Summary
Dit artikel beschrijft de isolatie van muis aortaklepcellen door een twee-stap collagenase procedure. Geïsoleerde muisklepcellen zijn belangrijk voor het uitvoeren van verschillende assays, zoals deze in vitro verkalkingstest, en voor het onderzoeken van de moleculaire paden die leiden tot aortaklepmineralisatie.
Abstract
De verkalking van aortaklepcellen is het kenmerk van aortastenose en wordt geassocieerd met klep cusp fibrose. Klepinterstitiële cellen (VICs) spelen een belangrijke rol in het verkalkingsproces bij aortastenose door de activering van hun dedifferentiatieprogramma naar osteoblastachtige cellen. Muis-VICs zijn een goed in vitro hulpmiddel voor de opheldering van de signaleringsroutes die de mineralisatie van de aortaklepcel stimuleren. De hierin beschreven methode, die met succes door deze auteurs wordt gebruikt, legt uit hoe vers geïsoleerde cellen kunnen worden verkregen. Een tweestaps collagenaseprocedure werd uitgevoerd met 1 mg/ml en 4,5 mg/ml. De eerste stap is cruciaal om de endotheelcellaag te verwijderen en besmetting te voorkomen. De tweede collagenase incubatie is om de migratie van VICs van het weefsel naar de plaat te vergemakkelijken. Bovendien wordt een immunofluorescentiekleuringsprocedure voor de fenotypekarakterisering van de geïsoleerde muisklepcellen besproken. Bovendien werd de verkalkingstest in vitro uitgevoerd met behulp van de calciumreagensmetingsprocedure en alizarinerode kleuring. Het gebruik van primaire kweek van muizenklepcellen is essentieel voor het testen van nieuwe farmacologische doelen om celmineralisatie in vitro te remmen.
Introduction
Verkalkte aortaklepziekte (CAVD) is de meest voorkomende valvulaire hartziekte in westerse populaties en treft bijna 2,5% van de oudere personen ouder dan 65 jaar1. CAVD treft meer dan zes miljoen Amerikanen en wordt geassocieerd met veranderingen in de mechanische eigenschappen van de bijsluiters die de normale doorbloeding van het bloed belemmeren1,2. Momenteel is er geen farmacologische behandeling om de progressie van de ziekte te stoppen of minerale regressie te activeren. De enige effectieve therapie voor de behandeling van CAVD is aortaklepvervanging door chirurgie of transkatheter aortaklepvervanging3. Het is daarom noodzakelijk om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die leiden tot klepmineralisatie om nieuwe farmacologische doelen te identificeren. Inderdaad, niet-behandelde aortastenose heeft verschillende nadelige gevolgen, zoals linkerventrikeldisfunctie en hartfalen4.
De aortaklep bestaat uit drie lagen die bekend staan als fibrosa, spongiosa en ventricularis, die VICs bevatten als het overheersende celtype5. De fibrosa en de ventriculaire zijn bedekt met een laag vasculaire endotheelcellen (VEC's)5. De VEC's reguleren de doorlaatbaarheid van ontstekingscellen en paracrinesignalen. Verhoogde mechanische belasting kan de integriteit van de VEC's aantasten en de homeostase van de aortaklep verstoren, wat leidt tot inflammatoire celinvasie6. Scanning elektronenmicroscopie analyses toonden verstoord endotheel in een menselijke verkalkte aortaklep7.
Histologische analyses van verkalkt weefsel tonen de aanwezigheid van osteoblasten en osteoclasten aan. Bovendien werd osteogene differentiatie van VICs zowel in vitro als in menselijk klepweefsel waargenomen8. Dit proces wordt voornamelijk georkestreerd door de Runt-gerelateerde transcriptiefactor 2 (Runx2) en de botmorfogenetische eiwitten (BMPs)8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle hier beschreven dierprocedures zijn goedgekeurd door de Icahn School of Medicine op de institutionele kern- en gebruikscommissie van de Berg Sinaï.
