Summary
I denne artikel beskrives isoleringen af musaortaklappeceller ved hjælp af en totrins kollagenprocedure. Isolerede museventilceller er vigtige for at udføre forskellige assays, såsom denne in vitro-forkalkningsanalyse, og for at undersøge de molekylære veje, der fører til aortaklappens mineralisering.
Abstract
Forkalkningen af aortaklappen celler er kendetegnende for aorta stenose og er forbundet med ventil cusp fibrose. Valve interstitial celler (VICs) spiller en vigtig rolle i forkalkningsprocessen i aorta stenose gennem aktivering af deres dedifferentiation program til osteoblast-lignende celler. Mouse VICs er et godt in vitro-værktøj til belysning af de signalveje, der driver mineraliseringen af aortaklappen. Den metode, der er beskrevet heri, og som disse forfattere har anvendt med succes, forklarer, hvordan man får frisk isolerede celler. Der blev udført en totrins kollagenprocedure med 1 mg/mL og 4,5 mg/mL. Det første skridt er afgørende for at fjerne det endotelcellelag og undgå forurening. Den anden kollagen inkubation er at lette migrationen af VICs fra vævet til pladen. Derudover diskuteres en immunfluorescens farvningsprocedure for fænotypekarakterisering af de isolerede museventilceller. Desuden blev forkalkningsanalysen udført in vitro ved hjælp af calciumreagensmålingsproceduren og alizarin rød farvning. Brugen af museventilcelle primærkultur er afgørende for test af nye farmakologiske mål for at hæmme cellemineralisering in vitro.
Introduction
Forkalket aortaklappen sygdom (CAVD) er den mest udbredte valvular hjertesygdom i vestlige populationer, der påvirker næsten 2,5% af ældre personer over 65 år1. CAVD påvirker over seks millioner amerikanere og er forbundet med ændringer i de mekaniske egenskaber af foldere, der forringer normal blodgennemstrømning1,2. I øjeblikket er der ingen farmakologisk behandling for at stoppe sygdommens progression eller for at aktivere mineralregression. Den eneste effektive behandling til behandling af CAVD er udskiftning af aortaklappen ved operation eller transkatheter aortaklappenudskiftning3. Det er derfor bydende nødvendigt at undersøge de molekylære mekanismer, der fører til ventilmineralisering, for at identificere nye farmakologiske mål. Faktisk har ikke-behandlet aorta stenose flere negative konsekvenser såsom venstre ventrikel dysfunktion og hjertesvigt4.
Aortaklappen består af tre lag kendt som fibrosa, spongiosa og ventriker, der indeholder VIC'er som den fremherskende celletype5. Fibrosaen og ventrikierne er dækket af et lag vaskulære endotelceller (VEC)5. VEC'erne regulerer gennemtrængeligheden af inflammatoriske celler samt parakrinesignaler. Øget mekanisk stress kan påvirke VEC'ernes integritet og forstyrre aortaklappens homøostase, hvilket fører til inflammatorisk celleinvasion6. Scanning af elektronmikroskopianalyser viste forstyrret endotel i en forkalket aortaventil hos mennesker7.
Histologiske analyser af forkalket væv afslører tilstedeværelsen af osteoblaster og osteoklaster. Desuden blev der observeret osteogen differentiering af VIC'er både in vitro og i humant ventilvæv8. Denne proces er hovedsageligt orkestreret af Runt-relaterede transskription faktor 2 (Runx2) og knoglen morfogenetiske proteiner (BMPs)8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyreforsøg, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Icahn School of Medicine på Mount Sinai institutionelle kerne og brug udvalg.
1. Forberedelse før ventilcelleisolering fra voksne mus
- Rengør og steriliser alle de kirurgiske instrumenter, der er vist i figur 1A, ved at bruge 70% v/v ethanol og efterfølgende autoklavere dem i 30 minutter.
- Der tilsættes 500 μL penicillin-streptomycin til 50 ml 10 mm HEPES. Forbered en aliquot på 50 mL 1x fosfat-buffered saltvand (PBS). Hold opløsningerne på is.
- Forbered 1 mg/mL og 4,5 mg/mL kollagenopløsninger, og brug 5 ml af hver opløsning i 15 ml rør til at udføre hele proceduren. Tilberedning af 5 ml 1 mg/mL kollagen, bland 5 mg kollagen med 2,5 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM, føtalt kvægserum (FBS)-frit) og 2,5 ml 10 mM HEPES suppleret med antibiotika (1% penicillin-streptomycin fra trin 1.2). Opløsningerne filtreres gennem et 0,22 μm filter for at fjerne kontaminering.
