Summary
Denne artikkelen beskriver isolering av museaortaventilceller ved hjelp av en to-trinns kollagenalensprosedyre. Isolerte museventilceller er viktige for å utføre forskjellige analyser, for eksempel denne in vitro-forkalkningsanalysen, og for å undersøke de molekylære veiene som fører til aortaventilmineralisering.
Abstract
Forkalkning av aortaventilceller er kjennetegnet på aortastenose og er forbundet med ventil cusp fibrose. Ventilinterstitielle celler (VICs) spiller en viktig rolle i forkalkningsprosessen i aortastenose gjennom aktivering av deres dedifferentiasjonsprogram til osteoblastlignende celler. Mouse VICs er et godt in vitro-verktøy for belysning av signalveiene som driver mineraliseringen av aortaventilcellen. Metoden beskrevet heri, vellykket brukt av disse forfatterne, forklarer hvordan du får tak i nyisolerte celler. En to-trinns kollagenalisseprosedyre ble utført med 1 mg/ml og 4,5 mg/ml. Det første trinnet er avgjørende for å fjerne endotelcellelaget og unngå forurensning. Den andre kollagenalinkubasjonen er å lette migreringen av VIC-er fra vevet til platen. I tillegg diskuteres en immunfluorescensfargingsprosedyre for fenotypekarakterisering av de isolerte museventilcellene. Videre ble forkalkningsanalysen utført in vitro ved hjelp av kalsiumreagensmålingsprosedyren og alizarin rød farging. Bruk av museventilcelle primærkultur er avgjørende for å teste nye farmakologiske mål for å hemme cellemineralisering in vitro.
Introduction
Forkalket aortaklaffsykdom (CAVD) er den mest utbredte valvulære hjertesykdommen i vestlige populasjoner, som påvirker nesten 2,5% av eldre personer over 65 år1. CAVD påvirker over seks millioner amerikanere og er forbundet med endringer i de mekaniske egenskapene til brosjyrene som svekker normal blodstrømgjennomstrømning 1,2. For tiden er det ingen farmakologisk behandling for å stoppe sykdomsprogresjonen eller for å aktivere mineralregresjon. Den eneste effektive behandlingen for å behandle CAVD er aortaventilutskifting ved kirurgi eller transkateter aortaventil erstatning3. Det er derfor viktig å undersøke molekylære mekanismer som fører til ventilmineralisering for å identifisere nye farmakologiske mål. Faktisk har ikke-behandlet aortastenose flere negative konsekvenser som venstre ventrikel dysfunksjon og hjertesvikt4.
Aortaventilen består av tre lag kjent som fibrosa, spongiosa og ventrikulæris, som inneholder VICer som den dominerende celletypen5. Fibrosa og ventrikkel er dekket av et lag av vaskulære endotelceller (VECer)5. VECene regulerer permeabiliteten til inflammatoriske celler samt parakrinesignaler. Økt mekanisk stress kan påvirke integriteten til VECene og forstyrre homeostase av aortaventilen, noe som fører til inflammatorisk celleinvasjon6. Skanning av elektronmikroskopianalyser viste forstyrret endotel i en menneskelig forkalket aortaventil7.
Histologiske analyser av forkalket vev avslører tilstedeværelsen av osteoblaster og osteoklaster. Videre ble osteogen differensiering av VICs observert både in vitro og i humant ventilvev8. Denne prosessen er hovedsakelig orkestrert av Runt-relatert transkripsjonsfaktor 2 (Runx2) og benmorfogenetiske proteiner (BMPer)8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyreprosedyrer som er beskrevet her, er godkjent av Icahn School of Medicine ved Mount Sinai institusjonelle kjerne- og brukskomité.
1. Klargjøring før ventilcelleisolasjon fra voksne mus
- Rengjør og steriliser alle kirurgiske instrumenter som er vist i figur 1A ved å bruke 70 % v/v etanol og deretter autoklavere dem i 30 min. Rengjør det kirurgiske arbeidsområdet med 70 % etanol.
- Tilsett 500 μL penicillin-streptomycin til 50 ml 10 mm HEPES. Forbered en aliquot på 50 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Hold løsningene på is.