1. Voorbereiding vóór klepcelisolatie van volwassen muizen
- Reinig en steriliseer alle chirurgische instrumenten in figuur 1A door 70% v/v ethanol te gebruiken en vervolgens gedurende 30 minuten te autoclaafen. reinig de chirurgische werkruimte met 70% ethanol.
- Voeg 500 μL penicilline-streptomycine toe aan 50 ml 10 mm HEPES. Bereid een aliquot van 50 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Houd de oplossingen op ijs.
- Bereid 1 mg/ml en 4,5 mg/ml collagenase-oplossingen voor en gebruik 5 ml van elke oplossing in buizen van 15 ml om de hele procedure uit te voeren. Om 5 ml 1 mg/ml collagenase te bereiden, mengt u 5 mg collagenase met 2,5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, foetale runderserum (FBS)-vrij) en 2,5 ml 10 ml HEPES aangevuld met antibiotica (1% penicilline-streptomycine vanaf stap 1.2). Filtreer de oplossingen door een filter van 0,22 μm om verontreiniging te verwijderen.
OPMERKING: Houd de oplossingen op ijs om de enzymen te beschermen. - Verwarm de DMEM-oplossing voor gebruik tot 37 °C in alle onderstaande stappen. Bereid het volledige medium voor door DMEM aan te vullen met 1% penicilline-streptomycine, 1% natriumpyruvaat, 5 ml 200 ml L-glutamine, 1 ml mycoplasma eliminatiereagens (zie de tabel met materialen)en 10% FBS.
2. Isolatie van klepcellen
- Gebruik vijf muizen van 8 weken oud (minimaal drie) om10 6 cellen voor het experiment te verkrijgen. Plaats de muis in een inductiekamer samen met een klein stukje tissuepapier gedrenkt in 1 ml isofluraan, maar laat geen contact met het weefsel toe. Om te bevestigen dat het dier volledig verdoofd is; controleer op teenknijpreflex en euthanaseer vervolgens de muis door cervicale dislocatie. Gebruik isofluraan om eventuele pijn voorafgaand aan de cervicale dislocatie te verlichten, omdat de hieronder beschreven procedure terminaal is.
- Plaats de muis op een ontledend platform en bevestig de poten met canules om hem op zijn plaats te houden. Reinig de borst en de buik met ethanol; open de buik en de borst met een schaar. Met een kleine chirurgische schaar, gesneden tussen het linker atrium en de linker hartkamer om de muis te exsanguineren. Doordrenkt het hart met 10 ml koude 1x PBS om bloed uit het hart te verwijderen.
- Snijd het hart en houd 3 mm van de oplopende aorta zoals weergegeven in figuur 1B. Ontleed de aortaklep onder een stereomicroscoop. Snijd het hart horizontaal in het midden van de ventrikels (figuur 1C). Snijd de linkerventrikel in de richting van de aorta en ontleed voorzichtig de aortaklep (Afbeelding 1D-F). Pool de kleppen samen in een kleine 35 mm weefselkweekschaal.
- Was de geïsoleerde kleppen in een celkweekschaal van 75 mm met 5 ml koude HEPES (10 mM) aangevuld met antibiotica (1% penicilline-streptomycine) om bloed te verwijderen (figuur 2). Bereid twee tubes collagenase van 15 ml 1 mg/ml en 4,5 mg/ml voor, zoals hierboven beschreven in stap 1.3.
OPMERKING: Manipuleer na de dissectie de geïsoleerde kleppen in een steriele bioveiligheidskap om verontreiniging te minimaliseren. - Incubeer de kleppen in collagenase type I (1 mg/ml) gedurende 30 minuten bij 37 °C met continu schudden (figuur 2). Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 150 × g,was de pellet eenmaal met 2 ml HEPES (10 mM) en vortex gedurende 30 s op hoge snelheid. Giet de inhoud van deze buis in een kweekschaal van 35 mm en breng de stukjes weefsel voorzichtig over met een dun pincet in een nieuwe buis.
