Summary
이 문서에서는 2단계 콜라게나아제 절차에 의한 마우스 대동맥 판막 세포의 분리에 대해 설명합니다. 격리된 마우스 밸브 세포는 체외 석회화 분석과 같은 상이한 분석체를 수행하고 대동맥 판막 광물화로 이어지는 분자 경로를 조사하는 데 중요합니다.
Abstract
대동맥 판막 세포의 석회화는 대동맥 협착증의 특징이며 판막 cusp 섬유증과 관련이 있습니다. 판막 간질 세포(VIC)는 골다브라스트와 같은 세포에 대한 그들의 비차별 프로그램의 활성화를 통해 대동맥 협착증의 석회화 과정에서 중요한 역할을 한다. 마우스 VICs는 대동맥 밸브 셀의 광물화를 구동하는 신호 경로의 용해를 위한 좋은 시험관내 도구입니다. 본 명세서에 기술된 방법은, 이 저자에 의해 성공적으로 이용되고, 새로 고립된 세포를 얻는 방법을 설명합니다. 2 단계 콜라게나아제 절차는 1 mg/mL 및 4.5 mg/mL로 수행되었습니다. 첫 번째 단계는 내피 세포 층을 제거하고 오염을 피하는 것이 중요합니다. 두 번째 콜라게나아제 인큐베이션은 조직에서 플레이트로 의 VICs의 이동을 용이하게 하는 것이다. 또한, 분리된 마우스 밸브 세포의 표현형 특성화를 위한 면역형 염색 절차가 논의된다. 더욱이, 석회화 분석법은 칼슘 시약 측정 절차 및 알리자린 붉은 염색을 사용하여 체외에서 수행되었다. 마우스 밸브 세포 1 차 배양의 사용은 체외에서 세포 광물화를 억제하기 위해 새로운 약리학적 표적을 테스트하는 데 필수적입니다.
Introduction
석회화 대동맥 판막 질환 (CAVD)은 1 세 이상 노인 개인의 거의 2.5 %에 영향을 미치는 서양 인구에서 가장 널리 퍼진 valvular 심장질환입니다. CAVD는 6백만 명 이상의 미국인에게 영향을 미치며 정상적인 혈류를 통해1,2를 손상시키는 전단지의 기계적 특성의 변화와 관련이있습니다. 현재 질병의 진행을 중단하거나 미네랄 회귀를 활성화하는 약리학적 치료법은 없습니다. CAVD를 치료하는 유일한 효과적인 치료법은 수술 또는 경피 대동맥 판막 교체3에의한 대동맥 판막 교체입니다. 따라서 새로운 약리학적 인 표적을 식별하기 위해 밸브 광물화로 이어지는 분자 메커니즘을 조사하는 것이 필수적입니다. 실제로, 비처리 대동맥 협착증은 좌심실 기능 장애 및 심부전 4와 같은 몇몇 불리한 결과를 가지고있습니다.
대동맥 판막은 주성 세포 유형5로VICs를 포함하는 섬유증, 스폰지 오사 및 심실증으로 알려진 3 개의 층으로 구성됩니다. 섬유증 및 심실증은 혈관 내피 세포(VEC)5층으로덮여 있다. VEC는 염증 성 세포의 투과성뿐만 아니라 파라크린 신호를 조절합니다. 증가된 기계적 응력은 VEC의 무결성에 영향을 미치고 대동맥 판막의 항상성을 방해하여 염증성 세포 침입6으로이어질 수 있다. 스캐닝 전자 현미경 분석은 인간 석회화 대동맥 판막7에서중단된 내피엄을 보였다.
석회화 된 조직의 조직학적 분석은 골세포와 골세포의 존재를 드러낸다. 더욱이, VIC의 골성 분화는 체외 및 인간 판막 조직8모두에서 관찰되었다. 이 과정은 주로 Runt 관련 전사 인자 2 (Runx2) 및 뼈 형태 유전학 단백질 (BmPs)8,9에의해 오케스트레이션된다.
