Summary
Bu makalede, fare aort kapak hücrelerinin iki adımlı bir kollajenaz prosedürü ile izolasyonu açıklanmaktadır. İzole fare valf hücreleri, bu in vitro kireçlenme tahlilleri gibi farklı tahlillerin yapılması ve aort kapak mineralizasyonuna yol açan moleküler yolların araştırılması için önemlidir.
Abstract
Aort kapak hücrelerinin kireçlenmesi aort darlığı ayırt edici özelliğidir ve kapak cusp fibrozisi ile ilişkilidir. Kapak geçiş hücreleri (VC'ler), aort darlığında kireçlenme sürecinde osteoblast benzeri hücrelere ayırıcı programlarının aktivasyonu ile önemli bir rol oynar. Fare VIC'leri, aort kapak hücresinin mineralizasyonunu yönlendiren sinyal yollarının aydınlatılması için iyi bir in vitro araçtır. Burada açıklanan yöntem, bu yazarlar tarafından başarıyla kullanılan, taze izole hücrelerin nasıl elde edildiğini açıklar. 1 mg/mL ve 4.5 mg/mL ile iki aşamalı kollajenaz işlemi yapıldı. İlk adım, endotel hücre tabakasını çıkarmak ve herhangi bir kirlenmeyi önlemek için çok önemlidir. İkinci kollajenaz inkübasyonu, VC'lerin dokudan plakaya geçişini kolaylaştırmaktır. Ayrıca izole edilmiş fare valf hücrelerinin fenotip karakterizasyonu için bir immünofluoresans boyama prosedürü tartışılmıştır. Ayrıca kalsiyum reaktif ölçüm işlemi ve alizarin kırmızısı lekelenme kullanılarak kireçlenme tahlil in vitro olarak gerçekleştİrilmiştir. Fare kapak hücresi birincil kültürünün kullanımı, hücre mineralizasyon in vitrosunu inhibe etmek için yeni farmakolojik hedeflerin test edilmesi için gereklidir.
Introduction
Kireçlenmiş aort kapak hastalığı (CAVD), 65 yaş üstü yaşlı bireylerin yaklaşık% 2,5'ini etkileyen batı popülasyonlarında en yaygın valvüler kalphastalığıdır. CAVD altı milyondan fazla Amerikalıyı etkiler ve normal kan akışını bozan broşürlerin mekanik özelliklerindeki değişikliklerle ilişkilidir1,2. Şu anda hastalığın ilerlemesini durdurmak veya mineral gerilemesini aktive etmek için farmakolojik bir tedavi yoktur. CAVD tedavisinde tek etkili tedavi cerrahi veya transktheter aort kapak replasmanı ile aort kapak değişimi3' dür. Bu nedenle, yeni farmakolojik hedefleri belirlemek için kapak mineralizasyonuna yol açan moleküler mekanizmaların araştırılması zorunludur. Gerçekten de, tedavi edilmeyen aort darlığı sol ventrikül disfonksiyonu ve kalp yetmezliği gibi birkaç olumsuz sonucu vardır4.
Aort kapakçığı fibrosa, spongiosa ve ventrikülaris olarak bilinen ve vic'leri baskın hücre tipi5olarak içeren üç katmandan oluşur. Fibrosa ve ventriküller bir damar endotel hücreleri (VC) tabakası ile kaplıdır5. GC'ler, enflamatuar hücrelerin ve parakrin sinyallerin geçirgenliğini düzenler. Artan mekanik stres, VC'lerin bütünlüğünü etkileyebilir ve aort kapakçığının homeostazını bozabilir ve enflamatuar hücre istilasına yol açabilir6. Taramalı elektron mikroskopi analizleri, insan kireçlenmiş aort kapağında endotelin bozulduğunu göstermiştir7.
Kireçlenmiş dokunun histolojik analizleri osteoblastların ve osteoklastların varlığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, VC'lerin osteojenik farklılaşması hem in vitro hem de insan kapak dokusunda gözlenmiştir8. Bu işlem esas olarak Runt ile ilgili transkripsiyon faktörü 2 (Runx2) ve kemik morfogenetik proteinleri (BMP'ler) 8,9tarafından düzenlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri Mount Sinai kurumsal çekirdek ve kullanım komitesinde Icahn Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır.