- Forbered 1 mg/ml og 4,5 mg/ml kollagenaseløsninger, og bruk 5 ml av hver oppløsning i 15 ml rør for å utføre hele prosedyren. For å forberede 5 ml 1 mg/ml kollagenalus, bland 5 mg kollagenal med 2,5 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, foster bovin serum (FBS)-fri) og 2,5 ml 10 mM HEPES supplert med antibiotika (1% penicillin-streptomycin fra trinn 1.2). Filtrer løsningene gjennom et 0,22 μm filter for å fjerne forurensning.
MERK: Hold løsningene på isen for å beskytte enzymene. - Varm DMEM-oppløsningen til 37 °C før bruk i alle trinnene som er beskrevet nedenfor. Forbered hele mediet ved å supplere DMEM med 1% penicillin-streptomycin, 1% natriumpyrominitt, 5 ml 200 mM L-glutamin, 1 ml mykoplasma elimineringsreagens (se materialtabellen) og 10% FBS.
2. Isolering av ventilceller
- For å få 106 celler til eksperimentet, bruk fem 8 uker gamle mus (minimum tre). Plasser musen i et induksjonskammer sammen med et lite stykke vevspapir gjennomvåt med 1 ml isofluran, men ikke tillat kontakt med vevet. For å bekrefte at dyret er fullstendig bedøvet; se etter tå klype refleks, og deretter euthanize musen ved cervical dislokasjon. Bruk isofluran for å lindre eventuelle smerter før livmorhalsen dislokasjon som prosedyren beskrevet nedenfor er terminal.
- Plasser musen på en dissekeringsplattform, og fest potene med kanyler for å holde den på plass. Rengjør brystet og magen med etanol; åpne magen og brystet med saks. Med liten kirurgisk saks, kutt mellom venstre atrium og venstre ventrikel for å ekssanguinere musen. Perfuse hjertet med 10 ml kaldt 1x PBS for å fjerne blod fra hjertet.
- Klipp hjertet, og hold 3 mm fra stigende aorta som vist i figur 1B. Disseker aortaventilen under et stereomikroskop. Klipp hjertet horisontalt midt på ventriklene (Figur 1C). Klipp venstre ventrikel mot aorta, og disseker forsiktig aortaventilen (Figur 1D-F). Legg ventilene sammen i en liten 35 mm vevskulturrett.
- Vask de isolerte ventilene i en 75 mm cellekulturfat med 5 ml kald HEPES (10 mM) supplert med antibiotika (1% penicillin-streptomycin) for å fjerne blod (Figur 2). Forbered to 15 ml rør med kollagenalisse 1 mg/ml og 4,5 mg/ml som beskrevet ovenfor i trinn 1.3.
MERK: Etter disseksjonen manipulerer du de isolerte ventilene i en steril biosikkerhetshette for å minimere forurensning. - Inkuber ventilene i kollagenalus type I (1 mg/ml) i 30 min ved 37 °C med kontinuerlig risting (Figur 2). Sentrifuger røret i 5 min ved 150 × g, vask pellet en gang med 2 ml HEPES (10 mM) og virvel i 30 s ved høy hastighet. Hell innholdet i dette røret i en 35 mm kulturrett, og overfør forsiktig fragmentene av vev ved hjelp av tynne pinsett i et nytt rør.
MERK: På dette stadiet er VICene fortsatt ikke dissosiert fra vevet, og pellet inneholder biter av vev. For å unngå kontaminering med endotelceller må du ikke sentrifuge etter virvel i trinn 2.5. - Inkuber pelletsen i et 15 ml rør med 5 ml kollagentype I (4,5 mg/ml) ved 37 °C under kontinuerlig agitasjon i 35 minutter. Re-suspendere cellene med en 1 ml pipette for å skille cellene, og sentrifuge ved 150 × g i 5 min ved 4 °C.
- Kast supernatanten, og sett pelletsen på nytt i 2 ml fullstendig DMEM. Sentrifuge ved 150 × g i 5 min ved 4 °C. Gjenta dette trinnet to ganger for å rense cellene.
MERK: Pellet vil fortsatt ha noen vevsfragmenter. - Re-suspendere pellet i 1 ml komplett medium, og plate cellene i en brønn av en 6-brønns celle kulturrett i et minimum av medium for å lette deres vedlegg til kulturretten. La cellene være uforstyrret i en inkubator på 37 °C med 5 % karbondioksid.
- Etter 3 dager, sjekk cellene under mikroskopet for å verifisere god vekst nær vevsavfallet. Når 1000 celler er synlige under mikroskopet, fjern forsiktig vevsrester med autoklavede pinsett, og bytt medium.