OPMERKING: In dit stadium zijn de VICs nog steeds niet losgekoppeld van het weefsel en bevat de pellet stukjes weefsel. Om besmetting met endotheelcellen te voorkomen, mag u niet centrifugeren na vortexing in stap 2.5. - Incubeer de pellet in een buis van 15 ml met 5 ml collagenase type I (4,5 mg/ml) bij 37 °C onder continu roeren gedurende 35 minuten. Hang de cellen opnieuw op met een pipet van 1 ml om de cellen te scheiden en centrifugeer bij 150 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in 2 ml volledige DMEM. Centrifugeer bij 150 × g gedurende 5 min bij 4 °C. Herhaal deze stap twee keer om de cellen schoon te maken.
OPMERKING: De pellet zal nog steeds enkele weefselfragmenten hebben. - Hang de pellet opnieuw op in 1 ml volledig medium en leg de cellen in een put van een 6-put celkweekschaal in een minimale hoeveelheid medium om hun gehechtheid aan de kweekschaal te vergemakkelijken. Laat de cellen ongestoord achter in een incubator van 37 °C met 5% kooldioxide.
- Controleer na 3 dagen de cellen onder de microscoop om een goede groei dicht bij het weefselresten te verifiëren. Zodra 1.000 cellen zichtbaar zijn onder de microscoop, verwijdert u voorzichtig het weefselafval met een autoclaaf-pincet en verandert u het medium.
OPMERKING: De plaat mag niet worden verstoord; als het vereiste aantal cellen niet wordt waargenomen, plaatst u de celkweekschaal nog 2 dagen terug in de incubator. - Wanneer de cellen 70% samenvloeien (2,5 × 105),probeer ze dan en breng ze vervolgens over naar een 75 mm weefselkweekschaal.
3. Analyse van celidentiteit en morfologie
OPMERKING: Immunofluorescentiekleuring werd gebruikt om celmorfologie en endotheelcelverontreiniging te bestuderen.
- Reinig de kap met 70% v/v/ethanol. Plaats steriele afdeklips (22 mm x 22 mm) in 6-putplaten.
OPMERKING: Om de afdeklipjes te steriliseren, wast u ze met 70% ethanol en houdt u ze 's nachts in de kap onder ultraviolet licht. - Zaai 100.000 cellen per put in een 6-put plaat. Was de cellen na 24 uur tweemaal in 1x PBS en bevestig ze gedurende 20 minuten in 4% paraformaldehyde (PFA). Was de cellen nogmaals tweemaal met 1x PBS.
OPMERKING: Op dit punt kunnen de cellen in PBS bij 4 °C worden bewaard tot het begin van de kleuringsprocedure. - Om de zuiverheid van de VICs te controleren, gebruikt u alfa-gladde spier actine (αSMA), vimentine en cluster van differentiatie 31 (CD31) om besmetting met VEC's op te sporen.
- Bereid een aliquot blokkeerbuffer voor door 500 μL normaal serum (dezelfde soort als het secundaire antilichaam), 9,5 ml 1x PBS en 30 μL Triton X-100 te mengen. Incubeer de cellen gedurende 1 uur in 2 ml van de blokkeerbuffer.
- Bereid de antilichaamverdunningsbuffer voor die 30 μL Triton X-100, 10 ml 1x PBS en 0,1 g runderserumalbumine (BSA) bevat.
- Neem een lege tipsbox, vul de helft van de doos met water om een vochtige kamer te creëren. Bedek de tiphouder met een nat weefsel en vervolgens met een vel parafilm.
- Neem 1 μL van het primaire antilichaam en meng het met 100 μL van de verdunningsbuffer bereid in stap 3.5. Plaats 50 μL van het verdunde antilichaam op de parafilm. Neem de deklipjes uit de putten, draai ze om en plaats ze op de bovenkant van de druppels antilichaam; incubeer de cellen 's nachts met het antilichaam.
