Summary
この記事では、2段階コラゲターゼ法によるマウス大動脈弁細胞の単離について説明します。孤立したマウス弁細胞は、この インビトロ 石灰化アッセイのような異なるアッセイを行う場合や、大動脈弁鉱化につながる分子経路を調べるために重要です。
Abstract
大動脈弁細胞の石灰化は大動脈狭窄の特徴であり、弁カスプ線維症に関連している。弁間質細胞(VIC)は、骨芽細胞様細胞への脱分化プログラムの活性化を通じて大動脈狭窄における石灰化プロセスにおいて重要な役割を果たす。マウスVICは大動脈弁細胞の鉱化を駆動するシグナル伝達経路の解明のための良いインビトロツールである。本明細書に記載された方法は、これらの著者によってうまく使用され、新たに単離された細胞を得る方法を説明する。2段階コラゲナーゼ処置を1mg/mLおよび4.5mg/mLで行った。最初のステップは、内皮細胞層を除去し、汚染を避けるために重要です。第2のコラゲナーゼインキュベーションは、組織からプレートへのVICの移行を容易にすることである。また、単離されたマウス弁細胞の表現型特性評価のための免疫蛍光染色法についても議論される。さらに、カルシウム試薬測定手順およびアリザリン赤染色を用いてインビトロで石灰化アッセイを行った。マウスバルブ細胞一次培養の使用は、インビトロで細胞の無機化を阻害する新しい薬理学的標的を試験するために不可欠です。
Introduction
石灰化大動脈弁疾患(CAVD)は、西洋集団において最も一般的な弁膜心疾患であり、1歳の65歳以上の高齢者の2.5%近くに影響を及ぼす。CAVDは600万人以上のアメリカ人に影響を及ぼし、正常な血流を損なうリーフレットの機械的特性の変化に関連している-1,2.現在、疾患の進行を止めたり、ミネラル退縮を活性化したりする薬理学的治療法はない。CAVDを治療するための唯一の有効な治療法は、手術または経カテーテル大動脈弁置換術3による大動脈弁置換術である。したがって、新しい薬理学的標的を特定するためには、バルブの鉱物化につながる分子メカニズムを調査することが不可欠です。実際、非治療大動脈狭窄症は、左心室機能不全および心不全4のようないくつかの有害な結果を有する。
大動脈弁は、線維症、海綿体、心室症と呼ばれる3層から構成され、NICを主な細胞タイプ5として含んでいる。線維症と心室は血管内皮細胞(VEC)5の層で覆われている。VECは、炎症細胞の透過性とパラクリンシグナルを調節します。増加した機械的ストレスは、VECの完全性に影響を及ぼし、大動脈弁の恒常性を乱し、炎症細胞の浸潤につながる6.走査型電子顕微鏡分析は、ヒト石灰化大動脈弁7において破壊された内皮を示した。
石灰化組織の組織学的分析は、骨芽細胞および破骨細胞の存在を明らかにする。さらに、VICの骨形成分化は、インビトロおよびヒト弁組織8の両方で観察された。このプロセスは、主に、ラント関連転写因子2(Runx2)および骨形態形成タンパク質(BMP)8,9によって調整される。
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Protocol
注:ここで説明されているすべての動物の手順は、マウントシナイ機関コアと使用委員会のIcahn医学部によって承認されています。
1. 成体マウスからの弁細胞分離前の調製
- 図1Aに示す手術器具をすべて洗浄し、70%のv/vエタノールを使用し、その後30分間オートクレーブして、70%エタノールで手術用ワークスペースを洗浄します。
- 500 μLのペニシリンストレプトマイシンを50 mLの10 mm HEPESに加えます。50 mLの 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のアリコートを準備します。氷の上にソリューションを維持します。
- 1 mg/mLおよび4.5 mg/mLコラゲナーゼ溶液を調製し、15 mLチューブ内の各溶液の5 mLを使用して、全手順を実行します。1 mg/mLコラゲラーゼの5 mLを調製するには、5 mgのコラゲラーゼと2.5mLのダルベックコの変性イーグル培地(DMEM、ウシ胎児血清(FBS)フリー))と10mM HEPESの2.5 mLを抗生物質(1%ペニシリン・ストレプトマイシンステップ1.2から)を混ぜます。0.22 μmフィルターでソリューションをフィルター処理して、汚染を除去します。