BEMÆRK: Hold opløsningerne på is for at beskytte enzymerne. - DMEM-opløsningen opvarmes til 37 °C før brug i alle nedenstående trin. Forbered komplet medium ved at supplere DMEM med 1% penicillin-streptomycin, 1% natrium pyruvat, 5 ml 200 mM L-glutamin, 1 ml mycoplasma elimination reagens (se materialetabellen)og 10% FBS.
2. Isolering af ventilceller
- For at opnå 106 celler til forsøget skal du bruge fem 8 uger gamle mus (mindst tre). Placer musen i et induktionskammer sammen med et lille stykke silkepapir gennemblødt med 1 mL isoflurane, men tillad ikke kontakt med vævet. For at bekræfte, at dyret er fuldt bedøvet; check for tå knivspids refleks, og derefter aflive musen ved livmoderhalskræft dislokation. Brug isoflurane til at lindre eventuelle smerter forud for livmoderhalskræft dislokation som proceduren beskrevet nedenfor er terminal.
- Placer musen på en dissekeringsplatform, og fastgør poterne med kanyler for at holde den på plads. Rengør brystet og maven med ethanol; åbne maven og brystet med en saks. Med en lille kirurgisk saks skæres mellem venstre atrium og venstre hjertekammer for at exsanguinate musen. Perfuse hjertet med 10 mL kold 1x PBS at fjerne blod fra hjertet.
- Skær hjertet, og hold 3 mm fra den opstigende aorta som vist i figur 1B. Dissekere aortaklappen under et stereomikroskop. Skær hjertet vandret midt i hjertekamrene (Figur 1C). Skær venstre hjertekammer mod aorta, og forsigtigt dissekere aortaklappen(Figur 1D-F). Saml ventilerne sammen i en lille 35 mm vævskulturskål.
- De isolerede ventiler vaskes i en 75 mm cellekulturskål med 5 ml kold HEPES (10 mM) suppleret med antibiotika (1% penicillin-streptomycin) for at fjerne blod (Figur 2). Der fremstilles to 15 mL rør kollagen 1 mg/mL og 4,5 mg/mL som beskrevet ovenfor i trin 1.3.
BEMÆRK: Efter dissektionen manipuleres de isolerede ventiler i en steril biosikkerhedshætte for at minimere kontaminering. - Ventilerne inkuberes i kollagentype I (1 mg/mL) i 30 min ved 37 °C med kontinuerlig omrystning(figur 2). Centrifuge røret i 5 min ved 150 × g,vask pellet én gang med 2 mL HEPES (10 mM), og vortex for 30 s ved høj hastighed. Hæld indholdet af dette rør i en 35 mm kultur skål, og overfør forsigtigt vævsfragmenterne ved hjælp af tynde pincet i et nyt rør.
BEMÆRK: På nuværende tidspunkt er VIC'erne stadig ikke adskilt fra vævet, og pellet indeholder stykker væv. For at undgå kontaminering med endotelceller må der ikke centrifuges efter hvirveldannelse i trin 2.5. - Pelleten inkuberes i et 15 mL rør med 5 mL kollagen type I (4,5 mg/mL) ved 37 °C under kontinuerlig omrøring i 35 min. Cellerne suspenderes igen med en 1 mL pipette for at adskille cellerne og centrifuge ved 150 × g i 5 min ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, og pelletlen suspenderes igen i 2 mL komplet DMEM. Centrifuge ved 150 × g i 5 min ved 4 °C. Gentag dette trin to gange for at rense cellerne.
BEMÆRK: Pellet vil stadig have nogle væv fragmenter. - Ophæng pellet i 1 mL komplet medium, og plade cellerne i en brønd af en 6-brønd celle kultur parabol i et minimum af medium til at lette deres tilknytning til kultur parabol. Cellerne efterlades uforstyrret i en 37 °C inkubator med 5% kuldioxid.
- Efter 3 dage skal du kontrollere cellerne under mikroskopet for at kontrollere god vækst tæt på vævsresterne. Når 1.000 celler er synlige under mikroskopet, skal du forsigtigt fjerne vævsresterne med autoklaveret pincet og ændre mediet.
