Summary
يمكن لبروتين الأجسام المضادة المؤتلف المعبر عنه في خلايا pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO والأجسام المضادة وحيدة النسيلة المنتجة باستخدام تقنية الورم الهجين التقليدية التعرف على بروتين أمينوببتيداز N (APN) الخنازير والارتباط به.
Abstract
يمكن ل Porcine aminopeptidase N (APN) ، وهو ميتالوببتيداز مرتبط بالغشاء موجود بكثرة في الغشاء المخاطي في الأمعاء الدقيقة ، أن يبدأ استجابة مناعية مخاطية دون أي تدخل مثل انخفاض تعبير البروتين أو عدم نشاط الإنزيم أو التغيرات الهيكلية. هذا يجعل APN مرشحا جذابا في تطوير اللقاحات التي تستهدف بشكل انتقائي ظهارة الغشاء المخاطي. أظهرت الدراسات السابقة أن APN هو بروتين مستقبلات لكل من الإشريكية القولونية المعوية (E. coli) F4 وفيروس التهاب المعدة والأمعاء القابل للانتقال. وبالتالي ، فإن APN تبشر بالخير في تطوير اتحادات الأدوية والأجسام المضادة أو اللقاحات الجديدة القائمة على الأجسام المضادة الخاصة ب APN. في هذه الدراسة ، قارنا إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة ب APN (mAbs) باستخدام تقنية الورم الهجين التقليدية وطريقة التعبير عن الأجسام المضادة المؤتلفة. أنشأنا أيضا خط خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) المنقول بشكل ثابت باستخدام pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN وسلالة تعبير الإشريكية القولونية BL21 (DE3) التي تؤوي ناقل pET28a (+) -rAbs-APN. تظهر النتائج أن الأجسام المضادة المعبر عنها في خلايا pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO و mAbs المنتجة باستخدام الأورام الهجينة يمكن أن تتعرف على بروتين APN وترتبط به. وهذا يوفر الأساس لمزيد من التوضيح لوظيفة مستقبلات APN لتطوير العلاجات التي تستهدف مختلف الحواتم الخاصة ب APN.
Introduction
يعمل Aminopeptidase N (APN) ، وهو إنزيم يعمل في ضوء القمر ينتمي إلى عائلة ميتالوبروتيناز M1 ، كعلامة للورم ومستقبلات وجزيء إشارة عبر مسارات تعتمد على الإنزيم ومستقلة عن الإنزيم 1,2. بالإضافة إلى شق بقايا الأحماض الأمينية N-terminal لمختلف الببتيدات النشطة بيولوجيا لتنظيم نشاطها البيولوجي ، يلعب APN دورا مهما في التسبب في الأمراض الالتهابية المختلفة. تشارك APN في معالجة المستضد وعرضه بواسطة الببتيدات المشذبة التي ترتبط بإحكام بجزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسية من الفئةالثانية 2,3. يمارس APN أيضا تأثيرات مضادة للالتهابات عن طريق الارتباط بمستقبلات البروتين G المقترنة المشاركة في نقل الإشارات المتعددة ، وتعديل إفراز السيتوكين ، والمساهمة في البلعمة بوساطة مستقبلات جاما Fc في الاستجابة المناعية4،5،6،7.
باعتباره exopeptidase المرتبط بالغشاء الموزع على نطاق واسع ، فإن APN وفير في الغشاء المخاطي المعوي الصغير الخنازير ويرتبط ارتباطا وثيقا ب endocytosis بوساطة المستقبلات1،5،8. يتعرف APN على البروتين الشوكي لفيروس التهاب المعدة والأمعاء القابل للانتقال ويربطه لدخول الخلايا ، ويتفاعل مباشرة مع الوحدة الفرعية FaeG من الإشريكية القولونية المعوية F4 fimbriae للتأثير على الالتصاق البكتيري بالخلايا المضيفة9،10،11. وبالتالي ، فإن APN هو هدف علاجي محتمل في علاج الأمراض المعدية الفيروسية والبكتيرية.
