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Biology

महाधमनी वाल्व इन विट्रो के कैल्किफिकेशन का अध्ययन करने के लिए माउस इंटरस्टिशियल वाल्व कोशिकाओं का अलगाव

Published: May 10, 2021 doi: 10.3791/62419
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Cardiovascular Research Center, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Diabetes, Obesity and Metabolism Institute, Department of Medicine, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Graduate School of Biomedical Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

यह लेख दो चरण की कोलेजनेस प्रक्रिया द्वारा माउस महाधमनी वाल्व कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है। अलग माउस वाल्व कोशिकाओं को इस तरह के इन विट्रो calcification परख के रूप में अलग परख प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं, और महाधमनी वाल्व खनिजीकरण के लिए अग्रणी आणविक रास्ते की जांच के लिए ।

Abstract

महाधमनी वाल्व कोशिकाओं का कैलिफिकेशन महाधमनी स्टेनोसिस की पहचान है और यह वाल्व क्यूस फाइब्रोसिस से जुड़ा हुआ है। वाल्व इंटरस्टिशियल कोशिकाएं (वीआईसी) ऑस्टियोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं के लिए अपने डिफर्टेशन प्रोग्राम की सक्रियता के माध्यम से महाधमनी स्टेनोसिस में कैल्सिफिकेशन प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। माउस VICs महाधमनी वाल्व सेल के खनिजीकरण ड्राइविंग सिग्नलिंग रास्तों की स्पष्टता के लिए एक अच्छा इन विट्रो उपकरण हैं। यहां वर्णित विधि, सफलतापूर्वक इन लेखकों द्वारा इस्तेमाल किया, कैसे हौसले से अलग कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए बताते हैं । 1 मिलीग्राम/एमएल और ४.५ मिलीग्राम/एमएल के साथ दो-स्टेप कोलेजनेस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया गया । पहला कदम एंडोथेलियल सेल परत को हटाने और किसी भी प्रदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा कोलेजनेस इनक्यूबेशन ऊतक से प्लेट में VICs के प्रवास की सुविधा के लिए है। इसके अलावा, अलग माउस वाल्व कोशिकाओं के फेनोटाइप लक्षण वर्णन के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रक्रिया पर चर्चा की जाती है। इसके अलावा, कैल्शियम रिएजेंट माप प्रक्रिया और एलिजारिन लाल धुंधला का उपयोग करके विट्रो में कैल्सिफिकेशन परख का प्रदर्शन किया गया था। माउस वाल्व सेल प्राथमिक संस्कृति का उपयोग विट्रो में सेल खनिजीकरण को बाधित करने के लिए नए औषधीय लक्ष्यों के परीक्षण के लिए आवश्यक है।

Introduction

कैल्सीफाइड महाधमनी वाल्व रोग (सीएवीडी) पश्चिमी आबादी में सबसे प्रचलित वाल्वुलर हृदय रोग है, जो1वर्ष की आयु के 65 वर्ष से अधिक के लगभग 2.5% बुजुर्ग व्यक्तियों को प्रभावित करता है। CAVD छह लाख से अधिक अमेरिकियों को प्रभावित करता है और पत्रक है कि सामान्य रक्त प्रवाह ख़राब के यांत्रिक गुणों में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है1,2के माध्यम से. वर्तमान में, रोग की प्रगति को रोकने या खनिज प्रतिगमन को सक्रिय करने के लिए कोई औषधीय उपचार नहीं है। सीएवीडी के इलाज के लिए एकमात्र प्रभावी चिकित्सा सर्जरी या ट्रांसकैथेटर महाधमनी वाल्वप्रतिस्थापन 3द्वारा महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन है। इसलिए नए औषधीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए वाल्व खनिजीकरण के लिए अग्रणी आणविक तंत्र की जांच करना अनिवार्य है। दरअसल, गैर-उपचारित महाधमनी स्टेनोसिस के कई प्रतिकूल परिणाम होते हैं जैसे कि लेफ्ट वेंट्रिकल डिसफंक्शन और हार्ट फेलियर4।