1. Yetişkin farelerden valf hücresi izolasyonundan önce hazırlık
- Şekil 1A'da gösterilen tüm cerrahi aletleri % 70 v/v etanol kullanarak ve daha sonra 30 dakika boyunca otomatik olarak kapatarak temizleyin ve sterilize edin.
- 10 mm HEPES'in 50 mL'sine 500 μL penisilin-streptomisiin ekleyin. 50 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) aliquot hazırlayın. Çözümleri buzda tut.
- 1 mg/mL ve 4,5 mg/mL kollajenaz çözeltileri hazırlayın ve tüm prosedürü gerçekleştirmek için 15 mL tüplerde her çözeltinin 5 mL'lik kısmını kullanın. 5 mL 1 mg/mL kollajenaz hazırlamak için, 5 mg kollajenazı 2,5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM, fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotiklerle desteklenmiş 10 mM HEPES'in 2,5 mL'si (1,2 adımdan %1 penisilin-streptomisin) ile karıştırın. Kontaminasyonu gidermek için çözeltileri 0,22 μm filtreden filtreleyin.
NOT: Enzimleri korumak için çözeltileri buzda tutun. - Aşağıda açıklanan tüm adımlarda kullanmadan önce DMEM sokmasını 37 °C'ye ısıtın. DMEM'i %1 penisilin-streptomisin, %1 sodyum piruvat, 5 mL 200 mM L-glutamin, 1 mL mikoplazma eliminasyon reaktifi (Bkz. Malzeme Tablosu)ve %10 FBS ile destekleyerek tam orta hazırlayın.
2. Valf hücrelerinin izolasyonu
- Deney için10 6 hücre elde etmek için, beş 8 haftalık fare kullanın (en az üç). Fareyi 1 mL izofluran ile ıslatılmış küçük bir kağıt parçasıyla birlikte bir indüksiyon odasına yerleştirin, ancak dokuyla temasa izin vermeyin. Hayvanın tamamen uyuşturuldığını onaylamak için; parmak sıkışma refleksini kontrol edin ve sonra fareyi servikal çıkık ile ötenazileyin. Aşağıda açıklanan prosedür terminal olduğu için servikal çıkık öncesinde herhangi bir ağrıyı hafifletmek için izofluran kullanın.
- Fareyi bir diseksiyon platformuna yerleştirin ve yerinde tutmak için pençeleri canüllerle sabitle. Göğsü ve karnı etanol ile temizleyin; karnı ve göğsü makasla açın. Küçük cerrahi makasla, fareyi çıkarmak için sol kulakçık ve sol ventrikül arasında kesin. Kalpteki kanı çıkarmak için kalbi 10 mL soğuk 1x PBS ile perfuse edin.
- Kalbi kesin ve Şekil 1B'degösterildiği gibi yükselen aorttan 3 mm uzak tutun. Aort kapağını stereomikroskop altında parçalara ayırın. Kalbi ventriküllerin ortasında yatay olarak kesin (Şekil 1C). Sol ventrikülü aorta doğru kesin ve aort kapağını dikkatlice kesin (Şekil 1D-F). Vanaları 35 mm'lik küçük bir doku kültürü çanağını bir araya getirin.
- İzole vanaları 75 mm hücre kültürü çanağını antibiyotiklerle (%1 penisilin-streptomisinin) desteklenmiş 5 mL soğuk HEPES (10 mM) ile yıkayın (Şekil 2). Adım 1.3'te yukarıda açıklandığı gibi iki adet 15 mL kollajenaz 1 mg/mL ve 4.5 mg/mL tüpü hazırlayın.
NOT: Diseksiyondan sonra, kontaminasyonu en aza indirmek için steril bir biyogüvenlik başlığındaki izole vanaları manipüle edin. - Kollajenaz tip I'deki (1 mg/mL) kapakçıkları 37 °C'de 30 dakika boyunca sürekli sallanarak kuluçkaya yatırın(Şekil 2). Tüpü 150 × g'da5 dakika santrifüj, peletin bir kez 2 mL HEPES (10 mM) ve girdabı yüksek hızda 30 sn ile yıkayın. Bu tüpün içeriğini 35 mm'lik bir kültür kabına dökün ve ince cımbız kullanarak doku parçalarını dikkatlice yeni bir tüpe aktarın.