BEMÆRK: Pladen må ikke forstyrres. Hvis det krævede antal celler ikke overholdes, skal du placere cellekulturretten tilbage i inkubatoren i yderligere 2 dage. - Når cellerne er 70% sammenflydende (2,5 × 105), trypsinize og derefter overføre dem til en 75 mm vævskultur parabol.
3. Analyse af celleidentitet og morfologi
BEMÆRK: Immunfluorescens farvning blev brugt til at studere cellemorfologi og endotelcelleforurening.
- Rengør emhætten med 70% v/v/ ethanol. Placer sterile coverslips (22 mm x 22 mm) i 6-brønds plader.
BEMÆRK: For at sterilisere coverlips, vask dem med 70% ethanol, og hold dem i emhætten natten over under ultraviolet lys. - Frø 100.000 celler per brønd i en 6-brønd plade. Efter 24 timer vaskes cellerne to gange i 1x PBS og fastgør dem i 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min. Vask cellerne igen to gange med 1x PBS.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan cellerne opbevares i PBS ved 4 °C indtil farvningsprocedurens start. - For at kontrollere vic'ernes renhed skal du bruge alfa-glat muskelaktil (αSMA), vimentin og differentieringsklynge 31 (CD31) til at påvise kontaminering med VEC'er.
- Der fremstilles en aliquot af blokeringsbuffer ved at blande 500 μL normalt serum (samme art som det sekundære antistof), 9,5 mL 1x PBS og 30 μL Triton X-100. Inkuber cellerne i 2 mL af blokeringsbufferen i 1 time.
- Antistoffortyndingsbufferen, der indeholder 30 μL Triton X-100, 10 mL 1x PBS og 0,1 g bovin serumalbumin (BSA), fremstilles.
- Tag en tom spidskasse, fyld halvdelen af kassen med vand for at skabe et fugtigt kammer. Dæk tipholderen med et vådt væv og derefter med et ark parafilm.
- Der tages 1 μL af det primære antistof, og det blandes med 100 μL af fortyndingsbufferen, der fremstilles i trin 3.5. 50 μL af det fortyndede antistof anbringes på parafilmen. Tag coverlips fra brøndene, flip dem over, og læg dem på toppen af dråber af antistof; inkubere cellerne natten over med antistoffet.
- Der tilsættes 1 mL PBS i 6-brøndspladen. Tag forsigtigt coverlip fra parafilmen, vend den over, og læg den i brønden. Vask cellerne med en kontinuerlig blid omrøring i 5 min. Udskift PBS med frisk PBS; cellerne 3 gange.
- Inkuber cellerne med det fortyndede sekundære antistof (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) i 1 time. Der tilsættes 1 μL af det sekundære antistof til 500 μL af antistoffortyndingsbufferen (tilberedt i trin 3.5). Dæk pladen med aluminiumsfolie. Vask cellerne 3 gange med 1 mL 1x PBS med kontinuerlig omrøring.
- Monter coverslips med 50 μL af 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-montering medium, og observere cellerne under mikroskopet til at analysere morfologi af celler og VEC forurening.
4. Analyse af in vitro-forkalkning
- Emhætten rengøres med 70 % ethanol, DMEM-mediet opvarmes til 37 °C.
- Frø 100.000 celler/tilstand i 6-brønds plader i komplet DMEM, og kultur i 24 timer ved 37 °C.
- Forbered forkalkningsmediet ved at blande 2 mM NaH2PO4, 10-7 M insulin og 50 μg/mL ascorbinsyre i DMEM med 5% FBS. For 93 mL DMEM tilsættes 5 mL FBS, 1 mL antibiotika (endelig koncentration 1%), 1 mL natrium pyruvat (100 mM), 27,5 mg NaH2PO4, 5,8 μL insulin og 5 mg ascorbinsyre.
BEMÆRK: Opløsningen filtreres med et 0,22 μm filter før brug. - Efter 24 timer skal du erstatte det supernatantmedie med forkalkningsmediet. Cellerne inkuberes i 7 dage ved 37 °C. På 3rd dag, erstatte med frisk forkalkning medium, og læg pladen tilbage i inkubatoren for at fuldføre de 7 dages behandling.
- Efter 7 dage fjernes mediet og vaskes cellerne to gange med 2 mL 1x PBS. Cellerne inkuberes i 1 ml 0,6 N saltsyre (HCl) i 24 timer ved 37 °C. Saml HCl i et 1,5 mL rør, og fordampe det i en roterende fordamper. Indholdet af alle rørene i 60 μL HCl.
