Summary
本文描述了通过两步拼贴程序分离小鼠主动脉瓣细胞。分离的小鼠瓣细胞对于执行不同的测定（如 体外 钙化检测）和研究导致主动脉瓣矿化的分子通路非常重要。
Abstract
主动脉瓣细胞的钙化是主动脉狭窄的标志，与瓣膜尖纤维化有关。瓣膜间质细胞（VICs）通过激活其去分化程序，在主动脉狭窄的钙化过程中发挥重要作用。小鼠 VIC 是用于阐明驱动主动脉瓣细胞矿化的信号通路的一个很好的 体外 工具。此处描述的方法，这些作者成功使用，解释了如何获得新分离的细胞。以1毫克/mL和4.5毫克/mL进行两步拼贴手术。第一步对于去除内皮细胞层和避免任何污染至关重要。第二个拼贴剂孵化是促进VIC从组织转移到板。此外，还讨论了分离小鼠瓣膜细胞表型特征的免疫荧光染色程序。此外，钙化检测是使用钙试剂测量程序和阿里扎林红色染色 在体外 进行的。使用小鼠瓣膜细胞原培养物对于测试新的药理靶点以抑制体外细胞矿化至关重要 。
Introduction
钙化主动脉瓣病（CAVD）是西方人群中最常见的瓣膜心脏病，影响近2.5%的65岁以上的老年人。CAVD影响超过600万美国人，并与传单的机械性质的变化，损害正常的血液流过1，2。目前，没有药理治疗来阻止疾病的进展或激活矿物质回归。治疗CAVD的唯一有效疗法是主动脉瓣置换手术或导管主动脉瓣置换3。因此，必须研究导致阀门矿化的分子机制，以确定新的药理学目标。事实上，未经治疗的主动脉狭窄有若干不良后果，如左心室功能障碍和心力衰竭4。
主动脉瓣由三层组成，称为纤维瘤、海绵状和心室，其中含有以VC为主要细胞型的5。纤维瘤和心室被一层血管内皮细胞（VECs）5覆盖。VEC调节炎症细胞和寄生虫信号的渗透性。机械应力增加可能会影响VEC的完整性，扰乱主动脉瓣的平衡，导致炎症细胞入侵6。扫描电子显微镜分析显示，人类钙化主动脉瓣7的内皮被破坏。
钙化组织的组织学分析揭示了骨细胞和骨囊的存在。此外，在体外和人体瓣膜组织8中观察到VIC的骨分化。这个过程主要是由Runt相关的转录因子2（Runx2）和骨形态遗传蛋白（BMPs）8，9精心策划的。
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Protocol
注：这里描述的所有动物程序都已获得西奈山伊坎医学院机构核心和使用委员会的批准。
1. 在从成年小鼠中分离出瓣膜细胞之前的准备
- 使用 70% v/v 乙醇清洁和消毒 图 1A 中显示的所有手术器械，然后用 70% 乙醇自动清洁手术工作空间 30 分钟。
- 加入500微升青霉素-链霉素至50ml的10毫米赫佩斯。准备 50 mL 的 1 倍磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的碱度。将解决方案保留在冰上。
- 准备 1 毫克/mL 和 4.5 毫克/mL 拼贴剂解决方案，并在 15 mL 管中使用每个溶液中的 5 mL 执行整个过程。准备 5 mL 的 1 毫克/mL 拼贴剂， 混合 5 毫克拼贴剂与 2.5 mL 的杜尔贝科的改性鹰介质 （DMEM， 胎儿牛血清 （FBS） 免费） 和 2.5 mL 的 10 mM HEPES 补充抗生素 （1% 青霉素链霉素从第 1.2 步）.通过 0.22 μm 过滤器过滤解决方案，以消除任何污染。
注意：将溶液保留在冰上以保护酶。 - 在下面描述的所有步骤中使用之前，将 DMEM 解决方案加热到 37 °C。通过补充1%青霉素-链霉素、1%丙酮酸钠、5mL 200m L-谷氨酰胺、1 mL支原体消除试剂（见 材料表）和10%FBS来补充DMEM，准备完整的介质。
2. 阀门单元的隔离
- 要获得106 个细胞进行实验，请使用5只8周大的小鼠（最少3只）。将鼠标与浸泡在 1 mL 异黄素的一小块纸巾一起放在感应室中，但不允许与组织接触。确认动物完全麻醉：检查脚趾捏反射， 然后通过颈椎错位安乐死老鼠。使用异黄素来减轻颈椎错位前的任何疼痛，因为下面描述的程序是终端。
- 将鼠标放在解剖平台上，用罐头固定爪子以将其固定到位。用乙醇清洁胸部和腹部;用剪刀打开腹部和胸部。用小手术剪刀，在左中庭和左心室之间切开，以驱除老鼠。用 10 mL 的冷 1x PBS 给心脏注入香水，以去除心脏的血液。
- 切开心脏，保持3毫米从上升主动脉如图1B显示。在立体显微镜下解剖主动脉瓣。在心室中间水平切开心脏（图1C）。切开左心室朝向主动脉，并仔细解剖主动脉瓣（图1D-F）。将阀门集中到一个 35 mm 的小型组织培养皿中。
