., et al. Antibody content of rabbit milk and serum following inhalation or ingestion of respiratory syncytial virus and bovine serum albumin. Clinical and Experimental Immunology. 48 (1), 91-101 (1982).
  14. Fukuizumi, T., Inoue, H., Tsujisawa, T., Uchiyama, C. Tonsillar application of killed Streptococcus mutans induces specific antibodies in rabbit saliva and blood plasma without inducing a cross-reacting antibody to human cardiac muscle. Infection and Immunity. 65 (11), 4558-4563 (1997).
  15. Saeed, M. I., Omar, A. R., Hussein, M. Z., Elkhidir, I. M., Sekawi, Z. Development of enhanced antibody response toward dual delivery of nano-adjuvant adsorbed human Enterovirus-71 vaccine encapsulated carrier. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (10), 2414-2424 (2015).
  16. Ma, Y., et al. Vaccine delivery to the oral cavity using coated microneedles induces systemic and mucosal immunity. Pharmaceutical Research. 31 (9), 2393-2403 (2014).
  17. Jarvinen, L. Z., Hogenesch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Induction of protective immunity in rabbits by coadministration of inactivated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Infection and Immunity. 66 (8), 3788-3795 (1998).
  18. Suckow, M. A., Bowersock, T. L., Nielsen, K., Grigdesby, C. F. Enhancement of respiratory immunity to Pasteurella multocida by cholera toxin in rabbits. Laboratory Animals. 30 (2), 120-126 (1996).
  19. Jarvinen, L. Z., HogenEsch, H., Suckow, M. A., Bowersock, T. L. Intranasal vaccination of New Zealand white rabbits against pasteurellosis, using alginate-encapsulated Pasteurella multocida toxin and potassium thiocyanate extract. Comparative Medicine. 50 (3), 263-269 (2000).
  20. Winchell, J. M., Routray, S., Betts, P. W., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal and systemic antibody responses to a C4/V3 construct following DNA vaccination of rabbits via the Peyer's patch. The Journal of Infectious Diseases. 178 (3), 850-853 (1998).
  21. Wegmann, F., et al. A novel strategy for inducing enhanced mucosal HIV-1 antibody responses in an anti-inflammatory environment. PLoS One. 6 (1), 15861 (2011).
  22. Winchell, J. M., Van Kruiningen, H. J., Silbart, L. K. Mucosal immune response to an HIV C4/V3 peptide following nasal or intestinal immunization of rabbits. AIDS Research and Human Retroviruses. 13 (10), 881-889 (1997).
  23. Knudsen, C., et al. Quantitative feed restriction rather than caloric restriction modulates the immune response of growing rabbits. The Journal of Nutrition. 145 (3), 483-489 (2015).
  24. Ciarlet, M., et al. Subunit rotavirus vaccine administered parenterally to rabbits induces active protective immunity. Journal of Virology. 72 (11), 9233-9246 (1998).
  25. Denchev, V., Mitov, I., Marinova, S., Linde, K. Local and systemic immune response in rabbits after intraintestinal immunization with a double-marker attenuated strain of Salmonella typhimurium. Journal of Hygiene, Epidemiology, Microbiology, and Immunology. 32 (4), 457-465 (1988).
  26. Watson, D. L. Immunological functions of the mammary gland and its secretion--comparative review. Australian Journal of Biological Sciences. 33 (4), 403-422 (1980).
  27. Lascelles, A. K., McDowell, G. H. Localized humoral immunity with particular reference to ruminants. Transplantation Reviews. 19, 170-208 (1974).
  28. Jones, D. I., et al. Optimized Mucosal Modified Vaccinia Virus Ankara Prime/Soluble gp120 Boost HIV Vaccination Regimen Induces Antibody Responses Similar to Those of an Intramuscular Regimen. Journal of Virology. 93 (14), (2019).
  29. Rabbit Tracks: Breeding Techniques and Management. Michigan State University. , Available from: https://www.canr.msu.edu/resources/rabit tracks breeding techniques and management (2020).
  30. Patton, N. M. The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. Ch. 2 27-45 (1994).
  31. Nowland, M. H., Brammer, D. W., Garcia, A., Rush, H. G. Laboratory Animal Medicine. Fox, J. G., et al. , Academic Press. Ch. 10 411-461 (2015).
  32. Attia, Y. A., Al-Hanoun, A., El-Din, A. E., Bovera, F., Shewika, Y. E. Effect of bee pollen levels on productive, reproductive and blood traits of NZW rabbits. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 95 (3), 294-303 (2011).
  33. Feussner, E. L., Lightkep, G. E., Hennesy, R. A., Hoberman, A. M., Christian, M. S. A decade of rabbit fertility data: study of historical control animals. Teratology. 46 (4), 349-365 (1992).