NOT: Bu aşamada, VC'ler hala dokudan ayrışmamış ve pelet doku parçaları içerir. Endotel hücreleriyle kirlenmeyi önlemek için, 2.5. - Peleti 35 dakika boyunca sürekli ajitasyon altında 37 °C'de 5 mL kollajenaz tip I (4.5 mg/mL) ile 15 mL'lik bir tüpte kuluçkaya yatırın. Hücreleri ayırmak için 1 mL pipetle hücreleri yeniden askıya alın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüj.
- Üstnatantı atın ve peletin 2 mL'lik komple DMEM'de yeniden askıya alın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüj. Hücreleri temizlemek için bu adımı iki kez yineleyin.
NOT: Pelet hala bazı doku parçalarına sahip olacaktır. - Peletin 1 mL'lik tam orta alanda yeniden askıya alın ve hücreleri kültür çanasına bağlanmalarını kolaylaştırmak için minimum miktarda 6 kuyulu bir hücre kültürü kabının bir kuyusunda plakalayın. Hücreleri bozulmadan% 5 karbondioksitli 37 °C inkübatörde bırakın.
- 3 gün sonra, doku kalıntılarına yakın iyi büyümeyi doğrulamak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. Mikroskop altında 1.000 hücre göründüğünde, doku kalıntılarını otomatik kapatılmış cımbızla dikkatlice çıkarın ve ortamı değiştirin.
NOT: Plaka bozulmamalıdır; gerekli sayıda hücre gözlenmezse, hücre kültürü çanağı 2 gün daha inkübatöre geri yerleştirin. - Hücreler% 70 birleştiğinde (2.5 × 105), trypsinize ve daha sonra 75 mm doku kültürü çanağında aktarın.
3. Hücre kimliğinin ve morfolojisinin analizi
NOT: Hücre morfolojisi ve endotel hücre kontaminasyonunda immünofluoresans lekeleme kullanıldı.
- Kaputu %70 v/v/ etanol ile temizleyin. Steril kapakları (22 mm x 22 mm) 6 kuyulu plakalara yerleştirin.
NOT: Kapakları sterilize etmek için% 70 etanol ile yıkayın ve ultraviyole ışık altında gece boyunca kaputta saklayın. - Tohum 6 kuyulu bir tabakta kuyu başına 100.000 hücre. 24 saat sonra, hücreleri 1x PBS'de iki kez yıkayın ve 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehitte (PFA) sabitlayın. Hücreleri 1x PBS ile iki kez tekrar yıkayın.
NOT: Bu noktada, hücreler boyama işlemi başlayana kadar PBS'de 4 °C'de tutulabilir. - VC'lerin saflığını doğrulamak için, GC'lerle kontaminasyonu tespit etmek için alfa-düz kas aktinin (αSMA), vimentin ve farklılaşma kümesi 31 (CD31) kullanın.
- 500 μL normal serum (ikincil antikorla aynı tür), 9,5 mL 1x PBS ve 30 μL Triton X-100 karıştırarak bir bloklama tamponu aliquot hazırlayın. Hücreleri 1 saat boyunca engelleme arabelleği 2 mL'de kuluçkaya yatırın.
- 30 μL Triton X-100, 10 mL 1x PBS ve 0,1 g sığır serum albümini (BSA) içeren antikor seyreltme tamponunu hazırlayın.
- Boş bir uç kutusu alın, nemli bir oda oluşturmak için kutunun yarısını suyla doldurun. Uç tutucuyu ıslak bir doku ve ardından bir parafilm tabakası ile örtün.
- Birincil antikorun 1 μL'sini alın ve 3,5 adımda hazırlanan seyreltme tamponunun 100 μL'si ile karıştırın. Seyreltilmiş antikorun 50 μL'sini parafilme yerleştirin. Kapakları kuyulardan alın, ters çevirin ve antikor damlalarının üzerine yerleştirin; hücreleri antikorla bir gecede kuluçkaya yatır.