महाधमनी वाल्व में तीन परतें होती हैं जिन्हें फाइब्रोसा, स्पोंगिओसा और वेंट्रिकुलरिस के रूप में जाना जाता है, जिसमें प्रमुख सेल टाइप5के रूप में VICs होते हैं। फाइब्रोसा और वेंट्रिकुलरिस को वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (वीईसी)5की एक परत से ढका जाता है। वीईसी भड़काऊ कोशिकाओं के साथ-साथ पैराक्राइन संकेतों की पारमशीलता को विनियमित करते हैं। यांत्रिक तनाव बढ़ने से वीईसी की अखंडता प्रभावित हो सकती है और महाधमनी वाल्व के होमोस्टिसिस को परेशान कर सकता है, जिससे भड़काऊ सेल आक्रमण6हो सकता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण ों की स्कैनिंग से मानव कैल्सीफाइड महाधमनी वाल्व7में बाधित एंडोथेलियम दिखाई दिया ।

कैल्सीफाइड टिश्यू के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोक्लास्ट की मौजूदगी का पता चलता है। इसके अलावा, विट्रो और मानव वाल्व ऊतक8 दोनों में VICs के ऑस्टियोजेनिक भेदभाव देखा गया था। यह प्रक्रिया मुख्य रूप से रूंट से संबंधित ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 2 (Runx2) और बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपीएस)8, 9द्वारा करवायाजाताहै।

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Protocol

नोट: यहां वर्णित सभी पशु प्रक्रियाओं माउंट सिनाई संस्थागत कोर और उपयोग समिति में Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. वयस्क चूहों से वाल्व सेल अलगाव से पहले तैयारी

  1. 70% v/v इथेनॉल का उपयोग करके चित्रा 1 ए में दिखाए गए सभी सर्जिकल उपकरणों को साफ और निष्फल करें और बाद में उन्हें 30 मिनट के लिए ऑटोक्लेविंग करें। 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल कार्यक्षेत्र को साफ करें।
  2. 10 मिमी HEPES के 50 एमएल में पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 500 माइक्रोन जोड़ें। 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 50 एमएल का एलिकोट तैयार करें। समाधान बर्फ पर रखें।
  3. 1 मिलीग्राम/एमएल और 4.5 मिलीग्राम/एमएल कोलेजनेस समाधान तैयार करें, और पूरी प्रक्रिया को करने के लिए 15 एमएल ट्यूबों में प्रत्येक समाधान के 5 एमएल का उपयोग करें। 1 मिलीग्राम/एमएल कोलेजनासे की 5 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस)-मुक्त) के 2.5 एमएल और 10 एमएम एचईपीपी के 2.5 एमएल एंटीबायोटिक दवाओं (1% पेनिसिलिन-स्ट्रीप्टोमीसिन के साथ 5 मिलीग्राम कोलेजनेज मिलाएं)। किसी भी संदूषण को दूर करने के लिए 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।
    नोट: एंजाइमों की रक्षा के लिए बर्फ पर समाधान रखें।
  4. नीचे वर्णित सभी चरणों में उपयोग करने से पहले डीएमईएम समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। डीएमईएम को 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% सोडियम पाइरुवेट, 200 एमएम एल-ग्लूटामाइन के 5 एमएल, माइकोप्लाज्मा एलिमिनेशन रिएजेंट (सामग्रियों की तालिकादेखें) और 10% एफबीएस के साथ पूरक करके पूरा माध्यम तैयार करें।

