Summary
توضح هذه المقالة عزل خلايا الصمام الأبهري للفأرة بواسطة إجراء كولاجيناز من خطوتين. خلايا صمام الماوس المعزولة مهمة لإجراء فحوصات مختلفة، مثل هذا المقايسة تكلس المختبر، والتحقيق في المسارات الجزيئية المؤدية إلى تمعدن الصمام الأبهري.
Abstract
تكلس خلايا الصمام الأبهري هو السمة المميزة للتضيق الأبهري ويرتبط مع تليف أعتاب الصمام. تلعب الخلايا الخلالية للصمامات (VICs) دورا مهما في عملية تكلس تضيق الأبهر من خلال تفعيل برنامجها للتمايز إلى خلايا تشبه الأرومة العظمية. MOUSE VICs هي أداة جيدة في المختبر لتوضيح مسارات الإشارات التي تقود تمعدن خلية الصمام الأبهري. الطريقة الموصوفة هنا، التي استخدمها هؤلاء المؤلفون بنجاح، تشرح كيفية الحصول على خلايا معزولة حديثا. تم إجراء عملية كولاجيناز من خطوتين مع 1 ملغم/مل و4.5 ملغم/مل. الخطوة الأولى حاسمة لإزالة طبقة الخلية البطانية وتجنب أي تلوث. حضانة الكولاجين الثانية هي تسهيل هجرة VICs من الأنسجة إلى اللوحة. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة إجراء تلطيخ immunofluorescence لتوصيف النمط الظاهري لخلايا صمام الماوس المعزولة. وعلاوة على ذلك، تم إجراء فحص تكلس في المختبر باستخدام إجراء قياس كاشف الكالسيوم وتلطيخ أحمر alizarin. استخدام الخلايا صمام الماوس الثقافة الأولية أمر ضروري لاختبار أهداف الدوائية الجديدة لمنع تمعدن الخلايا في المختبر.
Introduction
مرض الصمام الأبهري المتكلس (CAVD) هو مرض القلب الصمامي الأكثر انتشارا في السكان الغربيين ، ويؤثر على ما يقرب من 2.5٪ من الأفراد المسنين الذين تزيد أعمارهم عن 65 عاما. CAVD يؤثر على أكثر من ستة ملايين أميركي ويرتبط مع التغيرات في الخصائص الميكانيكية للمنشورات التي تضعف تدفق الدم العادي من خلال1،2. حاليا، لا يوجد علاج دوائي لوقف تطور المرض أو لتنشيط الانحدار المعدني. العلاج الفعال الوحيد لعلاج CAVD هو استبدال الصمام الأبهري عن طريق الجراحة أو استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة3. ولذلك فمن الضروري التحقيق في الآليات الجزيئية المؤدية إلى تمعدن الصمام لتحديد أهداف دوائية جديدة. في الواقع، تضيق الأبهر غير المعالجة له عدة عواقب سلبية مثل ضعف البطين الأيسر وفشل القلب4.
يتكون الصمام الأبهري من ثلاث طبقات تعرف باسم فيروسا وسبونغيوسا والبطين ، والتي تحتوي على VICs كنوع الخلية السائد5. وتغطي فيبرسا البطين بطبقة من الخلايا البطانية الوعائية (VECs)5. تنظم VECs نفاذية الخلايا الالتهابية وكذلك إشارات الباراكورين. زيادة الإجهاد الميكانيكي قد تؤثر على سلامة VECs وتعكر صفو التوازن من الصمام الأبهري، مما يؤدي إلى غزو الخلايا الالتهابية6. أظهرت تحليلات المجهر الإلكتروني المسح الضوئي تعطل بطانة الرحم في صمام الأبهر المتكلس الإنسان7.
تكشف التحليلات النسيجية للأنسجة المتكلسة عن وجود أوبلاستات والعظام. وعلاوة على ذلك، لوحظ التمايز العظمي للمركبات VICs في المختبر وفي أنسجة الصمام البشري8. يتم تنظيم هذه العملية بشكل رئيسي من قبل عامل النسخ المرتبط رونت 2 (Runx2) والبروتينات مورفوجينية العظام (BMPs)8،9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا من قبل كلية إيكان للطب في لجنة النواة المؤسسية والاستخدام في جبل سيناء.