注:酵素を保護するために氷の上にソリューションを保管してください。 - DMEM溶液を37°Cに温め、下記のすべてのステップで使用してください。DMEMを1%ペニシリンストレプトマイシン、1%ピルビン酸ナトリウム、200 mM L-グルタミンの5 mL、マイコプラズマ除去試薬1 mL( 材料表を参照)、FBS 10% で完全培地を調製します。
2. バルブセルの分離
- 実験のために106 細胞を得るために、5つの8週齢のマウス(最低3匹)を使用する。イオブルランの1 mLを浸したティッシュペーパーの小片と一緒に誘導チャンバーにマウスを置くが、組織との接触を許可しない。動物が完全に麻酔されていることを確認する。つま先のピンチ反射をチェックし、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。後述の手順が終末であるように、子宮頸部転位前の痛みを軽減するためにイオブルランを使用する。
- 解剖プラットフォーム上にマウスを置き、それを所定の位置に保持するためにカニューレで足を固定します。胸と腹部をエタノールで洗浄します。腹部と胸をはさみで開きます。小さな外科用ハサミで、左心房と左心室の間を切り取り、マウスを外装する。心臓から血液を除去するために10 mLの冷たい1x PBSで心臓を浸透させます。
- 心臓を切り、図1Bに示すように、上がりの大オルタから3mmを保ちます。大動脈弁を実体顕微鏡で解剖する。心室の中央に心臓を水平に切り取る(図1C)。左心室を大動脈に向かって切り、大動脈弁を慎重に解剖する(図1D-F)。小さい35 mmティッシュ培養皿の中に弁を一緒にプールしなさい。
- 分離弁を75mm細胞培養皿で洗浄し、5 mLの冷たいHEPES(10 mM)に抗生物質(1%ペニシリンストレプトマイシン)を加えて血液を除去する(図2)。ステップ1.3で上述したようにコラゲナーゼ1mg/mLと4.5mg/mLの2つの15 mLチューブを調製します。
注:解剖後、無菌バイオセーフティフード内の隔離されたバルブを操作して、汚染を最小限に抑えます。 - コラゲターゼタイプI(1mg/mL)でバルブを37°Cで30分間連続揺動してインキュベートする(図2)。チューブを150×gで5分間遠心し、2mLのHEPES(10mM)で1回ペレットを洗浄し、渦を30s高速で30sで洗浄します。 このチューブの内容物を35mm培養皿に注ぎ、薄いピンセットを使って慎重に組織の断片を新しいチューブに移します。
注:この段階では、VICはまだ組織から解離されず、ペレットには組織の破片が含まれています。内皮細胞との汚染を避けるために、ステップ2.5で渦を巻いた後に遠心分離しないでください。 - 37°CのコラゲターゼタイプI型5mL(4.5mg/mL)を35分間連続撹拌して15mLチューブにインキュベートします。細胞を1 mLピペットで再懸濁して細胞を分離し、遠心分離機を150×gで4°Cで5分間再中断します。
- 上清を捨て、ペレットを完全DMEMの2mLに再び懸濁します。遠心分離機150×gで5分間4°Cで5分間。 この手順を 2 回繰り返して、セルをクリーニングします。
注:ペレットにはまだいくつかの組織断片があります。 - ペレットを完全培地1 mLに再懸濁し、培養皿への付着を容易にするために、6ウェル培養皿の1ウェルに細胞を最低量の培地でプレートします。細胞を、邪魔されずに、5%の二酸化炭素を含む37°Cインキュベーターに残す。
- 3日後、顕微鏡下の細胞をチェックして、組織の破片に近い良好な成長を確認します。顕微鏡下で1,000個の細胞が見えるようになったら、オートクレーブされたピンセットで組織の破片を慎重に取り除き、培地を変えます。
注:プレートが邪魔されるべきではありません。必要な数の細胞が観察されない場合は、細胞培養皿をインキュベーターに2日間戻します。 - 細胞が70%コンフルエント(2.5×105)である場合、トリプシン化し、75mmの組織培養皿に移します。
3. 細胞の同一性と形態の解析
注:免疫蛍光染色は、細胞形態および内皮細胞汚染を研究するために使用された。