- 6 kuyulu plakaya 1 mL PBS ekleyin. Kapak kapağını parafilmden dikkatlice çıkar, ters çevirin ve kuyuya yerleştirin. Hücreleri 5 dakika boyunca sürekli nazik bir ajitasyonla yıkayın. PBS'i taze PBS ile değiştirin; hücreleri 3 kez yıkayın.
- Hücreleri seyreltilmiş ikincil antikorla (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) 1 saat kuluçkaya yatırın. Antikor seyreltme tamponunun 500 μL'sine ikincil antikorun 1 μL'sini ekleyin (adım 3.5'te hazırlanır). Plakayı alüminyum folyo ile örtün. Hücreleri 1 mL 1x PBS ile 3 kez sürekli ajitasyonla yıkayın.
- Kapakları 50 μL 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) montaj ortamı ile monte edin ve hücrelerin morfolojisini ve VEC kontaminasyonunu analiz etmek için mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin.
4. In vitro kireçlenme tahlilleri
- Kaputu% 70 etanol ile temizleyin, DMEM ortamını 37 ° C'ye ısıtın.
- Tam DMEM'de 6 kuyulu plakalara 100.000 hücre/koşul ve 37 °C'de 24 saat kültür.
- DMEM'de %5 FBS ile2mM NaH2PO 4 ,10 -7 M insülin ve 50 μg/mL askorbik asit karıştırarak kireçleme ortamını hazırlayın. 93 mL DMEM için 5 mL FBS, 1 mL antibiyotik (son konsantrasyon % 1), 1 mL sodyum piruvat (100 mM), 27,5 mg NaH2PO4, 5,8 μL insülin ve 5 mg askorbik asit ekleyin.
NOT: Kullanmadan önce çözeltiyi 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin. - 24 saat sonra, süpernatant ortamını kireçleme ortamıyla değiştirin. Hücreleri 37 °C'de 7 gün kuluçkaya yatırın. 3rd günde, taze kireçleme ortamı ile değiştirin ve 7 günlük tedaviyi tamamlamak için plakayı inkübatöre geri yerleştirin.
- 7 gün sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri 2 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 1 mL 0,6 N hidroklorik asit (HCl) içinde 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yaslanın. HCl'yi 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın ve döner evaporatörde buharlaştırın. Tüm tüplerin içeriğini 60 μL HCl'de yeniden askıya alın.
NOT: Kurutma prosedürü, çözeltiyi konsantre etmek ve her durum için aynı hacme sahip olmak için önemlidir. - Kullanıma hazır bir kit içinde bulunan Arsenazo III reaktifini kullanarak kalsiyum konsantrasyonu ölçmek için 96 kuyulu bir plaka kullanın (daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosu'na bakın).
- 10 mg/dL konsantrasyonda bir kalsiyum standart çözeltisi hazırlayın. 10 mg kalsiyum hidroksit (Ca(OH)2)tartın ve 100 mL damıtılmış suda çözün.
- Net bir 96 kuyu plakasında, pipet 2 μL boş çözelti (HCl, 0.6 N), standart çözelti, kuyu başına numune (10 mg / dL) ve numuneler. Pipetleme değişkenliğini doğrulamak için denemeyi üç taraflı olarak gerçekleştirin. Her durum için 200 μL reaktif ekleyin.
NOT: 15 mg/dL'nin üzerindeki numuneler 1:1 salin ile seyreltilmeli, yeniden test edilmeli ve sonuç iki ile çarpılmalıdır. - Oda sıcaklığında reaksiyonun 15 dakika kuluçkaya yatır.
NOT: Reaksiyon 60 dakika boyunca kararlıdır. - Plakanın emiciliğini 650 nm'de okuyun ve kaydedin. Numunelerdeki kalsiyum miktarını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
Kalsiyum (mg/mL) = (Numunenin emültülesi/standardın emültülesi) × Standart konsantrasyonu
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murine aort kapakçıkları tipik olarak 1 mm çapında olduğundan, farklı deneysel prosedürler için bir milyon uygun hücre toplamak için en az üç valf birikmelidir. VIC yalıtım işleminin farklı adımları Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Kapak dokusunu elle kazımak zor olduğundan, VORTEXING tarafından oluşturulan kesme stresinin IC'leri çıkarmak için kullanılması tercih edilir. Gerçekten de, CD31 immünofluoresans boyama sonuçları endotel hücrelerinin kirlenmesinin olmadığını göstermiştir (Şekil 3D). Ek olarak, fare VIC'leri valf hücrelerinin ana belirteçleri olan vimentin ve α-SMA'yı ifade edin (Şekil 3B,C).