- Voeg 1 ml PBS toe aan de 6-putplaat. Haal voorzichtig de hoeslip uit de parafilm, draai hem om en plaats hem in de put. Was de cellen met een continue zachte agitatie gedurende 5 minuten. Vervang de PBS door verse PBS; was de cellen 3 keer.
- Incubeer de cellen met het verdunde secundaire antilichaam (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) gedurende 1 uur. Voeg 1 μL secundair antilichaam toe aan 500 μL van de antilichaamverdunningsbuffer (bereid in stap 3.5). Bedek de plaat met aluminiumfolie. Was de cellen 3 keer met 1 ml 1x PBS met continue agitatie.
- Monteer de afdeklips met 50 μL van 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)-montagemedium en observeer de cellen onder de microscoop om de morfologie van cellen en VEC-besmetting te analyseren.
4. In vitro verkalkingstest
- Reinig de afzuigkap met 70% ethanol, verwarm het DMEM medium tot 37 °C.
- Zaai 100.000 cellen/conditie in 6-put platen in volledige DMEM, en kweek gedurende 24 uur bij 37 °C.
- Bereid het verkalkingsmedium voor door 2 mM NaH2PO4,10-7 M insuline en 50 μg/ml ascorbinezuur in DMEM te mengen met 5% FBS. Voeg voor 93 ml DMEM 5 ml FBS, 1 ml antibiotica (eindconcentratie 1%), 1 ml natriumpyriet (100 ml) nah2PO4, 5,8 μL insuline en 5 mg ascorbinezuur toe.
OPMERKING: Filter de oplossing voor gebruik met een filter van 0,22 μm. - Vervang na 24 uur het supernatant medium door het verkalkingsmedium. Incubeer de cellen gedurende 7 dagen bij 37 °C. Vervang op de3e dag door een vers verkalkingsmedium en plaats de plaat terug in de incubator om de 7 dagen behandeling te voltooien.
- Verwijder na 7 dagen het medium en was de cellen tweemaal met 2 ml 1x PBS. Incubeer de cellen in 1 ml zoutzuur (HCl) van 0,6 N gedurende 24 uur bij 37 °C. Verzamel de HCl in een buis van 1,5 ml en verdamper deze in een roterende verdamper. Hang de inhoud van alle buizen opnieuw op in 60 μL HCl.
OPMERKING: De droogprocedure is belangrijk om de oplossing te concentreren en voor elke toestand hetzelfde volume te hebben. - Gebruik een 96-put plaat om de calciumconcentratie te meten met behulp van Arsenazo III reagens, verkrijgbaar in een kant-en-klare kit (zie de tabel met materialen voor meer informatie).
- Bereid een calciumstandaardoplossing van 10 mg/dl concentratie. Weeg 10 mg calciumhydroxide (Ca(OH)2) en los op in 100 ml gedestilleerd water.
- In een heldere plaat van 96 putten, pipet 2 μL blanco oplossing (HCl, 0,6 N), de standaardoplossing, het monster per put (10 mg/dl) en de monsters. Voer het experiment uit in drievoud om de pipetteervariabiliteit te verifiëren. Voeg voor elke aandoening 200 μL van het reagens toe.