- 70%v/v/エタノールでフードを清掃してください。滅菌カバーリップ(22 mm x 22 mm)を6ウェルプレートに入れます。
注:カバーリップを殺菌するには、70%エタノールで洗浄し、紫外線の下で一晩フードに保管してください。 - 6ウェルプレートに1ウェルあたり100,000個の細胞をシードします。24時間後、1x PBSで細胞を2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で20分間固定します。1倍PBSで細胞を再び2回洗います。
注:この時点で、細胞は染色手順の開始まで4°CでPBSに保つことができた。 - VICの純度を検証するには、Α平滑筋アクチン(αSMA)、ビメンチン、および分化31(CD31)のクラスターを使用して、VECによる汚染を検出する。
- 500 μLの正常血清(二次抗体と同じ種)、9.5 mLの1x PBS、30 μLのTriton X-100を混合してブロッキングバッファーのアリコートを用意します。細胞を2mLのブロッキングバッファーに1時間インキュベートする。
- トリトンX-100の30μL、1x PBSの10 mL、および0.1gのウシ血清アルブミン(BSA)を含む抗体希釈バッファーを調製する。
- 空のヒントボックスを取り、湿気の多い部屋を作成するために水で箱の半分を埋めます。チップホルダーを濡れたティッシュで覆い、次にパラフィルムのシートで覆います。
- 1次抗体を1μLとし、ステップ3.5で調製した希釈バッファーの100 μLと混合します。50μLの希釈抗体をパラフィルムに配置します。ウェルからカバースリップを取り、それらをひっくり返し、抗体の滴の上に置きます。抗体で細胞を一晩インキュベートする。
- 6ウェルプレートにPBS 1 mLを加えます。慎重にパラフィルムからカバースリップを取り出し、それをひっくり返し、井戸に置きます。細胞を5分間、穏やかな撹拌で洗浄します。PBS を新しい PBS に置き換えます。細胞を3回洗う。
- 希釈した二次抗体(1/500)(Alexa-488、Alexa-555)を1時間インキュベートします。2次抗体の1 μLを抗体希釈バッファーの 500 μL に加えます(ステップ 3.5 で作成)。プレートをアルミホイルで覆います。連続撹拌で1mLの1x PBSで細胞を3回洗浄します。
- カバーリップを4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)実装媒体の50 μLで取り付け、顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の形態とVEC汚染を解析します。
4. インビトロ 石灰化アッセイ
- 70%エタノールでフードを洗浄し、DMEM培地を37°Cに温めます。
- 完全なDMEMで6ウェルプレートに100,000個の細胞/条件をシードし、37°Cで24時間培養します。
- 2 mM の NaH2PO4、10-7 Mインスリン、および 5% FBS の DMEM で 50 μg/mL アスコルビン酸を混合して石灰化培地を調製します。DMEMの93 mLの場合、FBSの5 mL、抗生物質1mL(最終濃度1%)、ピルビン酸ナトリウム(100mM)の1mL、NaH2PO4の27.5mg、インスリン5.8μL、アスコルビン酸5mgを加えます。
注:使用前に0.22 μmフィルタを使用して溶液をフィルタリングしてください。 - 24時間後、上清培地を石灰化媒体に交換する。37°Cで7日間細胞をインキュベートする。 3日目 に、新鮮な石灰化培地に交換し、プレートをインキュベーターに戻して7日間の治療を完了します。
- 7日後、培地を取り出し、2mLの1xPBSで細胞を2回洗浄した。37°Cで24時間0.6 N塩酸(HCl)の1 mLで細胞をインキュベートする。 HClを1.5 mLチューブに集め、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、HClの60 μLですべての管の内容物を再中断します。