2. वाल्व कोशिकाओं का अलगाव

  1. प्रयोग के लिए 106 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, 5 8 सप्ताह पुराने चूहों (न्यूनतम तीन) का उपयोग करें। माउस को आइसोफ्लुन के 1 एमएल से भिगोए गए टिश्यू पेपर के एक छोटे से टुकड़े के साथ एक इंडक्शन चैंबर में रखें, लेकिन टिश्यू के संपर्क की अनुमति न दें। इस बात की पुष्टि करने के लिए कि जानवर पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है; अंगुली चुटकी पलटा के लिए जांच करें, और फिर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस इच्छामृत्यु । गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से पहले किसी भी दर्द को कम करने के लिए आइसोफ्लुन का उपयोग करें क्योंकि नीचे वर्णित प्रक्रिया टर्मिनल है।
  2. माउस को एक विच्छेदन मंच पर रखें, और पंजे को कैनुलास के साथ ठीक करें ताकि इसे जगह में पकड़ा जा सके। छाती और पेट को इथेनॉल से साफ करें; कैंची से पेट और छाती खोलें। छोटी सर्जिकल कैंची के साथ, माउस को उत्तेजित करने के लिए बाएं एट्रियम और बाएं वेंट्रिकल के बीच काटा जाता है। दिल से खून निकालने के लिए 10 एमएल ठंडे 1x पीबीएस के साथ दिल को पर्फ्यूज करें।
  3. दिल काटें, और आरोही महाधमनी से 3 मिमी रखें जैसा कि चित्रा 1Bमें दिखाया गया है। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे महाधमनी वाल्व विच्छेदन। वेंट्रिकल्स(चित्रा 1C)के बीच में क्षैतिज रूप से दिल काटें। महाधमनी की ओर बाएं वेंट्रिकल को काटें, और ध्यान से महाधमनी वाल्व(चित्रा 1D-F)को काटलें। एक छोटे से 35 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान में एक साथ वाल्व पूल।
  4. रक्त(चित्रा 2)को हटाने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं (1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक ठंडे HEPES (10 mm) के 5 एमएल के साथ एक 75 मिमी सेल कल्चर डिश में अलग वाल्व धोएं। कोलेजनेस 1 मिलीग्राम/एमएल और 4.5 मिलीग्राम/एमएल की दो 15 एमएल ट्यूब तैयार करें जैसा कि कदम 1.3 में वर्णित है।
    नोट: विच्छेदन के बाद, संदूषण को कम करने के लिए एक बाँझ जैवसेफ्टी हुड में अलग वाल्व में हेरफेर करें।
  5. कोलेजनेस टाइप I (1 मिलीग्राम/एमएल) में वाल्व को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लगातार झटकों(चित्रा 2)के साथ इनक्यूबेट करें । 150 × जीपर 5 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र, हेपेस (10 mM) के 2 एमएल के साथ एक बार गोली धोएं, और उच्च गति पर 30 एस के लिए भंवर। इस ट्यूब की सामग्री को 35 मिमी संस्कृति पकवान में डालें, और पतली चिमटी का उपयोग करके ऊतक के टुकड़ों को ध्यान से एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: इस स्तर पर, VICs अभी भी ऊतक से अलग नहीं कर रहे हैं, और गोली ऊतक के टुकड़े होते हैं । एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ प्रदूषण से बचने के लिए, चरण 2.5 में भंवर के बाद अपकेंद्रित्र न करें।
  6. 35 मिनट के लिए निरंतर आंदोलन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर कोलेजनेस टाइप I (4.5 मिलीग्राम/एमएल) के 5 एमएल के साथ 15 एमएल ट्यूब में गोली को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1 एमएल पिपेट के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 150 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  7. सुपरनेट को त्यागें, और पूर्ण डीएमईएम के 2 एमसीएल में गोली को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 150 × जी पर सेंट्रलाइज। कोशिकाओं को साफ करने के लिए इस कदम को दो बार दोहराएं।
    नोट: गोली अभी भी कुछ ऊतक टुकड़े होगा ।
  8. पूर्ण माध्यम के 1 मिलीएल में गोली को फिर से निलंबित करें, और कोशिकाओं को संस्कृति पकवान के प्रति उनके लगाव को सुविधाजनक बनाने के लिए माध्यम की न्यूनतम मात्रा में 6-अच्छी सेल संस्कृति पकवान के एक कुएं में प्लेट करें। कोशिकाओं को छोड़ दें, अशान्त, 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में।
  9. 3 दिनों के बाद, ऊतक मलबे के करीब अच्छी वृद्धि को सत्यापित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जांच करें। एक बार माइक्रोस्कोप के नीचे 1,000 कोशिकाएं दिखाई देती हैं, ध्यान से ऑटोक्लेव चिमटी के साथ ऊतक मलबे को हटा दें, और माध्यम को बदल दें।
    नोट: थाली परेशान नहीं किया जाना चाहिए; यदि कोशिकाओं की आवश्यक संख्या नहीं देखी जाती है, तो सेल कल्चर डिश को एक और 2 दिनों के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  10. जब कोशिकाएं 70% कॉन्फ्ल्यूरेंट (2.5 × 105)होती हैं, तो उन्हें 75 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें।