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Protocol
참고: 여기에 설명된 모든 동물 절차는 마운트 시나이 기관 핵심 및 사용 위원회에서 Icahn 의과 대학에 의해 승인되었습니다.
1. 성인 마우스에서 밸브 세포 격리 전에 준비
- 도 1A에 표시된 모든 수술 기구를 70% v/v 에탄올을 사용하고 30분 동안 자동 으로 자동화하여 모든 수술 기구를 청소하고 살균합니다.
- 페니실린 연쇄 절제술 500μL을 10mm HEPES의 50mL에 추가합니다. 1x 인산염 완충식식염(PBS)의 50mL 알리쿼트(aliquot)를 준비한다. 얼음 에 솔루션을 유지합니다.
- 1 mg/mL 및 4.5 mg/mL 콜라게나아제 용액을 준비하고, 전체 절차를 수행하기 위해 15mL 튜브에 각 용액의 5mL을 사용합니다. 1 mg/mL 콜라게나아제 5mL를 준비하려면 콜라게나아제 5 mg을 덜벡코의 수정 이글 매체(DMEM, 태아소 세럼(FBS)-무료)와 항생제로 보충한 10m HEPES 2.5mL(1% 페니실린-sttop)와 혼합합니다. 0.22 μm 필터를 통해 솔루션을 필터링하여 오염을 제거합니다.
참고: 효소를 보호하기 위해 얼음 에 용액을 유지합니다. - DMEM 용액을 37°C로 따뜻하게 한 후 아래에 설명된 모든 단계에서 사용하십시오. DMEM을 1% 페니실린-연쇄절제술, 1% 피루바테 나트륨, 200mM L-글루타민 5mL, 마이코플라즈마 제거 시약 1mL(재료표참조), 10% FBS로 보충하여 완벽한 매체를 준비한다.
2. 밸브 셀의 격리
- 실험을 위해106개의 세포를 얻으려면, 5개의 8주 된 마우스(최소 3개)를 사용하십시오. 이소플루란 1mL에 담근 작은 티슈 페이퍼와 함께 유도실에 마우스를 놓지만 조직과의 접촉을 허용하지 않습니다. 동물이 완전히 마취되어 있는지 확인하려면; 발가락 핀치 반사를 확인한 다음 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시하십시오. 아래에 설명된 절차가 말단이기 때문에 자궁 경부 탈구 전에 통증을 완화하기 위해 이소플루란을 사용하십시오.
- 마우스를 해부 플랫폼에 놓고 칸누아로 발을 고정하여 제자리에 고정합니다. 에탄올로 가슴과 복부를 청소; 가위로 복부와 가슴을 엽니다. 작은 수술 가위와 함께, 마우스를 exsanguiex 왼쪽 심실 사이 절단. 심장에서 혈액을 제거하기 위해 감기 1x PBS의 10 mL로 심장을 퍼퓨즈하십시오.
- 도 1B에도시된 바와 같이 심장을 자르고, 상승대에서 3mm를 유지한다. 스테레오 현미경으로 대동맥 밸브를 해부합니다. 심실 의 중간에 수평으로 심장을 잘라(도 1C). 좌심실을 대동맥쪽으로 자르고 대동맥 판막(도1D-F)을조심스럽게 해부한다. 작은 35mm 조직 배양 접시에 함께 밸브를 풀.
- 혈액을 제거하기 위해 항생제 (1 % 페니실린 연쇄 절제술)로 보충된 감기 HEPES (10 mM)의 5mL로 75mm 세포 배양 접시에서 분리 된 밸브를 세척하십시오(그림 2). 콜라게나아제 1 mg/mL 및 4.5 mg/mL의 15mL 튜브를 1.3단계에서 준비한다.
참고: 해부 후 멸균 생물 안전 후드에서 격리된 밸브를 조작하여 오염을 최소화합니다. - 콜라게나제 타입 I(1 mg/mL)에서 30분 동안 37°C에서 연속흔들림(그림 2)으로밸브를 배양한다. 150 ×g에서5분 동안 튜브를 원심분리하고, HEPES(10mMM)의 2mL로 한 번 펠릿을 세척하고, 30초의 소용돌이를 고속으로 세척한다. 이 튜브의 내용을 35mm 배양 접시에 붓고 얇은 핀셋을 사용하여 조직의 조각을 새로운 튜브로 조심스럽게 전달합니다.