MERK: Platen må ikke forstyrres. Hvis det nødvendige antall celler ikke blir observert, plasser cellekulturretten tilbake i inkubatoren i ytterligere 2 dager. - Når cellene er 70% confluent (2,5 × 105), prøv og overfør dem deretter til en 75 mm vevskulturrett.
3. Analyse av celleidentitet og morfologi
MERK: Immunfluorescensfarging ble brukt til å studere cellemorfologi og endotelcelleforurensning.
- Rengjør hetten med 70% v / v / etanol. Plasser sterile deksler (22 mm x 22 mm) i 6-brønnsplater.
MERK: For å sterilisere dekslene, vask dem med 70% etanol, og hold dem i hetten over natten under ultrafiolett lys. - Frø 100.000 celler per brønn i en 6-brønns plate. Etter 24 timer, vask cellene to ganger i 1x PBS, og fest dem i 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min. Vask cellene igjen to ganger med 1x PBS.
MERK: På dette tidspunktet kan cellene oppbevares i PBS ved 4 °C til begynnelsen av fargingsprosedyren. - For å bekrefte renheten til VICene, bruk alfa-glatt muskel actin (αSMA), vimentin og klynge av differensiering 31 (CD31) for å oppdage forurensning med VECer.
- Forbered et aliquot av blokkeringsbuffer ved å blande 500 μL normalt serum (samme art som sekundært antistoff), 9,5 ml 1x PBS og 30 μL Triton X-100. Inkuber cellene i 2 ml av blokkeringsbufferen i 1 time.
- Klargjør antistofffortynningsbufferen som inneholder 30 μL Triton X-100, 10 ml 1x PBS og 0,1 g bovint serumalbumin (BSA).
- Ta en tom tipsboks, fyll halvparten av esken med vann for å lage et fuktig kammer. Dekk spissholderen med et vått vev og deretter med et ark med parafilm.
- Ta 1 μL av det primære antistoffet, og bland det med 100 μL av fortynningsbufferen fremstilt i trinn 3.5. Plasser 50 μL av det fortynnede antistoffet på parafilmen. Ta dekslene fra brønnene, snu dem over og legg dem på toppen av dråpene av antistoff; inkuber cellene over natten med antistoffet.
- Tilsett 1 ml PBS i 6-brønnsplaten. Ta forsiktig ut dekslene fra parafilmen, snu den og legg den i brønnen. Vask cellene med en kontinuerlig mild agitasjon i 5 min. Bytt ut PBS med frisk PBS; vask cellene 3 ganger.
- Inkuber cellene med det fortynnede sekundære antistoffet (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) i 1 time. Tilsett 1 μL sekundært antistoff til 500 μL av antistofffortynningsbufferen (fremstilt i trinn 3.5). Dekk platen med aluminiumsfolie. Vask cellene 3 ganger med 1 ml 1x PBS med kontinuerlig agitasjon.
- Monter dekslene med 50 μL 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)-monteringsmedium, og observer cellene under mikroskopet for å analysere morfologien til celler og VEC-forurensning.
4. In vitro forkalkningsanalyse
- Rengjør hetten med 70 % etanol, varm DMEM-mediet til 37 °C.
- Frø 100.000 celler/tilstand i 6-brønnsplater i komplett DMEM, og kultur i 24 timer ved 37 °C.
- Forbered forkalkningsmediet ved å blande 2 mM NaH2PO4,10-7 M insulin og 50 μg/ml askorbinsyre i DMEM med 5% FBS. For 93 ml DMEM, tilsett 5 ml FBS, 1 ml antibiotika (sluttkonsentrasjon 1%), 1 ml natriumpyminuvat (100 mM), 27,5 mg NaH2PO4, 5,8 μL insulin og 5 mg askorbinsyre.
MERK: Filtrer oppløsningen med et 0,22 μm filter før bruk. - Etter 24 timer, erstatt det supernatante mediet med forkalkningsmediet. Inkuber cellene i 7 dager ved 37 °C. På 3rd dagen, erstatt med friskt forkalkningsmedium, og legg platen tilbake i inkubatoren for å fullføre de 7 dagene med behandling.
- Etter 7 dager, fjern mediet, og vask cellene to ganger med 2 ml 1x PBS. Inkuber cellene i 1 ml 0,6 N saltsyre (HCl) i 24 timer ved 37 °C. Samle HCl i et 1,5 ml rør, og fordamp det i en roterende fordamper. Re-suspendere innholdet i alle rørene i 60 μL HCl.