1. إعداد قبل عزل خلية صمام من الفئران الكبار
- تنظيف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية المبينة في الشكل 1A باستخدام 70٪ v/v الإيثانول ثم الاستئصال التلقائي لهم لمدة 30 دقيقة.
- أضف 500 ميكرولتر من البنسلين-ستربتومايسين إلى 50 مل من 10 مم HEPES. إعداد أكوت من 50 مل من المالحة 1x الفوسفات المخزنة (PBS). الحفاظ على الحلول على الجليد.
- إعداد 1 ملغم / مل و 4.5 ملغ / مل حلول الكولاجين ، واستخدام 5 مل من كل حل في أنابيب 15 مل لتنفيذ الإجراء بأكمله. لإعداد 5 مل من 1 ملغم/مل كولاجيناز، اخلط 5 ملغ من الكولاجيناز مع 2.5 مل من متوسط النسر المعدل في دولبيكو (DMEM، مصل البقر الجنيني (FBS) الخالي) و2.5 مل من 10 مللي متر HEPES تكملها المضادات الحيوية (1٪ البنسلين-ستربتوميسين من الخطوة 1.2). تصفية الحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة أي تلوث.
ملاحظة: احتفظ بالحلول على الثلج لحماية الإنزيمات. - قم بتدفئة محلول DMEM إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامه في جميع الخطوات الموضحة أدناه. إعداد المتوسطة كاملة عن طريق استكمال DMEM مع 1٪ البنسلين-streptomycin، 1٪ بيروفات الصوديوم، 5 مل من 200 MM L-الجلوتامين، 1 مل من الميكوبلازما القضاء على الكاشف (انظر جدول المواد)،و 10٪ FBS.
2. عزل خلايا الصمام
- للحصول على 106 خلايا للتجربة، استخدم خمسة فئران عمرها 8 أسابيع (بحد أدنى ثلاثة). ضع الماوس في غرفة التعريفي جنبا إلى جنب مع قطعة صغيرة من ورق الأنسجة غارقة مع 1 مل من isoflurane، ولكن لا تسمح الاتصال مع الأنسجة. للتأكد من تخدير الحيوان بالكامل؛ التحقق من وجود إصبع القدم قرصة منعكس، ومن ثم القتل الرحيم الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. استخدام isoflurane لتخفيف أي ألم قبل خلع عنق الرحم كما هو الإجراء المبين أدناه هو المحطة الطرفية.
- ضع الماوس على منصة تشريح ، وإصلاح الكفوف مع cannulas لعقد في مكانه. تنظيف الصدر والبطن مع الإيثانول. فتح البطن والصدر مع مقص. مع مقص جراحي صغير ، قطع بين الأذين الأيسر والبطين الأيسر لإكسانجوينات الماوس. Perfuse القلب مع 10 مل من البرد 1x برنامج تلفزيوني لإزالة الدم من القلب.
- قطع القلب، والحفاظ على 3 ملم من الشريان الأورطي التصاعدي كما هو مبين في الشكل 1B. تشريح الصمام الأبهري تحت منظار مجسم. قطع القلب أفقيا في منتصف البطينين (الشكل 1C). قطع البطين الأيسر نحو الشريان الأورطي، وتشريح بعناية الصمام الأبهري(الشكل 1D-F). تجمع الصمامات معا في طبق صغير زراعة الأنسجة 35 ملم.
- غسل الصمامات المعزولة في طبق 75 ملم ثقافة الخلية مع 5 مل من HEPES الباردة (10 mM) تكملها المضادات الحيوية (1٪ البنسلين-streptomycin) لإزالة الدم (الشكل 2). إعداد اثنين من أنابيب 15 مل من كولاجيناز 1 ملغم / مل و 4.5 ملغ / مل كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.3.
ملاحظة: بعد التشريح، قم بمعالجة الصمامات المعزولة في غطاء أمان بيولوجي معقم لتقليل التلوث. - احتضان الصمامات في كولاجيناز النوع الأول (1 ملغم / مل) لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر(الشكل 2). الطرد المركزي أنبوب لمدة 5 دقائق في 150 × غرام، وغسل بيليه مرة واحدة مع 2 مل من HEPES (10 MM) ، ودوامة لمدة 30 ثانية بسرعة عالية. صب محتويات هذا الأنبوب في طبق ثقافة 35 ملم، ونقل بعناية شظايا الأنسجة باستخدام ملاقط رقيقة في أنبوب جديد.