OPMERKING: Monsters boven 15 mg/dl moeten 1:1 worden verdund met zoutoplossing, opnieuw worden beoordeeld en het resultaat moet met twee worden vermenigvuldigd. - Incubeer de reactie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De reactie is 60 minuten stabiel. - Lees en registreer de absorptie van de plaat bij 650 nm. Gebruik de volgende formule om de hoeveelheid calcium in de monsters te berekenen:
Calcium (mg/ml) = (absorptie van monster/absorptie van standaard) × concentratie van
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aangezien muriene aortakleppen doorgaans een diameter van 1 mm hebben, moeten ten minste drie kleppen worden samengevoegd om een miljoen levensvatbare cellen te verzamelen voor verschillende experimentele procedures. De verschillende stappen van het VIC-isolatieproces worden weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Omdat het moeilijk is om het klepweefsel handmatig te schrapen, verdient het de voorkeur om schuifspanning te gebruiken die wordt veroorzaakt door vortexing om de VEC's te verwijderen. De resultaten van de CD31-immunofluorescentiekleuring toonden inderdaad de afwezigheid van besmetting van endotheelcellen aan (figuur 3D). Bovendien drukken muis-VICs vimentine en α-SMA uit, de belangrijkste markers van klepcellen (figuur 3B, C).
Celmineralisatie in vitro
Een calciumreagenskit werd gebruikt om de calciumconcentratie te meten; cellen behandeld met verkalkingsmedium hebben een hogere calciumconcentratie in vergelijking met niet-behandelde cellen (figuur 4A). De calciumconcentratie werd genormaliseerd met de totale eiwitconcentratie. Alizarin rode kleuring bevestigde de calcium-reagens kit metingen door het tonen van rode positieve calcium knooppunten (Figuur 4B).
Figuur 1: Beschrijving van klepdissectie. (A) Representatief beeld van alle chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de dissectie, schaar 2 is nodig om de huid van de muis te openen en schaar 3 om de borst te openen. Pincet 5 en 6 zijn nodig om de huid vast te houden en de borst te openen. (B) Laat 3 mm weefsel van de aorta (zwarte pijl) achter. (C) Snijd het hart in het midden van de ventrikels met schaar nummer 4. (D) Open het hart in de richting van de aortaklep met een schaar 3. Gebruik het dunne pincet 7 en 8 om de aortaklep voorzichtig te ontleden. De klep is zichtbaar en heeft enkele zwarte stippen die kenmerkend zijn voor muizenklepweefsel (blauwe pijl). (E) Verhoog de vergroting om de aortaklep beter te visualiseren. Isoleer de klep met de kleine schaar 4; (F) het weefsel onderhouden met een pincet 7. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beschrijving van de isolatie van muizenklepcellen. Afkortingen: HEPES = 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur; RT = kamertemperatuur; DMEM = Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium; FBS = foetale runderserum. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Muisklepcelfenotype. Microscopische weergave van (A) vers geïsoleerde klepcellen. Immunofluorescentiekleuring met vimentinepositieve cellen (B) en (C) α-SMA. Cellen zijn negatief voor (D) CD31 kleuring. Schaalbalken = 200 μm. Afkortingen: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; CD31 = cluster van differentiatie 31; α-SMA = alfa-gladde spier actine. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: In vitro verkalkingstest. (A) Fosfaatrijk verkalkingsmedium geïnduceerde VIC-verkalking in vitro, gemeten met een reagenskit. (B) Microscopisch beeld met rood positieve kleuring (rechts) voor calciumknopen. (C) Alizarin rode kleuring vertoonde positieve calciumknopen (zwarte pijl) van VICs als reactie op verkalkingsmedium. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: CTL- = Control; mVICs = valvulaire interstitiële cellen van de muis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol van muisklepcelisolatie voor primaire cultuur. Drie aortakleppen van 8 weken oude muizen werden samengevoegd om een voldoende aantal cellen te verkrijgen. Bovendien beschrijft dit protocol de karakterisering van VIC-fenotype en de in vitro mineralisatietest. De methode is aangepast aan het eerder beschreven protocol uit Mathieu et al.7.
Tijdens de isolatie van aortakleppen moet ervoor worden gezorgd dat alle bronnen van mogelijke besmetting worden vermeden om de cellen te beschermen tegen bacteriële of mycoplasmabesmetting. Het is inderdaad cruciaal om alle chirurgische hulpmiddelen te autoclaafen voordat de experimenten worden gestart. De HEPES-oplossing moet worden aangevuld met 1% antibiotica om bacteriële infectie te minimaliseren. Bovendien kan mycoplasma cytopathologie veroorzaken en bijgevolg interfereren met elke parameter gemeten in celkweek10.