Tüp bebekte hücre mineralizasyonu
Kalsiyum konsantrasyonu ölçmek için bir kalsiyum reaktif kiti kullanıldı; kireçleme ortamı ile tedavi edilen hücreler, tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla daha yüksek kalsiyum konsantrasyonuna sahiptir (Şekil 4A). Kalsiyum konsantrasyonu toplam protein konsantrasyonu ile normalleştirildi. Alizarin kırmızı boyama, kırmızı pozitif kalsiyum düğümleri göstererek kalsiyum-reaktif kiti ölçümlerini doğruladı (Şekil 4B).
Şekil 1: Kapak diseksiyonunun tanımı. (A) Diseksiyon için gerekli tüm cerrahi aletlerin temsili görüntüsü, farenin derisini açmak için makas 2 ve göğsü açmak için makas 3 gereklidir. Cildi tutmak ve göğsü açmak için 5 ve 6 cımbız gerekir. (B) Aorttan (siyah ok) 3 mm doku bırakın. (C) Kalbi ventriküllerin ortasında 4 numaralı makasla kesin. (D) Kalbi makasla aort kapağına doğru açın 3. Aort kapağını dikkatlice parçalamak için 7 ve 8'lik ince cımbızları kullanın. Valf görülebilir ve fare kapak dokusunun (mavi ok) karakteristiği olan bazı siyah noktalara sahiptir. (E) Aort kapakçığını daha iyi görselleştirmek için büyütmeyi artırın. Vanayı küçük makasla izole edin 4; (F) cımbızla dokuyu koruyun 7. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fare valfi hücre yalıtımının temsili açıklaması. Kısaltmalar: HEPES = 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesülonik asit; RT = oda sıcaklığı; DMEM = Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı; FBS = fetal sığır serumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fare valf hücresi fenotipi. (A)yeni izole edilmiş valf hücrelerinin mikroskobik görünümü. İmmünofluoresans lekelenme gösteren (B) vimentin-pozitif hücreler ve (C) α-SMA. Hücreler (D) CD31 boyama için negatiftir. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindole; CD31 = farklılaşma kümesi 31; α-SMA = alfa-düz kas aktasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İn vitro kireçlenme tahlil. (A) Fosfat bakımından zengin kalsfying orta indüklenen VIC kalsifikasyon in vitro, reaktif kit ile ölçüldü. (B) Kalsiyum düğümleri için kırmızı pozitif lekeleme gösteren mikroskobik görüntü (sağda). (C) Alizarin kırmızı lekeleme, kireçleme ortamına yanıt olarak VC'lerin pozitif kalsiyum düğümlerini (siyah ok) gösterdi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: CTL- = Kontrol; mVIC'ler = fare valvüler interstisyel hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, birincil kültür için fare valfi hücre yalıtımının ayrıntılı bir protokolü sunulmaktadır. 8 haftalık farelerden alınan üç aort kapakçığı, yeterli sayıda hücre elde etmek için birikti. Ek olarak, bu protokol VIC fenotipinin karakterizasyonu ve in vitro mineralizasyon testini açıklar. Yöntem, Mathieu ve ark.7'den daha önce açıklanan protokolden uyarlanmıştır.
Aort kapaklarının izolasyonu sırasında, hücreleri bakteriyel veya mikoplazma kontaminasyonundan korumak için olası tüm bulaşıcılık kaynaklarından kaçınmaya özen edilmelidir. Aslında, deneylere başlamadan önce tüm cerrahi aletleri otoklavlamak çok önemlidir. Bakteriyel enfeksiyonu en aza indirmek için HEPES çözeltisi % 1 antibiyotik ile desteklenmelidir. Ayrıca, mikoplazma sitopatolojiye neden olabilir ve sonuç olarak hücre kültüründe ölçülen her parametreye müdahale edebilir10.