BEMÆRK: Tørringsproceduren er vigtig for at koncentrere opløsningen og have samme volumen for hver tilstand. - Brug en 96-brønds plade til at måle calciumkoncentrationen ved hjælp af Arsenazo III reagens, der fås i et brugsklart sæt (se materialeoversigten for yderligere oplysninger).
- Der fremstilles en calciumstandardopløsning på 10 mg/dL koncentration. Der afvejes 10 mg calciumhydroxid (Ca(OH)2)og opløses i 100 mL destilleret vand.
- I en klar 96 brøndplade pipetter 2 μL blindopløsning (HCl, 0,6 N), standardopløsningen, prøven pr. brønd (10 mg/dL) og prøverne. Udfør eksperimentet i tre eksemplarer for at kontrollere pipetternes variation. Der tilsættes 200 μL reagens for hver tilstand.
BEMÆRK: Prøver over 15 mg/dL fortyndes 1:1 med saltvand, analyseres igen, og resultatet multipliceres med to. - Inkubat reaktionen i 15 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Reaktionen er stabil i 60 min. - Aflæs og registrer pladens absorbans ved 650 nm. Brug følgende formel til at beregne mængden af calcium i prøverne:
Calcium (mg/mL) = (Absorbans af prøve/absorbans af standard) × Koncentration af standard
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Da murin aortaklappen typisk er 1 mm i diameter, skal mindst tre ventiler samles for at indsamle en million levedygtige celler til forskellige forsøgsprocedurer. De forskellige trin i VIC-isolationsprocessen er vist i figur 1 og figur 2. Da det er vanskeligt manuelt at skrabe ventilvævet, er det at foretrække at bruge forskydningsstress skabt ved hvirvelstrømning for at fjerne VEC'erne. Resultaterne af cd31-immunfluorescensdætningen viste faktisk, at der ikke var nogen endotelcellerforurening (figur 3D). Desuden udtrykker muse-VICs vimentin og α-SMA, som er de vigtigste markører for ventilceller (Figur 3B, C).
In vitro til mineralisering af celler
Der blev anvendt et calciumreagenssæt til måling af calciumkoncentrationen. celler, der behandles med forkalkningsmedium, har en højere calciumkoncentration sammenlignet med ikke-behandlede celler (figur 4A). Koncentrationen af calcium blev normaliseret med den samlede proteinkoncentration. Alizarin rød farvning bekræftede calcium-reagens kit målinger ved at vise røde positive calciumknuder (Figur 4B).
Figur 1: Beskrivelse af ventildissektion. (A) Repræsentativt billede af alle de kirurgiske instrumenter, der er nødvendige for dissektionen, saks 2 er nødvendig for at åbne musens hud og saks 3 for at åbne brystet. Pincet 5 og 6 er nødvendige for at holde huden og åbne brystet. (B) Lad 3 mm væv være fra aorta (sort pil). (C) Skær hjertet i midten af hjertekamrene med en saks nummer 4. (D) Åbn hjertet mod aortaklappen med saks 3. Brug den tynde pincet 7 og 8 til forsigtigt at dissekere aortaklappen. Ventilen er synlig og har nogle sorte prikker, der er karakteristiske for mus ventilvæv (blå pil). (E) Forøg forstørrelsen for bedre at visualisere aortaklappen. Isoler ventilen med den lille saks 4; (F)hold vævet med pincet 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentativ beskrivelse af isolering af museventilceller. Forkortelser: HEPES = 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre; RT = stuetemperatur; DMEM = Dulbeccos modificerede Eagle-medium; FBS = føtalt kvægserum. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:Museventilcellephoenotype. Mikroskopisk udsyn til (A) frisk isolerede ventilceller. Immunfluorescens farvning viser (B) vimentin-positive celler og (C) α-SMA. Cellerne er negative for (D) CD31-farvning. Skalastænger = 200 μm. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; CD31 = differentieringsklynge 31; α-SMA = alfa-glat muskel actin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: In vitro-forkalkningsanalyse (A) Fosfatrigt forkalkningsmedium fremkaldt VIC-forkalkning in vitro, som blev målt med et reagenssæt. (B) Mikroskopisk billede, der viser rød positiv farvning (højre) for calciumknuder. (C) Alizarin rød farvning viste positive calciumknuder (sort pil) af VIC'er som reaktion på forkalkningsmedium. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: CTL- = Kontrol; mVICs = valvular interstitielle celler med mus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol over museventilcelleisolering til primær kultur. Tre aortaklapper fra 8 uger gamle mus blev samlet for at opnå et tilstrækkeligt antal celler. Derudover beskriver denne protokol karakteriseringen af VIC-fænotype og in vitro mineraliseringsanalysen. Metoden blev tilpasset fra den tidligere beskrevne protokol fra Mathieu et al.7.