ملاحظة: في هذه المرحلة، لا تزال المركبات ذات ال VICs غير مرتبطة بالأنسجة، وتحتوي الكريات على قطع من الأنسجة. لتجنب التلوث بالخلايا البطانية، لا تقم بالطرد المركزي بعد الدوامة في الخطوة 2.5. - احتضان بيليه في أنبوب 15 مل مع 5 مل من نوع كولاجيناز الأول (4.5 ملغ / مل) في 37 درجة مئوية تحت التحريض المستمر لمدة 35 دقيقة. إعادة تعليق الخلايا مع ماصة 1 مل لفصل الخلايا، والطرد المركزي في 150 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- تجاهل supernatant، وإعادة تعليق بيليه في 2 مل من DMEM كاملة. جهاز طرد مركزي عند 150 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين لتنظيف الخلايا.
ملاحظة: سوف بيليه لا تزال لديها بعض شظايا الأنسجة. - إعادة تعليق بيليه في 1 مل من المتوسطة كاملة، ولوحة الخلايا في بئر واحد من طبق ثقافة الخلايا 6-جيدا في الحد الأدنى من المتوسطة لتسهيل تعلقها طبق الثقافة. ترك الخلايا، دون عائق، في حاضنة 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون 5٪.
- بعد 3 أيام، تحقق من الخلايا تحت المجهر للتحقق من النمو الجيد بالقرب من حطام الأنسجة. مرة واحدة 1000 الخلايا مرئية تحت المجهر، وإزالة بعناية حطام الأنسجة مع ملاقط autoclaved، وتغيير المتوسطة.
ملاحظة: يجب عدم إزعاج اللوحة؛ إذا لم يتم ملاحظة العدد المطلوب من الخلايا، ضع طبق زراعة الخلية مرة أخرى في الحاضنة لمدة يومين آخرين. - عندما تكون الخلايا التقاء 70٪ (2.5 × 105)،جرب ثم نقلها إلى طبق زراعة الأنسجة 75 ملم.
3. تحليل هوية الخلية ومورفولوجيا
ملاحظة: تم استخدام تلطيخ Immunofluorescence لدراسة مورفولوجيا الخلايا وتلوث الخلايا البطانية.
- تنظيف غطاء محرك السيارة مع 70٪ v/v/ الإيثانول. ضع أغطية معقمة (22 مم × 22 مم) في لوحات من 6 آبار.
ملاحظة: لتعقيم الأغطية، اغسلها بالإيثانول بنسبة 70٪، وابقها في غطاء محرك السيارة بين عشية وضحاها تحت الأشعة فوق البنفسجية. - البذور 100،000 الخلايا لكل بئر في لوحة 6 جيدا. بعد 24 ساعة، وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني 1x، وإصلاحها في 4٪ paraformaldehyde (PFA) لمدة 20 دقيقة. غسل الخلايا مرة أخرى مرتين مع برنامج تلفزيوني 1x.
ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن الاحتفاظ الخلايا في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية حتى بداية إجراء تلطيخ. - للتحقق من نقاء VICs، استخدم أكتين العضلات الفا الملساء (αSMA)، فيمينتين، ومجموعة من التمايز 31 (CD31) للكشف عن التلوث مع VECs.
- إعداد aliquot من العازلة حجب عن طريق خلط 500 ميكرولتر من المصل العادي (نفس النوع من الأجسام المضادة الثانوية)، 9.5 مل من 1x PBS، و 30 ميكرولتر من تريتون X-100. احتضان الخلايا في 2 مل من العازلة حجب لمدة 1 ساعة.
- إعداد العازلة تخفيف الأجسام المضادة التي تحتوي على 30 ميكرولتر من تريتون X-100، 10 مل من برنامج تلفزيوني 1x، و 0.1 غرام من الألبومين مصل البقري (BSA).
- خذ صندوق نصائح فارغ، واملأ نصف الصندوق بالماء لإنشاء غرفة رطبة. قم بتغطية حامل الطرف بمنديل مبلل ثم بورقة من البارافيلم.
- خذ 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية، واخلطها مع 100 ميكرولتر من العازلة المخففة المعدة في الخطوة 3.5. ضع 50 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف على البارافيلم. تأخذ coverlips من الآبار ، والوجه لهم أكثر ، ووضعها على رأس قطرات من الأجسام المضادة ؛ احتضان الخلايا بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة.
- إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني في لوحة 6-جيدا. أخرج قطعة الأغطية بعناية من البارافيلم، وقلبها، ووضعها في البئر. غسل الخلايا مع التحريض لطيف مستمر لمدة 5 دقائق. استبدال برنامج تلفزيوني مع برنامج تلفزيوني جديد; غسل الخلايا 3 مرات.
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة (1/500) (اليكسا-488، اليكسا-555) لمدة 1 ساعة. إضافة 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية إلى 500 ميكرولتر من العازلة تخفيف الأجسام المضادة (أعدت في الخطوة 3.5). تغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم. غسل الخلايا 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x مع التحريض المستمر.
- جبل coverlips مع 50 ميكرولتر من 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) تصاعد المتوسطة, ومراقبة الخلايا تحت المجهر لتحليل مورفولوجيا الخلايا والتلوث VEC.
4. في المختبر التكلس المقايسة
- تنظيف غطاء محرك السيارة مع الإيثانول 70٪، دافئة المتوسطة DMEM إلى 37 درجة مئوية.
- البذور 100،000 الخلايا / شرط في لوحات 6 آبار في DMEM كاملة، والثقافة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية.
- إعداد المتوسطة تكلس عن طريق خلط 2 mM من NaH2PO4، 10-7 M الأنسولين ، و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك في DMEM مع 5 ٪ FBS. ل 93 مل من DMEM، إضافة 5 مل من FBS، 1 مل من المضادات الحيوية (التركيز النهائي 1٪)، 1 مل من بيروفاتي الصوديوم (100 مللي متر)، 27.5 ملغ من NaH2PO4، 5.8 ميكرولتر من الأنسولين، و 5 ملغ من حمض الأسكوربيك.
ملاحظة: تصفية الحل باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام. - بعد 24 ساعة، استبدل الوسط الفائق بالوسط المتكلس. احتضان الخلايا لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية. في يومالثالثة، استبدلها بوسط تكلس طازج، وضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة لإكمال 7 أيام من العلاج.
- بعد 7 أيام، قم بإزالة الوسط، واغسل الخلايا مرتين مع 2 مل من 1x PBS. احتضان الخلايا في 1 مل من 0.6 N حمض الهيدروكلوريك (HCl) لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية. جمع HCl في أنبوب 1.5 مل، وتتبخر في المبخر الدوارة. إعادة تعليق محتويات جميع الأنابيب في 60 ميكرولتر من HCl.
ملاحظة: إجراء التجفيف مهم لتركيز الحل والحصول على نفس وحدة التخزين لكل شرط. - استخدم لوحة من 96 بئرا لقياس تركيز الكالسيوم باستخدام كاشف Arsenazo III، المتوفر في مجموعة جاهزة للاستخدام (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل).
- إعداد محلول الكالسيوم القياسية من تركيز 10 ملغم / ديسيلت. وزن 10 ملغ من هيدروكسيد الكالسيوم (Ca(OH)2) وتذوب في 100 مل من الماء المقطر.
- في لوحة بئر واضحة 96، pipet 2 ميكرولتر من محلول فارغ (HCl، 0.6 N)، والحل القياسي، والعينة لكل بئر (10 ملغم / ديسيلتر)، والعينات. قم بإجراء التجربة في ثلاثية الريبليكات للتحقق من تباين الأنابيب. أضف 200 ميكرولتر من الكاشف لكل حالة.
ملاحظة: يجب تخفيف العينات فوق 15 ملغم/ديسيلت 1:1 مع المالحة، وإعادة المقايسة، وضرب النتيجة بمقدار اثنين. - احتضان رد الفعل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: رد الفعل مستقر لمدة 60 دقيقة. - قراءة وتسجيل امتصاص لوحة في 650 نانومتر. استخدم الصيغة التالية لحساب كمية الكالسيوم في العينات:
الكالسيوم (ملغم / مل) = (امتصاص عينة / امتصاص معيار) × تركيز معيار
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وبما أن قطر الصمامات الأبهرية المورينية يبلغ عادة 1 مم، يجب تجميع ثلاثة صمامات على الأقل لجمع مليون خلية قابلة للحياة لإجراء عمليات تجريبية مختلفة. تظهر الخطوات المختلفة لعملية عزل مركز فيينا الدولي في الشكل 1 والشكل 2. كما أنه من الصعب كشط يدويا أنسجة صمام، فمن الأفضل استخدام الإجهاد القص التي أنشأتها دوامة لإزالة VECs. في الواقع ، أظهرت نتائج تلطيخ immunofluorescence CD31 عدم وجود تلوث الخلايا البطانية(الشكل 3D). بالإضافة إلى ذلك، تعبر VICs الماوس vimentin و α-SMA، والتي هي علامات رئيسية لخلايا صمام (الشكل 3B، C).