注:乾燥手順は、溶液を集中させ、各条件に同じ体積を持つために重要です。 - 96ウェルプレートを使用して、すぐに使用できるキットで入手可能なアルセナゾIII試薬を使用してカルシウム濃度を測定します(詳細については 、材料表 を参照)。
- 10 mg/dL濃度のカルシウム標準溶液を調製します。水酸化カルシウム(OH)2の10mgを秤量し、100mLの蒸留水に溶解します。
- 透明な96ウェルプレート、ブランク溶液(HCl、0.6 N)のピペット2 μL、標準溶液、ウェル当たりのサンプル(10mg/dL)、およびサンプル。三重で実験を行い、ピペットの変動性を確認します。各条件に対して200μLの試薬を加えます。
注:15mg/dLを超えるサンプルは、生理食塩水で1:1を希釈し、再アッセイし、結果に2を掛ける必要があります。 - 反応を室温で15分間インキュベートします。
注:反応は60分間安定しています。 - 650 nmでプレートの吸光度を読み取り、記録します。サンプル中のカルシウムの量を計算するには、次の式を使用します。
カルシウム(mg/mL)=(標準のサンプル/吸光度の吸光度)×標準の濃度
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Representative Results
マウス大動脈弁は通常直径1mmであるため、異なる実験手順のために100万個の生存細胞を収集するために少なくとも3つのバルブをプールする必要があります。VIC 分離プロセスの異なる手順を図1と図 2に示します。バルブ組織を手動で削ることが困難であるため、渦を除去して渦を除去することによって生じるせん断応力を使用することが好ましい。実際、CD31免疫蛍光染色結果は、内皮細胞の汚染の欠如を示した(図3D)。また、マウスVICは、バルブセルの主要マーカーであるビメンチンおよびα-SMAを発現する(図3B、C)。
インビトロでの細胞の鉱物化
カルシウム試薬キットを使用してカルシウム濃度を測定しました。石灰化培地で処理した細胞は、非処理細胞に比べてカルシウム濃度が高い(図4A)。カルシウムの濃度を全タンパク質濃度で正規化した。アリザリン赤染色は、赤陽性カルシウムノードを示すことによってカルシウム試薬キットの測定を確認した(図4B)。
図1:弁解の説明(A)解剖に必要なすべての手術器具の代表的な画像、はさみ2は、胸部を開くためにマウスとハサミ3の皮膚を開くために必要である。ピンセット5と6は、皮膚を保持し、胸を開くために必要とされます。(B)大大間(黒矢印)から3mmの組織を残す。(C)心室の中央にある心臓をハサミ4で切る。(D) 心臓をはさみ3で大動脈弁に向かって開く。薄いピンセット7と8を使用して、大動脈弁を慎重に解剖します。弁は目に見えるし、マウスの弁ティッシュ(青い矢印)の特徴であるいくつかの黒い点を有する。(E) 大動脈弁をよりよく視覚化するために拡大率を上げる。小さいはさみ4で弁を隔離しなさい。(F)は、ピンセット7で組織を維持する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウス弁細胞分離の代表的な説明 略語: HEPES = 4-(2-ヒドロキイェチル)-1-ピペラジンタンスルホン酸;RT = 室温;DMEM = ダルベッコの修正されたイーグル媒体;FBS = 牛胎児血清. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウス弁細胞表現型(A)新たに単離された弁細胞の顕微鏡図。免疫蛍光染色(B)ビメンチン陽性細胞および(C)α-SMAを示す。細胞は(D)CD31染色に対して負である。スケールバー= 200 μm。略語: DAPI = 4',6-ジミディノ-2-フェニリンドール;CD31 = 分化 31 のクラスター;α-SMA = α平滑筋アクチン.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:インビトロ石灰化アッセイ(A)リン酸含量の石灰化培地は、試薬キットで測定したインビトロでVIC石灰化を誘発した。(B)カルシウム節点の赤陽性染色(右)を示す顕微鏡画像。(C)アリザリン赤染色は、石灰化培地に応答してVICの正のカルシウム節(黒矢印)を示した。スケールバー= 100 μm。省略形: CTL- = コントロール;mVIC = マウスの弁膜間質細胞この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、一次培養のためのマウス弁細胞分離の詳細なプロトコルを紹介する。8週齢のマウスから3つの大動脈弁をプールし、十分な数の細胞を得た。さらに、このプロトコルは、VIC表現型の特性評価と インビトロ 鉱化アッセイを記述する。 この方法は、マチューら7から先に説明したプロトコルから適応した。