- 用5 mL的冷 HEPES（10 mM）清洗75毫米细胞培养皿中的分离瓣膜，辅以抗生素（1%青霉素-链霉素），以去除血液（图2）。准备两个 15 mL 管拼贴剂 1 毫克/mL 和 4.5 毫克/mL 如上文所述，在第 1.3 步。
注：解剖后，在无菌生物安全罩中操作隔离阀，以尽量减少污染。 - 在 37 °C 下以拼贴剂 I 型 （1 毫克/兆升） 孵育阀门 30 分钟，持续摇晃（图 2）。在 150 × 克时将管子离心 5 分钟，用 2 mL 的 HEPES （10 mM） 清洗颗粒一次，在高速下用 30s 的漩涡洗一次。将管子中的内容倒入 35 mm 培养皿中，然后用薄钳小心地将组织碎片转移到新管中。
注：在这个阶段，VIC仍未脱离组织，颗粒包含组织碎片。为了避免内皮细胞的污染，不要在2.5步涡流后离心。 - 在连续搅拌 35 分钟的情况下，在 37 °C 下用 5 mL 的拼贴剂 I 型 （4.5 毫克/毫升） 将颗粒孵化在 15 mL 管中。用 1 mL 移液器重新悬挂细胞以分离细胞，在 4 °C 下以 150 × g 离心机将离心机重新悬挂 5 分钟。
- 丢弃超高音，并在 2 mL 的完整 DMEM 中重新悬挂颗粒。离心机在 150 × g 5 分钟在 4 °C. 重复此步骤两次以清洁细胞。
注意：颗粒仍有一些组织碎片。 - 将颗粒重新悬挂在 1 mL 的完整介质中，并将细胞平放在 6 井细胞培养皿的一口井中，以最小的介质量，以方便它们附着在培养皿中。将细胞不受干扰地留在 37 °C 的孵化器中，二氧化碳为 5%。
- 3天后，检查显微镜下的细胞，以验证组织碎片附近的良好生长。一旦在显微镜下看到1000个细胞，小心地用自动切开的钳子清除组织碎片，并改变介质。
注：板不应被打扰：如果未观察到所需的细胞数量，将细胞培养盘放回孵化器中再放2天。 - 当细胞70%汇流（2.5×105）时，尝试先尝试，然后将其转移到75毫米组织培养皿中。
3. 细胞特征和形态分析
注：免疫荧光染色用于研究细胞形态和内皮细胞污染。
- 用 70% v/v/ 乙醇清洁发动机罩。将无菌盖片（22 毫米 x 22 毫米）放在 6 井板中。
注意：要对盖唇进行消毒，用 70% 乙醇清洗，并在紫外线下将其保持在引擎盖中过夜。 - 在6井板中每口井播种100，000个细胞。24小时后，在1x PBS中清洗细胞两次，并将它们固定在4%的副甲醛（PFA）中20分钟。用 1x PBS 再次清洗细胞两次。
注意：此时，细胞可以在 4 °C 下保存在 PBS 中，直到染色程序开始。 - 要验证 VIC 的纯度，请使用α-平滑肌作用素 （+SMA）、维他汀和分化 31 （CD31） 集群来检测 VEC 的污染。
- 通过混合 500 μL 的正常血清（与二级抗体相同）、1x PBS 的 9.5 mL 和 Triton X-100 的 30 微升来准备阻塞缓冲器的报价。将细胞在阻塞缓冲器的 2 mL 中孵育 1 小时。
- 准备含有 30 μL Triton X-100、10 mL 1x PBS 和 0.1 克牛血清白蛋白 （BSA） 的抗体稀释缓冲器。
- 拿一个空的提示盒，用水填满一半的盒子，形成一个潮湿的室。用湿组织盖住尖端支架，然后用一张护身膜盖住。
- 取 1 μL 的原发性抗体，并将其与第 3.5 步准备的 100 μL 稀释缓冲器混合。将稀释抗体的 50 μL 放在副膜上。从井中取出盖片，翻转过来，放在抗体滴的顶部：用抗体在一夜之间孵育细胞。
- 在 6 井板中加入 1 mL 的 PBS。小心地从副膜中取出盖片，翻转过来，放在井里。用连续的温和搅拌清洗细胞5分钟。用新鲜的 PBS 替换 PBS;洗细胞3次。
- 用稀释的二级抗体（1/500）（亚历克萨-488，亚历克萨-555）孵育细胞1小时。将 1 μL 的辅助抗体添加到抗体稀释缓冲器的 500 μL（以第 3.5 步准备）。用铝箔盖住盘子。用 1 mL 的 1x PBS 连续搅拌清洗细胞 3 次。
- 用 50 微升的 4+，6-二苯丙酸酯 （DAPI） 安装介质安装盖片，并在显微镜下观察细胞，以分析细胞的形态和 VEC 污染。
4. 体外 钙化检测
- 用 70% 乙醇清洁发动机罩，将 DMEM 中度加热至 37 °C。
- 种子 100，000 细胞/条件成 6 井板在完整的 DMEM， 和培养 24 小时在 37 °C.