تمعدن الخلايا في المختبر
واستخدمت عدة كواشف الكالسيوم لقياس تركيز الكالسيوم؛ الخلايا المعالجة مع المتوسطة تكلس لديها تركيز الكالسيوم أعلى مقارنة مع الخلايا غير المعالجة (الشكل 4A). تم تطبيع تركيز الكالسيوم مع تركيز البروتين الكلي. أكدت تلطيخ أحمر Alizarin قياسات عدة الكالسيوم الكاشف من خلال إظهار العقد الكالسيوم إيجابية حمراء (الشكل 4B).
الشكل 1: وصف تشريح الصمام. (أ) صورة تمثيلية لجميع الأدوات الجراحية اللازمة للتشريح ، هناك حاجة إلى مقص 2 لفتح جلد الماوس والمقص 3 لفتح الصدر. هناك حاجة إلى ملاقط 5 و 6 لعقد الجلد وفتح الصدر. (ب) اترك 3 مم من الأنسجة من الشريان الأورطي (السهم الأسود). (ج) قطع القلب في منتصف البطينين مع مقص رقم 4. (د) افتح القلب نحو الصمام الأبهري بمقص 3. استخدام ملاقط رقيقة 7 و 8 لتشريح بعناية الصمام الأبهري. الصمام مرئي ويحتوي على بعض النقاط السوداء التي هي سمة من سمات أنسجة صمام الفئران (السهم الأزرق). (ه) زيادة التكبير لتصور أفضل للصمام الأبهري. عزل صمام مع مقص صغير 4; (F) الحفاظ على الأنسجة مع ملاقط 7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وصف تمثيلي لعزل خلية صمام الماوس. الاختصارات: HEPES = 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-حمض بيبرازينيثانسولفونيك; RT = درجة حرارة الغرفة. DMEM = دولبيكو تعديل النسر المتوسطة؛ FBS = مصل الأبقار الجنينية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النمط الظاهري لخلايا صمام الماوس. وجهة نظر مجهرية من (أ) خلايا صمام معزولة حديثا. immunofluorescence تلطيخ تظهر (ب) خلايا إيجابية vimentin و (C) α-SMA. الخلايا سلبية ل (D) CD31 تلطيخ. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; CD31 = مجموعة من التمايز 31؛ α-SMA = ألفا على نحو سلس العضلات أكتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: في المختبر التكلس المقايسة. (أ) الفوسفات الغنية تكلس المتوسطة الناجمة عن تكلس مركز فيينا الدولي في المختبر, الذي تم قياسه مع عدة كاشف. (ب) صورة مجهرية تظهر تلطيخ أحمر إيجابي (يمين) لعقد الكالسيوم. (ج)أظهرت تلطيخ أحمر Alizarin العقد الكالسيوم إيجابية (السهم الأسود) من VICs ردا على المتوسطة تكلس. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: CTL- = التحكم; mVICs = خلايا الخلالية فالفولار الماوس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه المقالة بروتوكول مفصل عزل خلية صمام الماوس للثقافة الأساسية. تم تجميع ثلاثة صمامات الأبهر من الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع للحصول على عدد كاف من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول توصيف النمط الظاهري في مركز فيينا الدولي ومقايسة التمعدن في المختبر. تم تكييف هذه الطريقة من البروتوكول الموصوف سابقا من ماتيووآخرون.
أثناء عزل الصمامات الأبهرية ، يجب توخي الحذر لتجنب جميع مصادر العدوى المحتملة لحماية الخلايا من التلوث البكتيري أو الميكوبلازما. في الواقع ، من الأهمية بمكان أن تتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل بدء التجارب. يجب أن يستكمل محلول HEPES بالمضادات الحيوية بنسبة 1٪ لتقليل العدوى البكتيرية. وعلاوة على ذلك، قد يسبب الميكوبلازما علم الأمراض الخلوية وبالتالي تتداخل مع كل معلمة تقاس في ثقافة الخلية10.