참고 : 이 단계에서 VICs는 여전히 조직에서 해리되지 않으며 펠릿에는 조직 조각이 포함되어 있습니다. 내피 세포오염을 피하려면 2.5단계에서 소용돌이를 피한 후 원심분리기를 사용하지 마십시오. - 펠릿을 15mL 튜브에 5mL의 콜라게나아제 타입 I(4.5 mg/mL)를 35분 동안 연속 교반하여 37°C로 배양한다. 세포를 분리하기 위해 1mL 파이펫으로 세포를 다시 중단하고, 원심분리기는 150 × g에서 4°C에서 5분 동안 분리한다.
- 상체를 버리고 완전한 DMEM의 2mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 원심분리기는 150 × g에서 4°C에서 5분 동안. 이 단계를 두 번 반복하여 세포를 청소합니다.
참고: 펠릿에는 여전히 조직 조각이 있습니다. - 완전한 배지의 1mL에서 펠릿을 다시 중단하고, 배양 접시에 부착을 용이하게 하기 위해 최소 량의 배지로 6웰 세포 배양 접시의 한 웰에 세포를 플레이트한다. 37°C 인큐베이터에 5%의 이산화탄소를 가진 세포를 방해받지 않고 둡니다.
- 3 일 후, 현미경의 밑에 세포를 확인하여 조직 파편에 가까운 좋은 성장을 확인하십시오. 일단 1,000개의 세포가 현미경의 밑에 나타나면, 오토클레이브 핀셋으로 조직 파편을 주의 깊게 제거하고 매체를 변경합니다.
참고: 접시가 방해되어서는 안 됩니다. 필요한 수의 세포가 관찰되지 않으면 세포 배양 접시를 인큐베이터에 다시 2일 동안 놓습니다. - 세포가 70% 컨실수(2.5 ×105)일때, 트립시니화한 다음 75mm 조직 배양 접시로 옮기다.
3. 세포 정체성 및 형태 분석
참고: 면역형광 염색은 세포 형태학 및 내피 세포 오염을 연구하기 위하여 이용되었습니다.
- 70% v/v/에탄올로 후드를 청소합니다. 멸균 커버립(22mm x 22mm)을 6웰 플레이트에 놓습니다.
참고: 커버립을 살균하려면 70% 에탄올로 씻어내고 자외선 아래에서 밤새 후드에 보관하십시오. - 6웰 플레이트에서 잘 당 100,000개의 세포를 시드합니다. 24 시간 후, 1 x PBS에서 세포를 두 번 세척하고 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정하십시오. 1x PBS로 다시 두 번 씻어내십시오.
참고: 이 시점에서, 세포는 염색 절차의 시작까지 4°C에서 PBS에 보관될 수 있었습니다. - VIC의 순도를 확인하려면 알파-부드러운 근육 액틴(αSMA), 바이멘틴 및 분화 31(CD31)의 클러스터를 사용하여 VEC로 오염을 감지합니다.
- 일반 혈청 500 μL(이차 항체와 동일한 종), 1x PBS의 9.5mL, 트리톤 X-100의 30 μL을 혼합하여 차단 버퍼의 알리쿼트(aliquot)를 준비한다. 1 h에 대한 차단 버퍼의 2 mL에서 세포를 배양한다.
- 트리톤 X-100의 30 μL, 1x PBS의 10mL, 소 혈청 알부민(BSA)의 0.1 g를 포함하는 항체 희석 버퍼를 준비한다.
- 빈 팁 상자를 가지고, 습한 챔버를 만들기 위해 물로 상자의 절반을 채웁니다. 팁 홀더를 젖은 티슈로 덮은 다음 파라필름 시트로 덮습니다.