- 通过混合 2 mM 的 NaH2PO4、10-7 M 胰岛素和 50 μg/mL 抗坏血酸在 DMEM 中混合 5% FBS 来准备钙化介质。对于 93 mL 的 DMEM，加入 5 mL 的 FBS、1 mL 的抗生素（最终浓度 1%）、1 mL 的丙状酸钠（100 mM）、27.5 毫克的 NaH2PO4、5.8 μL 的胰岛素和 5 毫克的抗坏精酸。
注意：使用 0.22 μm 过滤器在使用前过滤解决方案。 - 24 小时后，用钙化介质替换超高介质。在 37 °C 下孵育细胞 7 天。 第 3天，用新鲜的钙化介质代替，将板放回孵化器中，完成7天的治疗。
- 7 天后，取出介质，用 1x PBS 的 2 mL 清洗细胞两次。在 37 °C 下将细胞在 0.6 N 盐酸 （HCl） 的 1 mL 中孵育 24 小时。 将 HCl 收集到 1.5 mL 管中，并在旋转蒸发器中蒸发。将所有管子的内容重新悬挂在 60 μL 的 HCl 中。
注：干燥过程对于集中溶液和每个条件具有相同的体积非常重要。 - 使用 96 井板使用 Arsenazo III 试剂测量钙浓度，该试剂可用于即用套件（有关详细信息，请参阅 材料表 ）。
- 准备10毫克/分升浓度的钙标准溶液。重10毫克氢氧化钙（Ca（OH）2），溶解在100ml的蒸馏水中。
- 在透明 96 井板中，管道 2 μL 的空白溶液（HCl，0.6 N）、标准溶液、每口井的样品（10 毫克/分升）和样品。在三重体中执行实验，以验证管道变异性。为每个条件添加 200 μL 的试剂。
注：超过15毫克/分升的样品应稀释1：1与盐水，重新检测，结果乘以2。 - 在室温下将反应孵化15分钟。
注：反应稳定60分钟。 - 在 650 nm 下读取并记录板的吸收度。使用以下公式计算样品中的钙含量：
钙 （mg/mL） = （标准样品/吸收的吸收） ×标准浓度
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Representative Results
由于木质主动脉瓣的直径通常为1毫米，因此必须集中至少三个阀门来收集一百万个可行的细胞，用于不同的实验程序。VIC 隔离过程的不同步骤显示在图1和图 2中。由于很难手动刮擦瓣膜组织，最好使用涡流产生的剪切应力来去除 VEC。事实上，CD31免疫荧光染色结果显示没有内皮细胞污染（图3D）。此外，小鼠VIC表达维他汀和α-SMA，这是阀门细胞的主要标记（图3B，C）。
细胞矿化 体外
使用钙试剂盒测量钙浓度：与未经治疗的细胞相比，用钙化介质治疗的细胞钙浓度更高（图4A）。钙的浓度随着蛋白质的总浓度而正常化。阿里扎林红色染色通过显示红色阳性钙节点（图4B）证实了钙试剂试剂盒的测量结果。
图1：瓣膜解剖描述（A ）解剖所需的所有手术器械的代表图像，剪刀2需要打开小鼠的皮肤，剪刀3打开胸部。需要 5 号和 6 号钳子来保持皮肤和打开胸部。（B） 从主动脉（黑色箭头）中留下3毫米的组织。（C） 用4号剪刀切开心室中间的心脏。（D） 用剪刀向主动脉瓣打开心脏 3.使用薄钳 7 和 8 仔细解剖主动脉瓣。阀门是可见的，并有一些黑点，是小鼠瓣膜组织（蓝色箭头）的特点。（E） 增加放大倍数，以更好地可视化主动脉瓣。用小剪刀隔离阀门4：（F） 用钳子7维持组织。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：小鼠瓣膜单元格隔离的代表性描述。 缩写： HEPES = 4-（2-羟基乙基）-1-管道拉齐尼乙硫酸;RT = 室温;DMEM = 杜尔贝科的改良鹰介质;FBS = 胎儿牛血清。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3： 鼠标瓣膜细胞表型。（A）新分离的瓣膜细胞的微观视图。