Het plateren van cellen in kleine kweekgerechten met een lager volume kweekmedium is van cruciaal belang voor vic-groei en proliferatie. Door het weefsel te laten bezinken en zich aan de celkweekschaal te hechten, kan de cel van het weefsel naar de vaatwand worden gemigratied. Gezien het feit dat geïsoleerde cellen van jonge muizen zich sneller verspreiden, wordt aanbevolen om cellen na 5 dagen cultuur over te brengen naar een grotere kweekschaal van 75 cm2. Het handhaven van cellen tot 80% samenvloeiing is cruciaal om de differentiatie van VICs naar een myofibroblast fenotype8te minimaliseren .
Zoals blijkt uit immunofluorescentiebeeldvorming vertonen de geïsoleerde klepcellen een fibroblastachtig fenotype. VICs hebben een langwerpig cytoplasma en drukken zowel vimentine als αSMA uit zoals beschreven in eerdere studies. Dit werk bevestigde dat het VIC-fenotype van de muis vergelijkbaar is met het eerder beschreven type voor varkens-VICs11 en menselijke VICs12. De meeste in vitro studies naar aortastenose worden uitgevoerd op cellen van grote dieren8,11. Het belangrijkste nadeel van varkens-VICs is hun spontane differentiatie naar een osteoblastfenotype in vitro, zelfs in normale media13. Muis-VICs verkalken echter niet spontaan, zelfs niet bij hogere passages.
Muis-VICs onderscheiden zich van het osteoblastfenotype als reactie op verkalkingsmedium met behulp van ascorbinezuur, insuline en fosfaatstimulatie. Dit artikel beschrijft een kwantitatieve methode van calciummeting met behulp van een kit en een kwalitatieve methode met behulp van Alizarin rode kleuring. Beide methoden vertoonden een significante toename van verkalking als reactie op een verkalking van de mediumbehandeling. De calciummeetkit is de gouden standaardmethode, die een exacte kwantitatieve calciummetingbiedt 14.
In het Arsenazo III-reagens wordt magnesiuminterferentie voorkomen door de opname van 8-hydroxyquinolinesulfonaat. Calcium reageert met het reagens om een paars gekleurd complex te vormen, dat absorbeert bij 650 nm. De intensiteit van de kleur is evenredig met de calciumconcentratie. De nauwkeurigheid van het Arsenazo-III reagens werd eerder gevalideerd met atoomabsorptiespectrofotometrie. Dezelfde methode wordt in klinische laboratoria gebruikt om de totale calciumconcentratie in biologische vloeistoffen te meten14. De verkalking bij aortastenose is voornamelijk hydroxyapatiet, zoals blijkt uit dispersieve röntgenenergiescan elektronenmicroscopieanalyse7,12,15. Het is inderdaad belangrijk om de verkalking van het celmembraan te analyseren in plaats van vrij calcium om de verkalking van het aortaklepweefsel nauwkeuriger na te bootsen.
Muizen vormen een goede bron van VICs voor de studie van moleculaire mechanismen die leiden tot aortaklepverkalking. Houd er echter rekening mee dat VICs in vitro niet vergelijkbaar zijn met VICs in levende kleppen. Een andere beperking is het feit dat een pool van kleppen van 3-5 muizen nodig is om een eencellige cultuur te maken. Het zwembad moet van nestgenotenmuizen zijn om variaties te minimaliseren. Bovendien moeten experimenten in drievoud worden uitgevoerd om alle bevindingen te bevestigen. Het gebruik van de hele aortaklep in de cultuur kan deze beperking echter verlichten. Niettemin moeten deze in vitro studies worden gevalideerd in menselijk weefsel om de bevindingen te versterken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C.
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P.
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