- 1차 항체의 1μL을 복용하고 3.5단계에서 제조된 희석 버퍼의 100 μL과 혼합한다. 파라필름에 희석된 항체의 50 μL을 놓습니다. 우물에서 커버립을 가지고 뒤집어 항체 의 방울 의 상단에 배치; 항체로 하룻밤 동안 세포를 배양한다.
- 6웰 플레이트에 1mL의 PBS를 추가합니다. 조심스럽게 파라필름에서 커버슬립을 꺼내 뒤집어 우물에 놓습니다. 5 분 동안 연속 부드러운 동요로 세포를 씻어. PBS를 신선한 PBS로 교체하십시오. 셀을 3번 씻으시면 됩니다.
- 희석된 이차 항체(1/500)(Alexa-488, Alexa-555)를 1h로 세포를 배양한다. 이차 항체의 1 μL을 항체 희석 버퍼의 500 μL에 추가합니다(3.5단계에서 제조). 알루미늄 호일로 접시를 덮습니다. 연속 교반으로 1x PBS의 1mL로 셀을 3 번 씻으시다.
- 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)장착 매체의 50 μL로 커버립을 마운트하고, 세포 및 VEC 오염의 형태를 분석하기 위해 현미경의 밑에 세포를 관찰한다.
4. 체외 석회화 분석
- 후드를 70% 에탄올로 청소하고 DMEM 배지를 37°C로 데우도록 데워주세요.
- 100,000개의 세포/상태를 완전한 DMEM에서 6웰 플레이트로 시드하고, 37°C에서 24시간 배양하였다.
- DMEM에서 NaH2PO4,10-7M 인슐린 및 50 μg/mL 아스코르브산의 2mM을 5% FBS로 혼합하여 석회화 매체를 준비한다. DMEM의 93mL의 경우, FBS 5mL, 항생제 1mL(최종 농도 1%), 피루바테 나트륨 1mL(100mMM), NaH2PO 4 2mg, 인슐린 5.8mg, 아스코르빅산 5mg을 추가한다.
참고: 사용하기 전에 0.22 μm 필터를 사용하여 솔루션을 필터링합니다. - 24시간 후, 상주 배지를 석회화 매체로 교체한다. 37°C에서 7일 동안 세포를 배양한다. 3일 일에신선한 석회화 매체로 교체하고 7 일간의 치료를 완료하기 위해 인큐베이터에 플레이트를 다시 놓습니다.
- 7 일 후, 배지를 제거하고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 세포를 씻으라. 세포는 37°C에서 24시간 동안 0.6N 염산(HCl)의 1mL로 세포를 배양한다. 1.5mL 튜브에서 HCl을 수집하고 회전 증발기에서 증발합니다. HCl의 60 μL에서 모든 튜브의 내용을 다시 일시 중단합니다.
참고: 건조 절차는 용액을 집중하고 각 조건에 대해 동일한 부피를 갖는 것이 중요합니다. - 96웰 플레이트를 사용하여 Arsenazo III 시약을 사용하여 칼슘 농도를 측정할 수 있으며, 즉시 사용할 수 있는 키트로 제공됩니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
- 10 mg/dL 농도의 칼슘 표준 용액을 준비하십시오. 수산화칼슘 10 mg(CA(OH)2)의무게를 측정하고 증류수 100mL에 용해합니다.
- 명확한 96 웰 플레이트에서, 파이프 2 μL의 빈 용액 (HCl, 0.6 N), 표준 용액, 우물 당 샘플 (10 mg/dL), 및 샘플. 트리플리케이트에서 실험을 수행하여 파이펫팅 가변성을 확인합니다. 각 조건에 대해 시약의 200 μL을 추가합니다.
참고: 위의 샘플 15 mg/dL 은 식염수, 재분석, 결과 2배곱으로 1:1을 희석해야 합니다. - 실온에서 15 분 동안 반응을 배양하십시오.
참고: 반응은 60분 동안 안정적입니다. - 650 nm에서 플레이트의 흡광도를 읽고 기록합니다. 다음 수식을 사용하여 샘플의 칼슘 양을 계산합니다.
칼슘(mg/mL) = (표준의 시료/흡수도 흡수) × 표준 농도
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Representative Results
murine 대동맥 판막은 일반적으로 직경이 1mm이기 때문에, 다른 실험 절차를 위해 백만 개의 실행 가능한 세포를 수집하기 위해 적어도 3 개의 밸브를 풀링해야합니다. VIC 격리 프로세스의 다른 단계는 도 1 및 도 2에표시됩니다. 밸브 조직을 수동으로 긁어내는 것이 어렵기 때문에, VEC를 제거하기 위해 소용돌이에 의해 생성된 전단 응력사용이 바람직하다. 실제로, CD31 면역형광 염색 결과는 내피 세포오염(도 3D)의부재를 나타냈다. 또한, 마우스 VICs는 밸브 셀의 주요 마커인 바이멘틴 및 α-SMA를 발현한다(도3B,C).
체외에서 세포 광물화
칼슘 시약 키트는 칼슘 농도를 측정하는 데 사용되었습니다. 석회화 배지로 처리된 세포는 비처리세포(도4A)에비해 칼슘 농도가 높다. 칼슘의 농도는 총 단백질 농도로 정상화되었다. Alizarin 빨간 염색은 적색 양성 칼슘 노드(도 4B)를표시하여 칼슘 시약 키트 측정을 확인했습니다.
도 1: 밸브 해부에 대한 설명.(A)해부에 필요한 모든 수술 기구의 대표 이미지, 가위 2는 가슴을 열기 위해 마우스와 가위 3의 피부를 열어야한다. 핀셋 5와 6피부를 잡고 가슴을 여는 데 필요합니다. (B)대오르타(흑화살)로부터 3mm의 티슈를 남겨둡니다. (C)가위 번호 4와 심실의 중간에 심장을 잘라. (D)가위 3로 대동맥 판막을 향해 하트를 엽니다. 얇은 핀셋 7과 8을 사용하여 대동맥 밸브를 조심스럽게 해부하십시오. 밸브가 보이고 마우스 판막 조직 (파란색 화살표)의 특징인 검은 점이 있습니다. (E)대동맥 판막을 더 잘 시각화하기 위해 배율을 늘립니다. 작은 가위로 밸브를 분리4; (F)핀셋으로 조직을 유지 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스 밸브 셀 절연에 대한 대표적인 설명. 약어: HEPES = 4-(2-하이드록세틸)-1-파이프라진에탄황포닉산; RT = 실온; DMEM = 덜벡코의 수정된 이글 매체; FBS = 태아 소 혈청. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마우스 밸브 셀 표현형. (A)갓 분리된 밸브 셀의 현미경 보기. 면역형광 염색(B)비멘틴 양성 세포 및(C)α-SMA. 세포는(D)CD31 염색에 대해 음수이다. 스케일 바 = 200 μm. 약어: DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; CD31 = 분화 31의 클러스터; α-SMA = 알파-매끄러운 근육 액틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 체외 석회화 분석. (A)인산염이 풍부한 석회화 배지 유도 된 VIC 석회화 시험관내,시약 키트로 측정하였다. (B)칼슘 노드에 대한 적색 양성 염색(오른쪽)을 보여주는 현미경 영상. (C)알리자린 적색 염색은 석회화 매체에 반응하여 VIC의 양성 칼슘 노드(검정화)를 보였다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: CTL- = 제어; mVIC = 마우스 발비성 간질 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서에서는 1차 배양에 대한 마우스 밸브 셀 격리의 상세한 프로토콜을 제시합니다. 8주 된 마우스의 3개의 대동맥 판막은 충분한 수의 세포를 얻기 위하여 풀링되었습니다. 또한, 본 프로토콜은 VIC 표현형및 체외 광물화 분석의 특성화를설명합니다. 이 방법은 이전에 설명된 마티유 등으로부터 이전에 설명된 프로토콜로부터 적용하였다.7.