免疫荧光染色显示（B） 维他汀阳性细胞和（C） α-SMA。细胞是阴性的（D） CD31 染色。秤杆 = 200 μm。缩写： DAPI = 4+， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 苯林多勒;CD31 = 差异化集群 31;α-SMA = 阿尔法平滑肌肉作用素。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：体外钙化检测（A）富含磷酸盐的钙化介质诱导VIC化体外化，用试剂盒测量。（B） 显示钙节点红色阳性染色（右）的显微图像。（C） 阿里扎林红色染色显示阳性钙结（黑箭头）的VIC响应钙化介质。秤杆 = 100 μm。缩写： CTL - = 控制;mVICs = 小鼠瓦尔维拉尔间歇细胞。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本文为原培养提供了鼠标瓣膜细胞隔离的详细方案。从8周大的小鼠的三个主动脉瓣被集中，以获得足够的细胞数量。此外，本协议描述了VIC表型的特征和体外矿化测定。该方法改编自马蒂厄等人先前描述的协议。
在主动脉瓣隔离期间，必须小心避免所有可能的传染源，以保护细胞免受细菌或支原体污染。事实上，在开始实验之前，对所有的手术工具进行高压灭菌是至关重要的。HEPES 溶液应辅以 1% 抗生素，以最大限度地减少细菌感染。此外，支原体可能导致细胞病理学，从而干扰细胞培养10中测量到的每一个参数。
将细胞电镀在培养介质体积较低的小培养皿中，对VIC的生长和增殖至关重要。让组织沉淀并粘附在细胞培养皿上，允许细胞从组织迁移到培养皿壁。鉴于幼鼠的分离细胞增殖速度更快，建议在培养5天后将细胞转移到75cm2的较大培养皿中。将细胞保持在80%的汇合度是关键，以尽量减少VIC的差异化为肌纤维细胞表型8。
如免疫荧光成像所示，分离的瓣膜细胞显示成纤维细胞状表型。VIC 具有拉长的细胞质，并表达维他汀和 αSMA，如先前研究所述。目前的工作证实，小鼠VIC表型类似于以前描述的猪VIC11和人类VIC12。大多数主动脉狭窄的体外研究是在8，11大动物的细胞上进行的。猪VIC的主要缺点是它们自发地分化到体外骨细胞表型，即使在正常介质13中。然而，鼠标VIC不会自发钙化，即使在较高的通道。
小鼠VIC与骨细胞表型不同，以响应使用抗坏死酸、胰岛素和磷酸盐刺激的钙化介质。本文描述了使用套件测量钙的定量方法和使用阿里扎林红色染色剂的定性方法。这两种方法都显示出钙化显著增加，以回应钙化中等处理。钙测量包是金标准方法，它提供了精确定量钙测量14。
在阿尔塞纳佐III试剂中，通过加入8-羟基线硫酸盐来防止镁干扰。钙与试剂发生反应，形成紫色复合物，吸收量为650纳米。颜色的强度与钙浓度成正比。阿尔塞纳佐-III试剂的准确性以前通过原子吸收光谱光谱法得到验证。临床实验室也采用同样的方法测量生物液体14中钙的总浓度。主动脉狭窄的钙化主要是羟基苯甲酸酯，如分散式X射线能量扫描电子显微镜分析7，12，15。事实上，重要的是要分析细胞膜的钙化，而不是释放钙，以更准确地模仿主动脉瓣组织的钙化。
小鼠是研究导致主动脉瓣钙化的分子机制的一个很好的VIC来源。但是，请记住， 体外 VIC 与活阀中的 VIC 并不相似。另一个限制是，需要3-5只小鼠的瓣膜池才能产生单细胞培养。游泳池应该来自垃圾老鼠， 以尽量减少变化。此外，实验应在三重进行，以确认所有发现。然而，在培养中使用整个主动脉瓣可以减轻这种限制。然而，这些 体外 研究必须在人体组织中得到验证，以加强研究结果。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
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