3. सेल पहचान और आकृति विज्ञान का विश्लेषण

नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला सेल आकृति विज्ञान और एंडोथेलियल सेल संदूषण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

  1. 70% v/v/इथेनॉल के साथ हुड को साफ करें। 6-वेल प्लेटों में बाँझ कवर्लिप्स (22 मिमी x 22 मिमी) रखें।
    नोट: कवर्लिप्स को स्टरलाइज करने के लिए, उन्हें 70% इथेनॉल से धोएं, और उन्हें पराबैंगनी प्रकाश के तहत रात भर हुड में रखें।
  2. बीज 100,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से थाली में. 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 1x पीबीएस में दो बार धोएं, और उन्हें 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में ठीक करें। कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ दो बार फिर से धोएं।
    नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं को धुंधला प्रक्रिया की शुरुआत तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में रखा जा सकता है।
  3. वीआईसी की शुद्धता को सत्यापित करने के लिए, वीईसी के साथ संदूषण का पता लगाने के लिए अल्फा-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (αSMA), विमेंटिन और विभेदन 31 (सीडी 31) के क्लस्टर का उपयोग करें।
  4. सामान्य सीरम (माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही प्रजाति), 1x पीबीएस के 9.5 मिलील और ट्राइटन एक्स-100 के 30 माइक्रोन मिलाकर बफर को अवरुद्ध करने का एक एलिकोट तैयार करें। 1 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर के 2 एमसीएल में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. ट्राइटन एक्स-100 के 30 माइक्रोन, 1x पीबीएस के 10 एमएल और 0.1 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) वाले एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर को तैयार करें।
  6. एक खाली टिप्स बॉक्स लें, एक आर्द्र कक्ष बनाने के लिए बॉक्स के आधे हिस्से को पानी से भरें। टिप होल्डर को गीले टिश्यू से कवर करें और फिर पैराफिल्म की शीट से।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी के 1 माइक्रोन लें, और इसे चरण 3.5 में तैयार कमजोर पड़ने वाले बफर के 100 माइक्रोन के साथ मिलाएं। पैराफिल्म पर पतला एंटीबॉडी का 50 माइक्रोन रखें। कुओं से कवरस्लिप लें, उन्हें फ्लिप करें, और उन्हें एंटीबॉडी की बूंदों के शीर्ष पर रखें; एंटीबॉडी के साथ रात भर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  8. 6-वेल प्लेट में पीबीएस का 1 एमएल जोड़ें। ध्यान से पैराफिल्म से कवरस्लिप बाहर ले, यह फ्लिप पर, और यह अच्छी तरह से जगह है । कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए निरंतर कोमल आंदोलन से धोएं। पीबीएस को ताजा पीबीएस से बदलें; कोशिकाओं को 3 बार धोएं।
  9. 1 घंटे के लिए पतला माध्यमिक एंटीबॉडी (1/500) (एलेक्सा-488, एलेक्सा-555) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर (चरण 3.5 में तैयार) के 500 माइक्रोन में माध्यमिक एंटीबॉडी का 1 माइक्रोल जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली को कवर करें। कोशिकाओं को 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ 3 बार लगातार आंदोलन के साथ धोएं।
  10. 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (DAPI) के 50 माइक्रोन के साथ कवरस्लिप माउंट करें, और कोशिकाओं और वीईसी संदूषण की आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें।