منذ تطوير تقنية الورم الهجين والاستراتيجيات الأخرى لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) في عام 1975 ، تم استخدام mAbs على نطاق واسع في العلاج المناعي وتوصيل الأدوية والتشخيص12،13،14. حاليا ، يتم استخدام mAbs بنجاح لعلاج الأمراض ، مثل السرطان ومرض التهاب الأمعاء والتصلب المتعدد12,15. نظرا لتقاربها القوي وخصوصيتها ، يمكن أن تكون mAbs أهدافا مثالية في تطوير اتحادات الأدوية والأجسام المضادة (ADC) أو اللقاحات الجديدة16,17. يعد بروتين APN أمرا بالغ الأهمية لتوصيل المستضدات بشكل انتقائي إلى خلايا معينة ، ويمكن أن يثير استجابة مناعية مخاطية محددة وقوية ضد مسببات الأمراض دون أي تدخل بما في ذلك التعبير المنخفض للبروتين أو عدم نشاط الإنزيم أو التغيرات الهيكلية5،8،18. لذلك ، فإن المنتجات العلاجية القائمة على mAbs الخاصة ب APN تبشر بالخير ضد الالتهابات البكتيرية والفيروسية. في هذه الدراسة ، نصف إنتاج mAbs الخاصة ب APN باستخدام تقنية الورم الهجين ، والتعبير عن الأجسام المضادة المؤتلفة المضادة ل APN (rAbs) باستخدام نواقل بدائية النواة وحقيقية النواة. تشير النتيجة إلى أنه تم التعرف على بروتين APN من قبل كل من rAbs المعبر عنه في خلايا pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO و mAbs المشتقة من الورم الهجين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة يانغتشو (SYXK20200041).
1. تحضير مستضد بروتين APN الخنازير
ملاحظة: تم بناء سلالة pET28a (+) -APN-BL21 (DE3) والخلايا المعبر عنها بثبات APN pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 في دراسة سابقة11.
- استرجع البكتيريا من مخزون الجلسرين المجمد وخط على ألواح Luria-Bertani (LB) التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين (كم +) لعزل مستعمرة واحدة.
- اختر مستعمرة واحدة من الصفيحة المخططة حديثا ، واستزراع 4 مل من وسط LB (10 جم / لتر تريبتون ، 10 جم / لتر كلوريد الصوديوم (NaCl) و 5 جم / لتر من خلاصة الخميرة ، درجة الحموضة 7.2) مكملة ب KM + (50 ميكروغرام / مل) ، واتركها تنمو طوال الليل (12-16 ساعة) مع التقليب (178 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية.
- تمييع البكتيريا المحضرة في 1: 100 في مرق Km+ LB الطازج وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 2-3 ساعات حتى يصل OD600 إلى 0.4-0.6.
- أضف الأيزوبروبيل β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى الوسط إلى تركيز نهائي قدره 0.4 mM ، واحتضان المستنبتات لمدة 10 ساعات إضافية عند 16 درجة مئوية.
- وبالتالي ، أجهزة الطرد المركزي وحصاد البكتيريا باستخدام تحريض IPTG (10000 × جم ، 4 درجات مئوية 15 دقيقة).
- أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت LEW (التحلل / التوازن / الغسيل) (50 mM فوسفات الصوديوم اللامائي أحادي القاعدة (NaH2PO4) و 300 mM NaCl ، درجة الحموضة 8.0) التي تحتوي على 1 مجم / مل ليزوزيم. حرك المعلق البكتيري لمدة 30 دقيقة على الثلج وصوتنيكات تماما (15 ثانية نبضة و 20 ثانية ، 15 دقيقة) باستخدام الخالط بالموجات فوق الصوتية.