طلاء الخلايا في أطباق الثقافة الصغيرة مع انخفاض حجم الثقافة المتوسطة أمر بالغ الأهمية لنمو مركز فيينا الدولي وانتشارها. السماح للأنسجة تسوية والالتزام طبق زراعة الخلية يسمح هجرة الخلايا من الأنسجة إلى جدار الطبق. وبالنظر إلى أن الخلايا المعزولة من الفئران الصغيرة تتكاثر بشكل أسرع ، فمن المستحسن نقل الخلايا إلى طبق ثقافة أكبر من 75 سم2 بعد 5 أيام من الثقافة. الحفاظ على الخلايا إلى التقاء 80٪ أمر بالغ الأهمية لتقليل تمايز VICs إلى النمط الظاهري الميوفيبرومي8.
كما هو مبين من خلال التصوير immunofluorescence، تظهر خلايا الصمام المعزول النمط الظاهري مثل الخلايا الليفية. VICs لديها السيتوبلازم ممدود والتعبير عن كل من فيمينتين وαSMA كما هو موضح في الدراسات السابقة. وأكد هذا العمل أن النمط الظاهري للفأرة VIC مشابه للنمط الذي سبق وصفه للمركبات VICs11 والإنسان VICs12. يتم إجراء معظم الدراسات المختبرية على تضيق الأبهر على خلايا من الحيوانات الكبيرة8،11. العيب الرئيسي للVICs porcine هو تمايزها التلقائي إلى النمط الظاهري العظام في المختبر حتى في وسائل الإعلامالعادية 13. ومع ذلك، لا التكلس الماوس VICs تلقائيا حتى في الممرات أعلى.
الماوس VICs التفريق إلى النمط الظاهري العظام استجابة لوسط تكلس باستخدام حمض الأسكوربيك، الأنسولين، وتحفيز الفوسفات. توضح هذه المقالة طريقة كمية لقياس الكالسيوم باستخدام مجموعة وطريقة نوعية باستخدام تلطيخ أحمر Alizarin. وأظهرت كلتا الطريقتين زيادة كبيرة في التكلس استجابة للعلاج المتوسط المتكلس. مجموعة قياس الكالسيوم هي الطريقة القياسية الذهبية ، والتي تقدم قياس الكالسيوم الكمي الدقيق14.
في الكاشف Arsenazo III ، يتم منع تدخل المغنيسيوم عن طريق إدراج سلفونات 8 هيدروكسيكوينولين. يتفاعل الكالسيوم مع الكاشف لتشكيل مجمع أرجواني اللون ، يمتص 650 نانومتر. شدة اللون يتناسب مع تركيز الكالسيوم. وقد تم التحقق من صحة دقة كاشف أرسينازو-3 سابقا باستخدام قياس الطيف الطيفي للامتصاص الذري. وتستخدم نفس الطريقة في المختبرات السريرية لقياس تركيز الكالسيوم الكلي في السوائل البيولوجية14. تكلس في تضيق الأبهر هو أساسا هيدروكسيباتيت، كما هو مبين مع تشتيت الأشعة السينية تحليل المجهر الإلكتروني المسحالضوئي 7،12،15. في الواقع ، من المهم تحليل تكلس غشاء الخلية بدلا من الكالسيوم المجاني لمحاكاة تكلس أنسجة الصمام الأبهري بدقة أكبر.
الفئران تمثل مصدرا جيدا للVICs لدراسة الآليات الجزيئية المؤدية إلى تكلس الصمام الأبهري. ومع ذلك، ضع في اعتبارك أن VICs في المختبر ليست مشابهة ل VICs في الصمامات الحية. وهناك قيد آخر هو حقيقة أن هناك حاجة إلى مجموعة من الصمامات من الفئران 3-5 لجعل ثقافة خلية واحدة. يجب أن يكون حمام السباحة من الفئران littermate لتقليل الاختلافات. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي إجراء التجارب في ثلاث نسخ لتأكيد جميع النتائج. ومع ذلك ، فإن استخدام الصمام الأبهري بأكمله في الثقافة يمكن أن يخفف من هذا القيد. ومع ذلك، يجب التحقق من صحة هذه الدراسات في المختبر في الأنسجة البشرية لتعزيز النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C.
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P.
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