Küçük kültür yemeklerindeki hücrelerin daha düşük kültür ortamı hacmiyle kaplanması VIC büyümesi ve çoğalması için kritik öneme sahiptir. Dokunun oturmasına ve hücre kültürü çanamasına yapışmasına izin vermek, dokudan bulaşık duvarına hücre geçişine izin eder. Genç farelerden izole edilmiş hücrelerin daha hızlı çoğaldığı göz önüne alındığında, hücrelerin 5 günlük kültürden sonra 75 cm2'lik daha büyük bir kültür yemeğine aktarılması önerilir. Hücrelerin% 80'e kadar birleşmesi için muhafaza etmek, VIC'lerin bir miyofibroblast fenotipine farklılaşmasını en aza indirmek için çok önemlidir8.
İmmünofluoresans görüntülemede gösterildiği gibi, izole kapak hücreleri fibroblast benzeri bir fenotip göstermektedir. VIC'ler uzun bir sitoplazmaya sahiptir ve önceki çalışmalarda açıklandığı gibi hem vimentin hem de αSMA'yı ifade eder. Mevcut çalışma, fare VIC fenotipinin daha önce porcine VIC11 ve insan VIC12için açıklanana benzer olduğunu doğruladı. Aort darlığı üzerine yapılan en tüp bebek çalışmaları büyük hayvanlardan alınan hücreler üzerinde8,11. Porcine VC'lerin temel dezavantajı, normal medyada bile osteoblast fenotip in vitro'ya spontan farklılaşmalarıdır13. Bununla birlikte, fare VIC'leri daha yüksek pasajlarda bile kendiliğinden kireçlenir.
Fare VIC'leri, askorbik asit, insülin ve fosfat stimülasyonu kullanarak kalsigatör ortamına yanıt olarak osteoblast fenotipine farklılık sağlar. Bu makalede, bir kit kullanılarak nicel bir kalsiyum ölçümü yöntemi ve Alizarin kırmızı boyama kullanılarak nitel bir yöntem açıklanmaktadır. Her iki yöntem de kalsifikasyona yanıt olarak kireçlenmede önemli bir artış göstermiştir. Kalsiyum ölçüm kiti, tam bir nicel kalsiyum ölçümü sunan altın standart yöntemdir14.
Arsenazo III reaktifinde, magnezyum paraziti 8-hidroksikinolin sülfonatının dahil edilmesiyle önlenir. Kalsiyum, 650 nm'de emilen mor renkli bir kompleks oluşturmak için reaktifle reaksiyona giren. Rengin yoğunluğu kalsiyum konsantrasyonu ile orantılıdır. Arsenazo-III reaktifinin doğruluğu daha önce atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile doğrulanmıştır. Aynı yöntem klinik laboratuvarlarda biyolojik sıvılardaki toplam kalsiyum konsantrasyonu ölçmek için kullanılır14. Aort darlığında kireçlenme esas olarak hidroksiapatittir, dispersif x-ışını enerji tarama elektron mikroskopi analizi7,12,15ile gösterildiği gibi. Nitekim, aort kapak dokusunun kireçlenmesini daha doğru bir şekilde taklit etmek için serbest kalsiyum yerine hücre zarının kireçlenmesini analiz etmek önemlidir.
Fareler, aort kapak kireçlenmesine yol açan moleküler mekanizmaların incelenmesi için iyi bir VC kaynağını temsil eder. Bununla birlikte, IN VITRO'daki VIC'lerin canlı kapakçıklardaki VC'lere benzemediğini unutmayın. Başka bir sınırlama, tek bir hücre kültürü yapmak için 3-5 fareden bir valf havuzuna ihtiyaç duyulmasıdır. Havuz, varyasyonları en aza indirmek için çöp arkadaşı farelerden olmalıdır. Ek olarak, tüm bulguları doğrulamak için üç taraflı deneyler yapılmalıdır. Bununla birlikte, kültürde tüm aort kapakçığının kullanılması bu sınırlamayı hafifletebilir. Bununla birlikte, bulguları güçlendirmek için bu in vitro çalışmaların insan dokusunda doğrulanmış olması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C.
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P.
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