大動脈弁の分離の間、細菌またはマイコプラズマの汚染から細胞を保護するために可能な伝染のすべての源を避けるために注意しなければならない。確かに、実験を開始する前にすべての外科ツールをオートクレーブすることが重要です。HEPES溶液は、細菌感染を最小限に抑えるために1%の抗生物質を補充する必要があります。さらに、マイコプラズマは細胞病理学を引き起こし、結果的に細胞培養10において測定されたすべてのパラメータを妨害する。
培養液の量が少ない小培養皿のめっき細胞は、VICの増殖および増殖にとって重要である。組織を落ち着かせ、細胞培養皿に付着させることで、組織から皿壁への細胞移動が可能になる。若いマウスから単離された細胞がより速く増殖することを考えると、培養5日後に75cm2のより大きな培養皿に細胞を移すことを推奨する。80%合流までの細胞を維持することは、筋線維芽細胞表現型8に対するVICの分化を最小限に抑えるために極めて重要である。
免疫蛍光イメージングにより示されるように、単離された弁細胞は線維芽細胞様表現型を示す。VICは細長い細胞質を有し、以前の研究で説明したようにビメンチンとαSMAの両方を発現する。本研究では、マウスVIC表現型がブタVIC11およびヒトVIC12について以前に説明したものと類似していることを確認した。大動脈狭窄に関するほとんどのインビトロ研究は、大動物8,11の細胞に対して行われる。ブタVICの主な欠点は、通常のメディア13でもインビトロで骨芽細胞表現型への自発的な分化である。しかし、マウスVICは、より高い通路でも自発的に石灰化しません。
マウスVICは、アスコルビン酸、インスリン、リン酸刺激を用いた石灰化培地に応答して骨芽細胞表現型に分化する。本稿では、キットを用いたカルシウム測定の定量的方法と、アリザリン赤染色を用いた定性的な方法について説明する。いずれの方法も、石灰化媒体処理に応答して石灰化の有意な増加を示した。カルシウム測定キットは、正確な定量的カルシウム測定14を提供するゴールドスタンダード法である。
アルセナゾIII試薬では、8-ヒドロキシキノリンスルホン酸の含みによってマグネシウムの干渉が防止されます。カルシウムは試薬と反応して紫色の複合体を形成し、650nmで吸収する。色の強度はカルシウム濃度に比例します。アルセナゾIII試薬の精度は、以前に原子吸光光度測定で検証されました。同じ方法は、生物学的流体14中の総カルシウム濃度を測定するために臨床検査室で使用される。大動脈狭窄における石灰化は主にヒドロキシアパタイトであり、分散X線エネルギー走査電子顕微鏡分析7、12、15を用いて示されている。実際、細胞膜の石灰化を、より正確に大動脈弁組織の石灰化を模倣するためには、遊離カルシウムではなく、細胞膜の石灰化を分析することが重要である。
マウスは大動脈弁石灰化につながる分子機構の研究のためのVICの良い供給源を表す。ただし 、vitroの VICは生きたバルブのVICと似ていない点に注意してください。もう一つの制限は、単一の細胞培養を行うために3〜5匹のマウスからの弁のプールが必要であるという事実である。プールは、変動を最小限に抑えるために、リッターメイトマウスからでなければなりません。さらに、実験はすべての所見を確認するために三重で行われるべきである。しかしながら、培養物における大動脈弁全体の使用は、この制限を緩和することができる。それにもかかわらず、これらの インビトロ 研究は、知見を強化するためにヒト組織で検証されなければならない。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
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