  34. Manal, A. F., Tony, M. A., Ezzo, O. H. Feed restriction of pregnant nulliparous rabbit does: consequences on reproductive performance and maternal behaviour. Animal Reproduction Science. 120 (1-4), 179-186 (2010).
  35. Marai, I. F., Ayyat, M. S., Abd el-Monem, U. M. Growth performance and reproductive traits at first parity of New Zealand white female rabbits as affected by heat stress and its alleviation under Egyptian conditions. Tropical Animal Health and Production. 33 (6), 451-462 (2001).
  36. Rodríguez, M., et al. A diet supplemented with n-3 polyunsaturated fatty acids influences the metabomscic and endocrine response of rabbit does and their offspring. Journal of Animal Science. 95 (6), 2690-2700 (2017).
  37. Salem, A. A., El-Shahawy, N. A., Shabaan, H. M., Kobeisy, M. Effect of punicalagin and human chorionic gonadotropin on body weight and reproductive traits in maiden rabbit does. Veterinary and Animal Science. 10, 100140 (2020).
  38. Sirotkin, A. V., Parkanyi, V., Pivko, J. High temperature impairs rabbit viability, feed consumption, growth and fecundity: examination of endocrine mechanisms. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106478 (2020).
  39. Sun, L., et al. Effect of light intensity on ovarian gene expression, reproductive performance and body weight of rabbit does. Animal Reproduction Science. 183, 118-125 (2017).
  40. El-Gayar, M., et al. Pregnancy detectuib ub rabbits by ultrasonography as compared to manual palpation. Egyptian Journal of Animal Production. 51 (3), 196-199 (2014).
  41. Nason, K. S., Binder, N. D., Labarta, J. I., Rosenfeld, R. G., Gargosky, S. E. IGF-II and IGF-binding proteins increase dramatically during rabbit pregnancy. The Journal of Endocrinology. 148 (1), 121-130 (1996).
  42. Haneda, R., et al. Changes in blood parameters in pregnant Japanese White rabbits. The Journal Toxicological Sciences. 35 (5), 773-778 (2010).
  43. Mizoguchi, Y., et al. Changes in blood parameters in New Zealand White rabbits during pregnancy. Laboratory Animals. 44 (1), 33-39 (2010).
  44. Salem, A. A., Gomaa, Y. A. Effect of combination vitamin E and single long-acting progesterone dose on enhancing pregnancy outcomes in the first two parities of young rabbit does. Animal Reproduction Science. 150 (1-2), 35-43 (2014).
  45. Maertens, L., Lebas, F., Szendro, Z. Rabbit milk: A review of quantity, quality and non-dietary affecting factors. World Rabbit Science. 14 (4), 205-230 (2006).
  46. Pekow, C. A. The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster, and Other Rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press. 243-258 (2012).
  47. Jenness, R. Lactational Performance of Various Mammalian-Species. Journal of Dairy Science. 69 (3), 869-885 (1986).
  48. Yoshiyama, Y., Brown, W. R. Specific antibodies to cholera toxin in rabbit milk are protective against Vibrio cholerae-induced intestinal secretion. Immunology. 61 (4), 543-547 (1987).
  49. Gwinn, W. M., et al. Effective induction of protective systemic immunity with nasally administered vaccines adjuvanted with IL-1. Vaccine. 28 (42), 6901-6914 (2010).
  50. Sloat, B. R., Cui, Z. Evaluation of the immune response induced by a nasal anthrax vaccine based on the protective antigen protein in anaesthetized and non-anaesthetized mice. Journal of Pharmcy and Pharmacology. 58 (4), 439-447 (2006).
  51. Janakova, L., et al. Influence of intravenous anesthesia on mucosal and systemic antibody responses to nasal vaccines. Infection and Immunity. 70 (10), 5479-5484 (2002).
  52. Fuentes, J. M., et al. General anesthesia delays the inflammatory response and increases survival for mice with endotoxic shock. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (2), 281-288 (2006).
  53. Lee, Y. -M., Song, B. C., Yeum, K. -J. Impact of Volatile Anesthetics on Oxidative Stress and Inflammation. BioMed Research International. 2015, 242709 (2015).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 173 Anne bağışıklama intranazal bağışıklama Mukozal bağışıklama Süt toplama Tavşan sütü Oryctolagus cuniculus.
Yeni Zelanda Beyaz Tavşanlarında Anne Bağışıklama Çalışmalarında İntranazal Bağışıklama ve Süt Toplama (<em>Oryctolagus cuniculus</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing,… More

Landon, C. D., Dancourt, G., Shing, V., Staats, H. F. Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus). J. Vis. Exp. (173), e62317, doi:10.3791/62317 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter