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Aislamiento De Células De La Válvula Intersticial De Ratón Para Estudiar La Calcificación De La Válvula Aórtica In Vitro

Published: May 10, 2021 doi: 10.3791/62419
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Cardiovascular Research Center, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Diabetes, Obesity and Metabolism Institute, Department of Medicine, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Graduate School of Biomedical Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Este artículo describe el aislamiento de las células de la válvula aórtica del ratón por un procedimiento de dos pasos de la colagenasa. Las células aisladas de la válvula de ratón son importantes para realizar diferentes ensayos, como este ensayo de calcificación in vitro, y para investigar las vías moleculares que conducen a la mineralización de la válvula aórtica.

Abstract

La calcificación de las células de la válvula aórtica es el sello de la estenosis aórtica y se asocia a fibrosis de la cúspide de la válvula. Las células intersticiales valvulares (VIC) juegan un papel importante en el proceso de calcificación en la estenosis aórtica a través de la activación de su programa de desdiferenciación a células osteoblasto-similares. Los VICs de ratón son una buena herramienta in vitro para la elucidación de las vías de señalización que impulsan la mineralización de la célula de la válvula aórtica. El método descrito aquí, utilizado con éxito por estos autores, explica cómo obtener células recién aisladas. Un procedimiento de dos pasos de la colagenasa fue realizado con 1 mg/mL y 4.5 mg/mL. El primer paso es crucial para eliminar la capa de células endoteliales y evitar cualquier contaminación. La segunda incubación de colagenasa es para facilitar la migración de los VIC del tejido a la placa. Además, un procedimiento de coloración de la inmunofluorescencia para la caracterización del fenotipo de las células aisladas de la válvula del ratón se discute. Además, el análisis de la calcificación fue realizado in vitro usando el procedimiento de la medida del reactivo del calcio y la coloración roja del alizarin. El uso del cultivo primario de células de válvulas de ratón es esencial para probar nuevas dianas farmacológicas para inhibir la mineralización celular in vitro.

Introduction

La valvulidad aórtica calcificada (CAVD) es la cardiopatía valvular más prevalente en poblaciones occidentales, afectando a casi el 2,5% de los ancianos mayores de 65 años1. CAVD afecta a sobre seis millones de americanos y se asocia a los cambios en las propiedades mecánicas de los prospectos que empeoran la sangre normal fluir-a través1,2. Actualmente, no existe ningún tratamiento farmacológico para detener la progresión de la enfermedad o para activar la regresión mineral. La única terapia eficaz para tratar la CAVD es el reemplazo de la válvula aórtica por cirugía o el reemplazo de la válvula aórtica transcatéter3. Por lo tanto, es imperativo investigar los mecanismos moleculares que conducen a la mineralización valvular para identificar nuevas dianas farmacológicas. De hecho, la estenosis aórtica no tratada tiene varias consecuencias adversas como la disfunción del ventrículo izquierdo y la insuficiencia cardíaca4.

La válvula aórtica consta de tres capas conocidas como fibrosa, espongiosa y ventricularis, que contienen VICs como la célula predominante tipo5. La fibrosa y la ventricularis están cubiertas por una capa de células endoteliales vasculares (BIC)5. Los VÉS regulan la permeabilidad de las células inflamatorias, así como las señales paracrinas. El aumento del estrés mecánico puede afectar la integridad de los VE Y perturbar la homeostasis de la válvula aórtica, llevando a la invasión inflamatoriacelular 6. Los análisis de microscopía electrónica de barrido mostraron endotelio interrumpido en una válvula aórtica calcificada humana7.

Los análisis histológicos del tejido calcificado revelan la presencia de osteoblastos y de osteoclasts. Además, se observó diferenciación osteogénica de los VICs tanto in vitro como en el tejido valvular humano8. Este proceso está orquestado principalmente por el factor de transcripción 2 relacionado con Runt (Runx2) y las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs)8,9.

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Protocol

NOTA: Todos los procedimientos animales descritos aquí han sido aprobados por la Escuela de Medicina Icahn en el núcleo institucional y el comité de uso de Mount Sinai.

1. Preparación antes del aislamiento de células valvulares de ratones adultos

  1. Limpiar y esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos mostrados en la Figura 1A utilizando etanol al 70% v/v y posteriormente autoclavándolos durante 30 min.
  2. Añadir 500 μL de penicilina-estreptomicina a 50 mL de HEPES de 10 mm. Preparar una alícuota de 50 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mantenga las soluciones en el hielo.
  3. Prepare soluciones de colagenasa de 1 mg/mL y 4,5 mg/mL, y use 5 mL de cada solución en tubos de 15 mL para realizar todo el procedimiento. Para preparar 5 mL de 1 mg/mL de colagenasa, mezcle 5 mg de colagenasa con 2,5 mL de Medio Águila Modificado de Dulbecco (DMEM, suero fetal bovino (FBS)-libre) y 2,5 mL de 10 mM HEPES suplementado con antibióticos (1% penicilina-estreptomicina de la etapa 1.2). Filtre las soluciones a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar cualquier contaminación.
    NOTA: Mantenga las soluciones en hielo para proteger las enzimas.
  4. Caliente la solución DMEM a 37 °C antes de su uso en todos los pasos descritos a continuación. Prepare el medio completo complementando DMEM con 1% penicilina-estreptomicina, 1% piruvato de sodio, 5 mL de L-glutamina de 200 mM, 1 mL de reactivo de eliminación de micoplasma (ver la Tabla de Materiales),y 10% FBS.

2. Aislamiento de las células valvulares

  1. Para obtener 106 células para el experimento, utilice cinco ratones de 8 semanas de edad (mínimo de tres). Coloque el ratón en una cámara de inducción junto con un pequeño trozo de papel tisú empapado con 1 mL de isoflurano, pero no permita el contacto con el tejido. Confirmar que el animal está completamente anestesiado; compruebe si hay reflejo de pellizco en el dedo deldo deldo del ratón, y luego eutanasiar el ratón por dislocación cervical. Utilice isoflurano para aliviar cualquier dolor antes de la dislocación cervical, ya que el procedimiento descrito a continuación es terminal.
  2. Coloque el ratón en una plataforma de disección y fije las patas con cánulas para mantenerlo en su lugar. Limpie el pecho y el abdomen con etanol; abra el abdomen y el pecho con unas tijeras. Con pequeñas tijeras quirúrgicas, corte entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo para exsanguinar el ratón. Perfunda el corazón con 10 mL de PBS frío 1x para eliminar la sangre del corazón.
  3. Cortar el corazón, y mantener 3 mm de la aorta ascendente como se muestra en la Figura 1B. Diseccione la válvula aórtica bajo un estereomicroscopio. Cortar el corazón horizontalmente en el centro de los ventrículos (Figura 1C). Cortar el ventrículo izquierdo hacia la aorta, y diseccionar cuidadosamente la válvula aórtica (Figura 1D-F). Acomente las válvulas en un pequeño plato de cultivo de tejidos de 35 mm.
  4. Lavar las válvulas aisladas en un plato de cultivo celular de 75 mm con 5 mL de HEPES frío (10 mM) suplementado con antibióticos (1% penicilina-estreptomicina) para eliminar la sangre(Figura 2). Prepare dos tubos de 15 mL de colagenasa 1 mg/mL y 4,5 mg/mL como se describió anteriormente en el paso 1.3.
    NOTA: Después de la disección, manipule las válvulas aisladas en una campana de bioseguridad estéril para minimizar la contaminación.
  5. Incubar las válvulas en colagenasa tipo I (1 mg/mL) durante 30 min a 37 °C con agitación continua (Figura 2). Centrifugar el tubo durante 5 min a 150 × g,lavar el pellet una vez con 2 mL de HEPES (10 mM), y vórtice durante 30 s a alta velocidad. Vierta el contenido de este tubo en un plato de cultivo de 35 mm y transfiera cuidadosamente los fragmentos de tejido utilizando pinzas delgadas a un nuevo tubo.
    NOTA: En esta etapa, los VICs todavía no están disociados del tejido, y el pellet contiene pedazos de tejido. Para evitar la contaminación con células endoteliales, no centrífuga después del vórtice en el paso 2.5.
  6. Incubar el pellet en un tubo de 15 mL con 5 mL de colagenasa tipo I (4,5 mg/mL) a 37 °C bajo agitación continua durante 35 min. Vuelva a suspender las células con una pipeta de 1 mL para separar las células y centrífuga a 150 × g durante 5 min a 4 °C.
  7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 mL de DMEM completo. Centrífuga a 150 × g durante 5 min a 4 °C. Repita este paso dos veces para limpiar las celdas.
    NOTA: El pellet todavía tendrá algunos fragmentos de tejido.
  8. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio completo, y platee las células en un pozo de un plato de cultivo celular de 6 pozos en una cantidad mínima de medio para facilitar su fijación al plato de cultivo. Deje las células, sin ser molestadas, en una incubadora de 37 °C con un 5% de dióxido de carbono.
  9. Después de 3 días, revise las células bajo el microscopio para verificar un buen crecimiento cerca de los restos de tejido. Una vez que 1,000 células sean visibles bajo el microscopio, retire cuidadosamente los desechos de tejido con pinzas en autoclave y cambie el medio.
    NOTA: La placa no debe ser perturbada; si no se observa el número requerido de células, coloque el plato de cultivo celular de nuevo en la incubadora durante otros 2 días.
  10. Cuando las células son 70% confluentes (2,5 × 105), tripsinizar y luego transferirlos a un plato de cultivo de tejidos de 75 mm.

3. Análisis de la identidad celular y morfología

NOTA: La coloración de la inmunofluorescencia fue utilizada para estudiar morfología de la célula y la contaminación endotelial de la célula.

  1. Limpie la campana con etanol al 70% v/v/. Coloque las tapas estériles (22 mm x 22 mm) en placas de 6 pozos.
    NOTA: Para esterilizar las cubiertas, lávelas con etanol al 70% y manténgalas en el capó durante la noche bajo luz ultravioleta.
  2. Semilla de 100.000 células por pozo en una placa de 6 pozos. Después de 24 h, lave las células dos veces en 1x PBS, y fijarlas en paraformadehído al 4% (PFA) durante 20 min. Lave las células de nuevo dos veces con 1x PBS.
    NOTA: En este punto, las células podrían mantenerse en PBS a 4 °C hasta el inicio del procedimiento de tinción.
  3. Para verificar la pureza de los VICs, utilice actina alfa-músculo liso (αSMA), vimentina y racimo de diferenciación 31 (CD31) para detectar la contaminación con VÉS.
  4. Preparar una alícuota de tampón de bloqueo mezclando 500 μL de suero normal (la misma especie que el anticuerpo secundario), 9,5 mL de 1x PBS y 30 μL de Triton X-100. Incubar las células en 2 mL del tampón bloqueador durante 1 h.
  5. Preparar el tampón de dilución de anticuerpos que contenga 30 μL de Tritón X-100, 10 mL de 1x PBS y 0,1 g de albúmina sérica bovina (BSA).
  6. Tome una caja de puntas vacía, llene la mitad de la caja con agua para crear una cámara húmeda. Cubra el soporte de la punta con un pañuelo húmedo y luego con una hoja de parafilm.
  7. Tomar 1 μL del anticuerpo primario y mezclarlo con 100 μL del tampón de dilución preparado en el paso 3.5. Coloque 50 μL del anticuerpo diluido en la parapelícula. Tome las cubiertas de los pozos, voltéelos y colótelos en la parte superior de las gotas de anticuerpos; incubar las células durante la noche con el anticuerpo.
  8. Agregue 1 mL de PBS en la placa de 6 pozos. Saque cuidadosamente el cubrebocas del parafilm, voltéalo y colóquelo en el pozo. Lave las células con una agitación suave continua durante 5 min. Sustitúyase el SBP por un SBP fresco; lave las células 3 veces.
  9. Incubar las células con el anticuerpo secundario diluido (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) durante 1 h. Añadir 1 μL del anticuerpo secundario a 500 μL del tampón de dilución del anticuerpo (preparado en el paso 3.5). Cubra la placa con papel de aluminio. Lavar las células 3 veces con 1 mL de 1x PBS con agitación continua.
  10. Monte las cubiertas con 50 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)-medio de montaje, y observe las células bajo el microscopio para analizar la morfología de las células y la contaminación por VEC.

4. Ensayo de calcificación in vitro

  1. Limpie la campana con etanol al 70%, caliente el medio DMEM a 37 °C.
  2. Semilla 100.000 células/condición en placas de 6 pozos en DMEM completo, y cultivo durante 24 h a 37 °C.
  3. Preparar el medio calcificante mezclando 2 mM de NaH2PO4,10-7 M de insulina y 50 μg/mL de ácido ascórbico en DMEM con FBS al 5%. Para 93 mL de DMEM, añadir 5 mL de FBS, 1 mL de antibióticos (concentración final 1%), 1 mL de piruvato de sodio (100 mM), 27,5 mg de NaH2PO4, 5,8 μL de insulina y 5 mg de ácido ascórbico.
    NOTA: Filtre la solución con un filtro de 0,22 μm antes de su uso.
  4. Después de 24 h, substituya el medio sobrenadante por el medio calcificante. Incubar las células durante 7 días a 37 °C. En el3er día, reemplazar con medio calcificante fresco, y colocar la placa de nuevo en la incubadora para completar los 7 días de tratamiento.
  5. Después de 7 días, retire el medio y lave las células dos veces con 2 mL de 1x PBS. Incubar las células en 1 mL de ácido clorhídrico (HCl) de 0,6 N durante 24 h a 37 °C. Recoger el HCl en un tubo de 1,5 mL, y evaporarlo en un evaporador rotatorio. Vuelva a suspender el contenido de todos los tubos en 60 μL de HCl.
    NOTA: El procedimiento de secado es importante para concentrar la solución y tener el mismo volumen para cada condición.
  6. Use una placa de 96 pozos para medir la concentración de calcio mediante el uso del reactivo Arsenazo III, disponible en un kit listo para usar (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
  7. Prepare una solución estándar de calcio de 10 mg/dL de concentración. Pesar 10 mg de hidróxido de calcio (Ca(OH)2)y disolver en 100 mL de agua destilada.
  8. En una placa transparente de 96 pozos, pipeta 2 μL de solución en blanco (HCl, 0,6 N), la solución estándar, la muestra por pozo (10 mg/dL) y las muestras. Realice el experimento por triplicado para verificar la variabilidad del pipeteo. Agregue 200 μL del reactivo para cada afección.
    NOTA: Las muestras por encima de 15 mg/dL deben diluirse 1:1 con solución salina, volver a ensayarse y el resultado debe multiplicarse por dos.
  9. Incubar la reacción durante 15 min a temperatura ambiente.
    NOTA: La reacción es estable durante 60 min.
  10. Lea y registre la absorbancia de la placa a 650 nm. Utilice la siguiente fórmula para calcular la cantidad de calcio en las muestras:
    Calcio (mg/mL) = (Absorbancia de la muestra/absorbancia de la norma) × Concentración de la norma

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Representative Results

Como las válvulas aórticas murinas tienen típicamente 1 mm de diámetro, se deben agrupar al menos tres válvulas para recolectar un millón de células viables para diferentes procedimientos experimentales. Los diferentes pasos del proceso de aislamiento de VIC se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. Como es difícil raspar manualmente el tejido de la válvula, es preferible utilizar la tensión de cizallamiento creada por el vórtice para eliminar los VÉS. De hecho, los resultados de tinción por inmunofluorescencia CD31 mostraron la ausencia de contaminación de células endoteliales(Figura 3D). Además, los VICs de ratón expresan vimentina y α-SMA, que son los principales marcadores de las células valvulares(Figura 3B,C).

Mineralización celular in vitro
Un kit del reactivo del calcio fue utilizado para medir la concentración del calcio; las células tratadas con medio calcificante tienen mayor concentración de calcio en comparación con las células no tratadas(Figura 4A). La concentración de calcio se normalizó con la concentración total de proteínas. La tinción roja de alizarina confirmó las mediciones del kit de reactivos de calcio al mostrar nodos de calcio rojos positivos (Figura 4B).

Figure 1
Figura 1:Descripción de la disección valvular. (A)Imagen representativa de todos los instrumentos quirúrgicos necesarios para la disección, se necesitan tijeras 2 para abrir la piel del ratón y tijeras 3 para abrir el tórax. Las pinzas 5 y 6 son necesarias para sostener la piel y abrir el pecho. (B)Dejar 3 mm de tejido de la aorta (flecha negra). (C)Cortar el corazón en medio de los ventrículos con tijeras número 4. (D) Abra el corazón hacia la válvula aórtica con tijeras 3. Use las pinzas delgadas 7 y 8 para diseccionar cuidadosamente la válvula aórtica. La válvula es visible y tiene algunos puntos negros que son característicos del tejido de la válvula de los ratones (flecha azul). (E)Aumentar la ampliación para visualizar mejor la válvula aórtica. Aislar la válvula con las pequeñas tijeras 4; (F)mantener el tejido con pinzas 7. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2:Descripción representativa del aislamiento de la célula de la válvula del ratón. Abreviaturas: HEPES = ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatanosulfónico; RT = temperatura ambiente; DMEM = Medio águila modificado de Dulbecco; FBS = suero fetal bovino. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3:Fenotipo de la célula de la válvula del ratón. Vista microscópica de(A)células valvulares recién aisladas. Inmunofluorescencia que muestra(B)células vimentina-positivas y(C)α-SMA. Las células son negativas para(D)tinción CD31. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; CD31 = racimo de la diferenciación 31; α-SMA = actina alfa-lisa del músculo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4:Ensayo de calcificación in vitro. (A)Medio calcificante rico en fosfato inducido por CIV in vitro,que se midió con un kit de reactivos. (B)Imagen microscópica que muestra una tinción roja positiva (derecha) para los ganglios de calcio. (C)La coloración roja de Alizarin mostró nodos positivos del calcio (flecha negra) de VICs en respuesta al medio de calcificación. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: CTL- = Control; mVICs = células intersticiales valvulares del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Discussion

Este artículo presenta un protocolo detallado del aislamiento de la célula de la válvula del ratón para la cultura primaria. Tres válvulas aórticas de ratones de 8 semanas de edad se agruparon para obtener un número adecuado de células. Además, este protocolo describe la caracterización del fenotipo VIC y el ensayo de mineralización in vitro. El método fue adaptado del protocolo previamente descrito de Mathieu et al.7.

Durante el aislamiento de las válvulas aórticas, se debe tener cuidado de evitar todas las fuentes de posible contagio para proteger las células de la contaminación bacteriana o de micoplasma. De hecho, es crucial autoclave todas las herramientas quirúrgicas antes de comenzar los experimentos. La solución de HEPES debe complementarse con antibióticos al 1% para minimizar la infección bacteriana. Además, el micoplasma puede causar citopatología y, en consecuencia, interferir con todos los parámetros medidos en el cultivo celular10.

El enchapado de células en platos de cultivo pequeños con menor volumen de medio de cultivo es fundamental para el crecimiento y la proliferación del CIV. Dejar que el tejido se asiente y se adhiera al plato de cultivo celular permite la migración celular desde el tejido a la pared del plato. Dado que las células aisladas de ratones jóvenes proliferan más rápido, se recomienda transferir las células a un plato de cultivo más grande de 75 cm2 después de 5 días de cultivo. Mantener las células al 80% de confluencia es crucial para minimizar la diferenciación de los VICs a un fenotipo de miofibroblasto8.