4. इन विट्रो कैल्सिफिकेशन परख

  1. हुड को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें, डीएमईएम माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. बीज १००,००० कोशिकाओं/शर्त पूर्ण DMEM में 6 अच्छी तरह से प्लेटों में, और संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए ।
  3. डीएमईएम में 2 एमएमएनएएच 2पीओ4, 10-7एमइंसुलिन, और 50 माइक्रोग्राम/एमएल एस्कॉर्बिक एसिड को 5% एफबीएस के साथ मिलाकर कैल्सीफाइंग मीडियम तैयार करें। डीएमईएम के 93 एमएल के लिए, एफबीएस के 5 एमएल, एंटीबायोटिक दवाओं के 1 एमएल (अंतिम एकाग्रता 1%), सोडियम पाइरुवेट (100 एमएम), 27.5 मिलीग्रामएनएएच 2पीओ4, 5.8 माइक्रोन इंसुलिन और 5 मिलीग्राम एस्कॉर्बिक एसिड जोड़ें।
    नोट: उपयोग से पहले 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान फ़िल्टर करें।
  4. 24 घंटे के बाद, अलौकिक माध्यम को कैल्साइंग माध्यम से बदलें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें। 3दिन, ताजा कैल्सीफाइंग माध्यम से बदलें, और उपचार के 7 दिनों को पूरा करने के लिए प्लेट को वापस इनक्यूबेटर में रखें।
  5. 7 दिनों के बाद, माध्यम को हटा दें, और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के 2 एमएल के साथ दो बार धोएं। 0.6 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के 1 मिलील में कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एचसीएल को 1.5 एमएल ट्यूब में ले लीजिए, और इसे रोटरी वाष्पीकरण में वाष्पित करें। एचसीएल के 60 माइक्रोन में सभी ट्यूबों की सामग्री को फिर से निलंबित करें।
    नोट: सुखाने की प्रक्रिया के समाधान को ध्यान केंद्रित करने और प्रत्येक स्थिति के लिए एक ही मात्रा के लिए महत्वपूर्ण है ।
  6. एक रेडी-टू-यूज किट में उपलब्ध आर्सेनाज़ो III रिएजेंट का उपयोग करके कैल्शियम एकाग्रता को मापने के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करें (अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
  7. 10 मिलीग्राम/डीएल एकाग्रता का कैल्शियम मानक समाधान तैयार करें। 10 मिलीग्राम कैल्शियम हाइड्रोक्साइड (सीए (ओह)2का वजन करें और 100 मिली लीटर आसुत पानी में भंग करें।
  8. एक स्पष्ट 96 अच्छी तरह से प्लेट में, खाली समाधान (एचसीएल, 0.6 एन), मानक समाधान, नमूना प्रति अच्छी तरह (10 मिलीग्राम/डीएल) और नमूनों का 2 माइक्रोन। पिपटिंग परिवर्तनशीलता को सत्यापित करने के लिए ट्रिपलिट में प्रयोग करें। प्रत्येक स्थिति के लिए रिएजेंट के 200 माइक्रोल जोड़ें।
    नोट: 15 मिलीग्राम/डीएल से ऊपर के नमूनों को नमकीन, फिर से परख के साथ 1:1 पतला किया जाना चाहिए, और परिणाम दो से गुणा ।
  9. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रतिक्रिया ६० मिनट के लिए स्थिर है ।
  10. 650 एनएम पर प्लेट के अवशोषण को पढ़ें और रिकॉर्ड करें। नमूनों में कैल्शियम की मात्रा की गणना करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें:
    कैल्शियम (mg/mL) = (मानक के नमूने/अवशोषण का अवशोषण) मानक की एकाग्रता ×