대동맥 판막이 분리되는 동안 세균이나 마이코플라즈마 오염으로부터 세포를 보호하기 위해 가능한 전염병의 모든 원인을 피하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 실제로 실험을 시작하기 전에 모든 수술 도구를 자동 복제하는 것이 중요합니다. HEPES 용액은 세균 감염을 최소화하기 위해 1 %의 항생제로 보충되어야합니다. 더욱이, 진균플라즈마는 세포병리학을 유발하고 결과적으로 세포배양(10)에서측정된 모든 파라미터를 방해할 수 있다.
배양 배지의 양이 적은 작은 배양 접시에 있는 세포도금은 VIC 성장 및 증식에 중요합니다. 조직이 정착하고 세포 배양 접시에 부착하면 조직에서 접시 벽으로 세포 이동이 허용됩니다. 젊은 쥐에서 분리 된 세포가 더 빨리 증식하는 것을 감안할 때, 배양 5 일 후에 75cm2의 더 큰 배양 접시로 세포를 옮기는 것이 좋습니다. 세포를 80%의 합류로 유지하는 것은 VIC의 분화를 근섬유세포 표현형8으로의분화를 최소화하는 데 매우 중요합니다.
면역 형광 화상 진찰에 의해 도시된 것과 같이, 단단된 판막 세포는 섬유아세포 같이 표현형을 보여줍니다. VICs는 길쭉한 세포질을 가지고 있으며 이전 연구에서 설명한 바와 같이 비멘틴과 αSMA를 모두 표현합니다. 본 작품은 마우스 VIC 표현형이 이전에 기공된VICs(11) 및 인간VIC(12)와유사하다는 것을 확인한다. 대동맥 협착증에 대한 대부분의 시험관내 연구는 큰 동물8,11의세포에서 수행된다. 돼지 VIC의 주요 단점은 정상미디어(13)에서도 시험관 내의 골세포 표현형에 대한 자발적인 분화이다. 그러나 마우스 VIC는 더 높은 구절에서도 자발적으로 석회화하지 않습니다.
마우스 VICs는 아스코르브산, 인슐린 및 인산 자극을 사용하여 석회화 매체에 반응하여 골조 표현형을 분화한다. 이 문서에서는 Alizarin 빨간 얼룩을 사용하여 키트와 질적 방법을 사용하여 칼슘 측정의 정량적 방법을 설명합니다. 두 방법 모두 석회화 매체 치료에 대한 응답으로 석회화의 상당한 증가를 보였다. 칼슘 측정 키트는 정확한 정량적 칼슘 측정14를제공하는 금 표준 방법입니다.
아르세나조 III 시약에서, 마그네슘 간섭은 8-하이드록시키놀린 설포네이트의 포함에 의해 방지된다. 칼슘은 시약과 반응하여 650nm에서 흡수되는 보라색 색 복합체를 형성합니다. 색상의 강도는 칼슘 농도에 비례합니다. Arsenazo-III 시약의 정확도는 이전에 원자 흡수 분광법으로 검증되었습니다. 동일한 방법은 생물학적유체(14)에서총 칼슘 농도를 측정하기 위해 임상 실험실에서 사용된다. 대동맥 협착증의 석회화는 주로 하이드록자파티트이며, 분산형 X선 에너지 스캐닝 전자 현미경 분석7,12,15와같이. 실제로, 대동맥 판막 조직의 석회화를 보다 정확하게 모방하기 위해 자유 칼슘보다는 세포막의 석회화를 분석하는 것이 중요하다.
마우스는 대동맥 판막 석회화로 이어지는 분자 메커니즘의 연구를 위한 VIC의 좋은 근원을 나타냅니다. 그러나, 시험관 내의 VIC는 살아있는 밸브의 VIC와 유사하지 않다는 것을 명심하십시오. 또 다른 제한은 단일 세포 배양을 만들기 위해 3-5 마우스의 밸브 풀이 필요하다는 사실입니다. 수영장은 변화를 최소화하기 위해 쓰레기 메이트 마우스에서해야합니다. 또한 모든 결과를 확인하기 위해 삼중에서 실험을 수행해야 합니다. 그러나 배양에서 전체 대동맥 판막의 사용은 이러한 제한을 완화할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 체 외 연구 결과 강화 하기 위해 인간의 조직에서 검증 해야 합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
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