Como se muestra en la imagen por inmunofluorescencia, las células aisladas de la válvula muestran a fibroblasto-como fenotipo. Los VICs tienen un citoplasma alargado y expresan tanto vimentina como αSMA como se describió en estudios anteriores. El presente trabajo confirmó que el fenotipo vic ratón es similar al descrito previamente para vicsporcinos 11 y vics humanos12. La mayoría de los estudios in vitro sobre estenosis aórtica se realizan en células de animales grandes8,11. La desventaja clave de los VICs porcinos es su diferenciación espontánea a un fenotipo de osteoblastos in vitro incluso en medios normales13. Sin embargo, los VICs del ratón no calcifican espontáneamente incluso en los pasos más altos.

Los VICs del ratón diferencian al fenotipo del osteoblast en respuesta al medio de calcificación usando el ácido ascórbico, la insulina, y el estímulo del fosfato. Este artículo describe un método cuantitativo de medida del calcio usando un kit y un método cualitativo usando la coloración roja de Alizarin. Ambos métodos demostraron el aumento significativo de la calcificación en respuesta al tratamiento medio de calcificación. El kit de medición de calcio es el método estándar de oro, que ofrece una medición cuantitativa exacta del calcio14.

En el reactivo Arsenazo III, la interferencia de magnesio se previene mediante la inclusión de sulfonato de 8-hidroxiquinolina. El calcio reacciona con el reactivo para formar un complejo de color púrpura, que se absorbe a 650 nm. La intensidad del color es proporcional a la concentración de calcio. La precisión del reactivo Arsenazo-III fue previamente validada con espectrofotometría de absorción atómica. El mismo método se utiliza en los laboratorios clínicos para medir la concentración total de calcio en fluidos biológicos14. La calcificación en la estenosis aórtica es principalmente hidroxiapatita, como se muestra con el análisis de microscopía electrónica de barrido de energía de rayos X dispersiva7,12,15. De hecho, es importante analizar la calcificación de la membrana celular en lugar de calcio libre para imitar con mayor precisión la calcificación del tejido de la válvula aórtica.

Los ratones representan una buena fuente de VICs para el estudio de los mecanismos moleculares que conducen a la calcificación de la válvula aórtica. Sin embargo, tenga en cuenta que los VICs in vitro no son similares a los VICs en válvulas vivas. Otra limitación es el hecho de que se necesita un grupo de válvulas de 3-5 ratones para hacer un solo cultivo celular. La piscina debe ser de ratones camada para minimizar las variaciones. Además, los experimentos deben realizarse por triplicado para confirmar todos los hallazgos. Sin embargo, el uso de toda la válvula aórtica en el cultivo puede aliviar esta limitación. Sin embargo, estos estudios in vitro deben ser validados en tejido humano para fortalecer los hallazgos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm cutting edge scissors F.S.T 15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate Cell Signaling 4412
Arsenazo-III reagent set POINT SCIENTIFIC C7529-500 a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors F.S.T 14184-09
Calcium hydroxide SIGMA -Aldrich 31219 31219
CD31 Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg) Thermofisher Scientific 17018029
DMEM Tthermofisher 11965092
Extra fine graefe forceps F.S.T 11150-10
FBS Gibco 16000044
Fine forceps F.S.T Dumont
HCl SIGMA-ALDRICH H1758
HEPES 1 M solution STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x Thermofisher Scientific A2916801
Mycozap Lanza VZA-2011 Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x Thermofisher Scientific 10378016
Sodium Pyruvate 100 mM Thermofisher Scientific 11360070
Standard pattern forceps  F.S.T 11000-12
Surgical Scissors - Sharp-Blunt F.S.T 14008-14
Trypsin 0.05% Thermofisher Scientific 25300054
Vimentin abcam

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Biología Número 171
Aislamiento De Células De La Válvula Intersticial De Ratón Para Estudiar La Calcificación De La Válvula Aórtica <em>In Vitro</em>
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Bouchareb, R., Lebeche, D. Isolation … More

Bouchareb, R., Lebeche, D. Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro. J. Vis. Exp. (171), e62419, doi:10.3791/62419 (2021).

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