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Representative Results

चूंकि मुरीन महाधमनी वाल्व आमतौर पर व्यास में 1 मिमी होते हैं, इसलिए विभिन्न प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए एक लाख व्यवहार्य कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए कम से कम तीन वाल्व एकत्र किए जाने चाहिए। विक अलगाव प्रक्रिया के विभिन्न चरणों को चित्र 1 और चित्रा 2में दिखाया गया है । चूंकि वाल्व ऊतक को मैन्युअल रूप से परिमार्जन करना मुश्किल है, इसलिए वीईसी को हटाने के लिए भंवर द्वारा बनाए गए कतरनी तनाव का उपयोग करना बेहतर है। दरअसल, सीडी 31 इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला परिणाम एंडोथेलियल कोशिकाओं संदूषण(चित्रा 3 डी)की अनुपस्थिति से पता चला । इसके अलावा, माउस वीआईसी विमेंटिन और α-SMA व्यक्त करते हैं, जो वाल्व कोशिकाओं के प्रमुख मार्कर हैं(चित्रा 3B,सी)।

विट्रो में सेल खनिजीकरण
कैल्शियम एकाग्रता को मापने के लिए कैल्शियम रिएजेंट किट का उपयोग किया जाता था; कैल्सिफाइंग माध्यम से उपचारित कोशिकाओं में गैर-उपचारित कोशिकाओं(चित्रा 4A)की तुलना में कैल्शियम एकाग्रता अधिक होती है। कुल प्रोटीन एकाग्रता के साथ कैल्शियम की एकाग्रता को सामान्य किया गया था। अलीज़ारिन रेड स्टेनिंग ने रेड पॉजिटिव कैल्शियम नोड्स(चित्रा 4B)दिखाकर कैल्शियम-रिएजेंट किट मापन की पुष्टि की।

Figure 1
चित्र 1-वाल्व विच्छेदन का विवरण। } विच्छेदन के लिए आवश्यक सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों की प्रतिनिधि छवि, छाती खोलने के लिए माउस की त्वचा को खोलने के लिए कैंची 2 और कैंची 3 की आवश्यकता होती है। चिमटी 5 और 6 त्वचा को पकड़ने और छाती खोलने के लिए आवश्यक हैं। (ख)महाधमनी (काला तीर) से 3 मिमी ऊतक छोड़ दें। (ग)कैंची संख्या 4 के साथ वेंट्रिकल्स के बीच में दिल काटें। (घ)कैंची 3 के साथ महाधमनी वाल्व की ओर दिल खोलो । महाधमनी वाल्व को सावधानी से विच्छेदन करने के लिए पतले चिमटी 7 और 8 का उपयोग करें। वाल्व दिखाई देता है और इसमें कुछ काले बिंदु होते हैं जो चूहों के वाल्व ऊतक (नीले तीर) की विशेषता होते हैं। (ई)महाधमनी वाल्व की बेहतर कल्पना करने के लिए आवर्धन बढ़ाएं। छोटे कैंची 4 के साथ वाल्व को अलग; (एफ)चिमटी 7 के साथ ऊतक बनाए रखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:माउस वाल्व सेल अलगाव का प्रतिनिधि विवरण। संक्षिप्त: HEPES = 4-(2-हाइड्रोक्सीथिल) -1-piperazineethanesulfonic एसिड; आर टी = कमरे का तापमान; DMEM = Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:माउस वाल्व सेल फेनोटाइप। (क)हौसले से अलग वाल्व कोशिकाओं का सूक्ष्म दृश्य। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला दिखा(बी)विमेंटिन-पॉजिटिव कोशिकाएं और(सी)α-SMA । कोशिकाओं के लिए नकारात्मक हैं(डी)CD31 धुंधला. स्केल बार = 200 माइक्रोन। संक्षिप्त: DAPI = 4′, 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; CD31 = भेदभाव 31 का क्लस्टर; α-SMA = अल्फा चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:इन विट्रो कैल्सिफिकेशन परख। (ए)फॉस्फेट से भरपूर कैल्सीफाइंग मीडियम प्रेरित विक कैल्सिफिकेशन इन विट्रो,जिसे रिएजेंट किट के साथ मापा गया था । (ख)कैल्शियम नोड्स के लिए लाल सकारात्मक धुंधला (दाएं) दिखा सूक्ष्म छवि । (ग)अलीजारिन लाल धुंधला कैल्सीफाइंग माध्यम के जवाब में VICs के सकारात्मक कैल्शियम नोड्स (काला तीर) दिखाया । स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: सीटीएल- = नियंत्रण; एमवीआईसी = माउस वाल्वुलर इंटरस्टिशियल कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह लेख प्राथमिक संस्कृति के लिए माउस वाल्व सेल अलगाव का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। 8 सप्ताह पुराने चूहों से तीन महाधमनी वाल्व कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने के लिए जमा किया गया । इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल विक फेनोटाइप और इन विट्रो खनिजीकरण परख के लक्षण वर्णन करताहै। विधि को मैथयू एट अल7से पहले वर्णित प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था।