Under isolering af aortaklapper skal man sørge for at undgå alle kilder til mulig smitte for at beskytte cellerne mod bakteriel eller mycoplasmaforurening. Faktisk er det afgørende at autoklave alle de kirurgiske værktøjer, før du starter eksperimenterne. HEPES-opløsningen bør suppleres med 1% antibiotika for at minimere bakteriel infektion. Desuden kan mycoplasma forårsage cytopatologi og dermed forstyrre hver parameter målt i cellekultur10.
Plating celler i små kultur retter med lavere volumen af kultur medium er afgørende for VIC vækst og spredning. At lade vævet afregne og klæbe til cellekulturretten tillader cellemigration fra vævet til skålvæggen. I betragtning af at isolerede celler fra unge mus formerer sig hurtigere, anbefales det at overføre celler til en større kulturret på 75 cm2 efter 5 dages kultur. Vedligeholdelse af celler til 80% sammenløb er afgørende for at minimere differentieringen af VICs til en myofibroblast phenotype8.
Som det fremgår af immunfluorescens imaging, de isolerede ventilceller viser en fibroblast-lignende fænotype. VIC'er har et langstrakt cytoplasma og udtrykker både vimentin og αSMA som beskrevet i tidligere undersøgelser. Nærværende arbejde bekræftede, at musen VIC fænotype svarer til den, der tidligere er beskrevet for svin VICs11 og humane VICs12. De fleste in vitro-undersøgelser af aorta stenose udføres på celler fra store dyr8,11. Den største ulempe ved porcin VICs er deres spontane differentiering til en osteoblast fænotype in vitro selv i normale medier13. Mus VICs ikke forkalker spontant selv ved højere passager.
Mouse VICs differentierer sig til osteoblastphoenotypen som reaktion på forkalkningsmediet ved hjælp af ascorbinsyre, insulin og fosfatstimulering. Denne artikel beskriver en kvantitativ metode til calciummåling ved hjælp af et sæt og en kvalitativ metode ved hjælp af Alizarin rød farvning. Begge metoder viste en betydelig stigning i forkalkningen som reaktion på forkalkning medium behandling. Calciummålesættet er guldstandardmetoden, som tilbyder en nøjagtig kvantitativ calciummåling14.
I Arsenazo III reagens forhindres magnesiuminterferens ved medtagelse af 8-hydroxyquinolinsulfonat. Calcium reagerer med reagenset for at danne et lilla-farvet kompleks, som absorberer ved 650 nm. Farvens intensitet er proportional med calciumkoncentrationen. Nøjagtigheden af Arsenazo-III reagenset blev tidligere valideret med atomabsorptionsspektrofotometri. Samme metode anvendes i kliniske laboratorier til måling af den samlede calciumkoncentration i biologiske væsker14. Forkalkningen i aorta stenose er hovedsagelig hydroxyapatit, som vist med dispergende røntgenenergiscanning elektronmikroskopianalyse7,12,15. Faktisk er det vigtigt at analysere forkalkningen af cellemembranen i stedet for gratis calcium for mere præcist at efterligne forkalkningen af aortaklappen væv.
Mus udgør en god kilde til VICs til undersøgelse af molekylære mekanismer, der fører til aortaklappen forkalkning. Husk dog, at VIC'er in vitro ikke ligner VIC'er i levende ventiler. En anden begrænsning er det faktum, at en pulje af ventiler fra 3-5 mus er nødvendig for at lave en enkelt cellekultur. Puljen skal være fra littermate mus for at minimere variationer. Desuden bør forsøg udføres i tre eksemplarer for at bekræfte alle fund. Brugen af hele aortaklappen i kulturen kan dog afhjælpe denne begrænsning. Ikke desto mindre skal disse in vitro-undersøgelser valideres i humant væv for at styrke resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C.
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P.
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