MERK: Tørkeprosedyren er viktig for å konsentrere løsningen og ha samme volum for hver tilstand. - Bruk en 96-brønnsplate for å måle kalsiumkonsentrasjon ved hjelp av Arsenazo III reagens, tilgjengelig i et bruksklart sett (se materialtabellen for mer informasjon).
- Forbered en kalsiumstandardløsning på 10 mg / dl konsentrasjon. Vei 10 mg kalsiumhydroksid (Ca(OH)2) og oppløs i 100 ml destillert vann.
- I en klar 96 brønnplate, pipet 2 μL blank oppløsning (HCl, 0,6 N), standardløsningen, prøven per brønn (10 mg / dl) og prøvene. Utfør eksperimentet i triplikat for å bekrefte pipetteringsvariabiliteten. Tilsett 200 μL av reagenset for hver tilstand.
MERK: Prøver over 15 mg/dl skal fortynnes 1:1 med saltvann, analysert på nytt og resultatet multiplisert med to. - Inkuber reaksjonen i 15 min ved romtemperatur.
MERK: Reaksjonen er stabil i 60 min. - Les og registrer absorbansen av platen ved 650 nm. Bruk følgende formel til å beregne mengden kalsium i prøvene:
Kalsium (mg/ml) = (Absorbans av prøve/absorbans av standard) × Konsentrasjon av standard
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siden murine aortaventiler vanligvis er 1 mm i diameter, må minst tre ventiler samles for å samle en million levedyktige celler for forskjellige eksperimentelle prosedyrer. De ulike trinnene i VIC-isolasjonsprosessen er vist i figur 1 og figur 2. Siden det er vanskelig å skrape ventilvevet manuelt, er det å foretrekke å bruke skjærspenning opprettet ved vortexing for å fjerne VECene. Faktisk viste CD31 immunfluorescence farging resultater fraværet av endotelceller forurensning (Figur 3D). I tillegg uttrykker mus VICs vimentin og α-SMA, som er de viktigste markørene for ventilceller (Figur 3B,C).
Celle mineralisering in vitro
Et kalsiumreagenssett ble brukt til å måle kalsiumkonsentrasjonen; celler behandlet med forkalkningsmedium har høyere kalsiumkonsentrasjon sammenlignet med ikke-behandlede celler (Figur 4A). Konsentrasjonen av kalsium ble normalisert med den totale proteinkonsentrasjonen. Alizarin rød farging bekreftet kalsiumreagenssettmålingene ved å vise røde positive kalsiumnoder (Figur 4B).
Figur 1: Beskrivelse av ventil disseksjon. (A) Representativt bilde av alle kirurgiske instrumenter som trengs for disseksjonen, saks 2 er nødvendig for å åpne huden på musen og saks 3 for å åpne brystet. Pinsett 5 og 6 er nødvendig for å holde huden og åpne brystet. (B) La det være 3 mm vev fra aorta (svart pil). (C) Skjær hjertet midt på ventriklene med saks nummer 4. (D) Åpne hjertet mot aortaventilen med saks 3. Bruk de tynne pinsettene 7 og 8 for å forsiktig dissekere aortaventilen. Ventilen er synlig og har noen svarte prikker som er karakteristiske for musventilvev (blå pil). (E) Øk forstørrelsen for å visualisere aortaventilen bedre. Isoler ventilen med den lille saksen 4; (F) opprettholde vevet med pinsett 7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ beskrivelse av celleisolasjon av museventilen. Forkortelser: HEPES = 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre; RT = romtemperatur; DMEM = Dulbeccos modifiserte Eagle medium; FBS = foster bovin serum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Musventilcellefenotype. Mikroskopisk visning av (A) nyisolerte ventilceller. Immunfluorescensfarging som viser (B) vimentinpositive celler og (C) α-SMA. Celler er negative for (D) CD31-flekker. Skalastenger = 200 μm. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; CD31 = differensieringsklynge 31; α-SMA = alfa-glatt muskel aktin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: In vitro forkalkningsanalyse. (A) Fosfatrik forkalkning medium indusert VIC forkalkning in vitro, som ble målt med et reagenssett. (B) Mikroskopisk bilde som viser rød positiv farging (høyre) for kalsiumnoder. (C) Alizarin rød farging viste positive kalsiumnoder (svart pil) av VICs som svar på forkalkningsmedium. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: CTL- = Kontroll; mVICer = valvulære interstitialceller med mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for museventilcelleisolasjon for primærkultur. Tre aortaventiler fra 8 uker gamle mus ble samlet for å oppnå et tilstrekkelig antall celler. I tillegg beskriver denne protokollen karakteriseringen av VIC fenotype og in vitro mineraliseringsanalysen. Metoden ble tilpasset fra den tidligere beskrevne protokollen fra Mathieu et al.7.