महाधमनी वाल्व के अलगाव के दौरान, कोशिकाओं को बैक्टीरियल या माइकोप्लाज्मा संदूषण से बचाने के लिए संभावित छूत के सभी स्रोतों से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। दरअसल, प्रयोग शुरू करने से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव करना महत्वपूर्ण है। एचईपीएस समाधान को बैक्टीरियल संक्रमण को कम करने के लिए 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक किया जाना चाहिए। इसके अलावा, माइकोप्लाज्मा साइटोपैथोलॉजी का कारण बन सकता है और फलस्वरूप सेल संस्कृति10में मापा हर पैरामीटर के साथ हस्तक्षेप करता है।

संस्कृति माध्यम की कम मात्रा के साथ छोटे संस्कृति व्यंजनों में चढ़ाना कोशिकाओं विक विकास और प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है । ऊतक बसने और सेल संस्कृति पकवान का पालन करने दे ऊतक से पकवान की दीवार के लिए सेल प्रवास की अनुमति देता है । यह देखते हुए कि युवा चूहों से अलग कोशिकाओं तेजी से पैदा होती है, यह संस्कृति के 5 दिनों के बाद ७५ सेमी2 की एक बड़ी संस्कृति पकवान के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने की सिफारिश की है । कोशिकाओं को 80% संगम तक बनाए रखना महत्वपूर्ण है ताकि VICs के वियोग के भेदभाव को कम से कम करके एक मायोफिब्रोब्लास्ट फेनोटाइप8में रखा जा सके ।

जैसा कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा दिखाया गया है, अलग वाल्व कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्ट जैसी फेनोटाइप दिखाती हैं। VICs में एक विस्तारित साइटोप्लाज्म होता है और पिछले अध्ययनों द्वारा वर्णित विमेंटिन और αSMA दोनों को व्यक्त करते हैं। वर्तमान कार्य ने इस बात की पुष्टि की कि माउस विक फेनोटाइप पहले पोर्सिन वीआईसी11 और मानव वीआईसी12के लिए वर्णित समान है। महाधमनी स्टेनोसिस पर अधिकांश इन विट्रो अध्ययन बड़े जानवरों की कोशिकाओं पर किए जाते हैं8,11. पोर्सिन वीआईसी का मुख्य नुकसान सामान्य मीडिया13में भी विट्रो में ऑस्टियोब्लास्ट फेनोटाइप के लिए उनका सहज भेदभाव है । हालांकि, माउस वीआईसी उच्च मार्ग पर भी अनायास कैल्शियम नहीं करते हैं।

माउस वीआईसी एस्कॉर्बिक एसिड, इंसुलिन और फॉस्फेट उत्तेजना का उपयोग करके कैल्सीफाइंग माध्यम के जवाब में ऑस्टियोब्लास्ट फेनोटाइप में अंतर करता है। यह लेख एक किट और अलीज़ारिन लाल धुंधला का उपयोग कर एक गुणात्मक विधि का उपयोग कर कैल्शियम माप की एक मात्रात्मक विधि का वर्णन करता है । दोनों तरीकों ने मध्यम उपचार को कैल्सीफाइंग के जवाब में कैल्सिफिकेशन की महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई। कैल्शियम माप किट सोने के मानक विधि है, जो एक सटीक मात्रात्मक कैल्शियम माप14प्रदान करता है ।

आर्सेनाज़ो III रिएजेंट में, मैग्नीशियम हस्तक्षेप को 8-हाइड्रोक्सीक्विनोलिन सल्फोनेट के शामिल करके रोका जाता है। कैल्शियम एक बैंगनी रंग का परिसर बनाने के लिए रिएजेंट के साथ प्रतिक्रिया करता है, जो 650 एनएम पर अवशोषित होता है। रंग की तीव्रता कैल्शियम एकाग्रता के आनुपातिक है। आर्सेनाज़ो-III रिएजेंट की सटीकता को पहले परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के साथ मान्य किया गया था। इसी विधि का उपयोग नैदानिक प्रयोगशालाओं में जैविक तरल पदार्थों में कुल कैल्शियम एकाग्रता को मापने के लिए किया जाता है14. महाधमनी स्टेनोसिस में कैल्किफिकेशन मुख्य रूप से हाइड्रोक्सीपेटाइट है, जैसा कि फैलाव एक्स-रे ऊर्जा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण7,12,15के साथ दिखाया गया है। दरअसल, महाधमनी वाल्व ऊतक के कैल्किफिकेशन की अधिक सटीक नकल करने के लिए मुफ्त कैल्शियम के बजाय कोशिका झिल्ली के कैल्सिफिकेशन का विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है।

चूहों आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए VICs के एक अच्छे स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं जिससे महाधमनी वाल्व कैल्सिफिकेशन होता है। हालांकि, ध्यान रखें कि विट्रो में VICs रहने वाले वाल्व में VICs के समान नहीं हैं। एक और सीमा तथ्य यह है कि एक एकल सेल संस्कृति बनाने के लिए 3-5 चूहों से वाल्व के एक पूल की आवश्यकता है। पूल विविधताओं को कम करने के लिए लिटरमेट चूहों से होना चाहिए। इसके अलावा, सभी निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए ट्रिप्लिकेट में प्रयोग किए जाने चाहिए। हालांकि, संस्कृति में पूरे महाधमनी वाल्व का उपयोग इस सीमा को कम कर सकता है। फिर भी, इन इन विट्रो अध्ययनों को निष्कर्षों को मजबूत करने के लिए मानव ऊतक में मान्य किया जाना चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm cutting edge scissors F.S.T 15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate Cell Signaling 4412
Arsenazo-III reagent set POINT SCIENTIFIC C7529-500 a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors F.S.T 14184-09
Calcium hydroxide SIGMA -Aldrich 31219 31219
CD31 Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg) Thermofisher Scientific 17018029
DMEM Tthermofisher 11965092
Extra fine graefe forceps F.S.T 11150-10
FBS Gibco 16000044
Fine forceps F.S.T Dumont
HCl SIGMA-ALDRICH H1758
HEPES 1 M solution STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x Thermofisher Scientific A2916801
Mycozap Lanza VZA-2011 Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x Thermofisher Scientific 10378016
Sodium Pyruvate 100 mM Thermofisher Scientific 11360070
Standard pattern forceps  F.S.T 11000-12
Surgical Scissors - Sharp-Blunt F.S.T 14008-14
Trypsin 0.05% Thermofisher Scientific 25300054
Vimentin abcam

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References

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जीव विज्ञान अंक 171
महाधमनी वाल्व इन <em>विट्रो</em> के कैल्किफिकेशन का अध्ययन करने के लिए माउस इंटरस्टिशियल वाल्व कोशिकाओं का अलगाव
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Bouchareb, R., Lebeche, D. Isolation … More

Bouchareb, R., Lebeche, D. Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro. J. Vis. Exp. (171), e62419, doi:10.3791/62419 (2021).

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