Under isolering av aortaventiler må det tas hensyn til å unngå alle kilder til mulig smitte for å beskytte cellene mot bakteriell eller mykoplasmaforurensning. Faktisk er det avgjørende å autoklavere alle kirurgiske verktøy før du starter forsøkene. HEPES-løsningen bør suppleres med 1% antibiotika for å minimere bakteriell infeksjon. Videre kan mykoplasma forårsake cytopatomologi og følgelig forstyrre hver parameter målt i cellekultur10.
Plating celler i små kultur retter med lavere volum av kultur medium er avgjørende for VIC vekst og spredning. Å la vevet bosette seg og holde seg til cellekulturretten tillater cellemigrasjon fra vevet til parabolveggen. Gitt at isolerte celler fra unge mus sprer seg raskere, anbefales det å overføre celler til en større kulturrett på 75 cm2 etter 5 dager med kultur. Opprettholde celler til 80% samløp er avgjørende for å minimere differensiering av VICs til en myofibroblast fenotype8.
Som vist ved immunfluorescensavbildning viser de isolerte ventilcellene en fibroblastlignende fenotype. VICs har en langstrakt cytoplasma og uttrykker både vimentin og αSMA som beskrevet av tidligere studier. Det nåværende arbeidet bekreftet at musen VIC fenotype ligner den som tidligere er beskrevet for porcin VICs11 og human VICs12. De fleste in vitro-studier på aortastenose utføres på celler fra store dyr8,11. Den viktigste ulempen ved porcin VICs er deres spontane differensiering til en osteoblast fenotype in vitro selv i normale medier13. Imidlertid forkalker mus VICs ikke spontant selv ved høyere passasjer.
Mouse VICs skiller seg fra osteoblastfenotypen som svar på forkalkningsmedium ved hjelp av askorbinsyre, insulin og fosfatstimulering. Denne artikkelen beskriver en kvantitativ metode for kalsiummåling ved hjelp av et sett og en kvalitativ metode ved hjelp av Alizarin rød farging. Begge metodene viste betydelig økning av forkalkning som svar på forkalkning av middels behandling. Kalsiummålingssettet er gullstandardmetoden, som tilbyr en nøyaktig kvantitativ kalsiummåling14.
I Arsenazo III-reagenset forhindres magnesiumforstyrrelser ved inkludering av 8-hydroksyquinolinsulfonat. Kalsium reagerer med reagenset for å danne et lilla farget kompleks, som absorberer ved 650 nm. Fargens intensitet er proporsjonal med kalsiumkonsentrasjonen. Nøyaktigheten av Arsenazo-III-reagenset ble tidligere validert med atomabsorpsjonsspektrofotometri. Den samme metoden brukes i kliniske laboratorier for å måle total kalsiumkonsentrasjon i biologiske væsker14. Forkalkningen i aortastenose er hovedsakelig hydroksyapatitt, som vist med dispergerende røntgenenergiskanning elektronmikroskopianalyse7,12,15. Faktisk er det viktig å analysere forkalkningen av cellemembranen i stedet for fritt kalsium for mer nøyaktig å etterligne forkalkningen av aortaventilvevet.
Mus representerer en god kilde til VICs for studiet av molekylære mekanismer som fører til aortaventilforkalkning. Husk imidlertid at VICs in vitro ikke ligner PÅ VICs i levende ventiler. En annen begrensning er det faktum at et basseng med ventiler fra 3-5 mus er nødvendig for å lage en enkelt cellekultur. Bassenget bør være fra kullmus for å minimere variasjoner. I tillegg bør eksperimenter utføres i triplikat for å bekrefte alle funn. Bruken av hele aortaventilen i kulturen kan imidlertid lindre denne begrensningen. Likevel må disse in vitro-studiene valideres i humant vev for å styrke funnene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C.
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P.
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