- أجهزة الطرد المركزي تتحلل الخلية الخام عند 4 درجات مئوية و 10000 × جم لمدة 30 دقيقة لإزالة الحطام الخلوي. نقل طافت في عمود متوازن مسبقا واحتضان 1-2 دقيقة قبل تصريف الجاذبية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- اغسل العمود باستخدام 20 مل من المخزن المؤقت LEW وصفيه باستخدام الجاذبية. تخلص من بروتين APN الموسوم بالهيستيدين باستخدام 9 مل من محلول الشطف (50 mM NaH2PO4 و 300 mM NaCl و 250 mM imidazole ، درجة الحموضة 8.0) واجمعها في أنابيب غسيل الكلى.
- قم بغسيل محلول البروتين طوال الليل عند 4 درجات مئوية في كربونات الصوديوم وبيكربونات الصوديوم (PBS ، 135 mM NaCl ، 4.7 mM كلوريد البوتاسيوم ، 2 mM NaH 2 PO4 ، و 10 mM dodecahydrate sodium phosphate dibasic ، pH7.2) buffer.
- قم بالتحليل باستخدام جل SDS-PAGE بنسبة 12.0٪ ونشاف غربي لتقييم نقاء بروتين APN.
- قم بتحميل 5 ميكروغرام من البروتين في كل بئر من الجل واتركه يعمل عند 110 فولت لمدة 1.5 ساعة. بعد ذلك ، انقل البروتين إلى غشاء PVDF لمدة 50 دقيقة عند 15 فولت. حدد تركيز البروتين المنقى باستخدام مقايسة BCA.
2. تحصين الحيوانات
- تحت الجلد (s.c) حقن الفئران الإناث BALB / c ، 6-8 أسابيع من العمر ، مع 50 ميكروغرام من بروتين APN أو PBS (السيطرة السلبية) مختلطة مع المواد المساعدة مرة واحدة كل 2 أسابيع. استخدم مساعد فرويند الكامل الذي يحتوي على المتفطرات المقتولة بالحرارة للتحصين الأولي ، ومساعد فرويند غير المكتمل للتطعيمات المعززة. امزج كميات متساوية من بروتين APN (أو PBS) ومساعد فرويند أو مساعد فرويند غير المكتمل ، على التوالي.
- الكشف عن عيار الأجسام المضادة ضد APN في أمصال هذه الفئران عن طريق مقايسة الممتز المناعي غير المباشر المرتبط بالإنزيم (ELISA) باستخدام صفيحة عيار ميكروي مغلفة ببروتين APN 5 ميكروغرام / مل مخفف في 0.05 M PBS (درجة الحموضة 9.6). .
3. تقنية الورم الهجين لإنتاج أجسام مضادة وحيدة النسيلة ضد APN
- داخل الصفاق (i.p.) حقن 100 ميكروغرام من بروتين APN في الفئران المختارة لتعزيز المستضد النهائي.
- بعد ثلاثة أيام ، القتل الرحيم للفئران باستخدام صوديوم بنتوباربيتال (50 مجم / كجم ، v / v ، داخل الصفاق) وخلع عنق الرحم.
- جمع الطحال ، وغسل مع DMEM مرتين لإزالة الدم والخلايا الدهنية. قم بتصفية تعليق خلايا الطحال باستخدام شبكة نحاسية مكونة من 200 شبكة لإزالة حطام الأنسجة ، وحصاد خلايا الطحال باستخدام الطرد المركزي (1500 × جم ، 10 دقائق) لإزالة غشاء الطحال.
- خلايا المايلوما الفأرية البذور SP2 / 0 في قارورة 25 سم 2 تحتوي على 5 مل من DMEM تستكمل مع 6٪ مصل بقري جنيني (FBS) وثقافة عند 37 درجة مئوية ، 6٪ جوCO 2 للحفاظ على صلاحية الخلية. بعد 5-6 أيام من المزرعة ، تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪ بعد الإنعاش وهي في مرحلة سجل النمو. تحت المجهر ، تكون الخلايا مستديرة ومشرقة وواضحة.
- قبل يوم واحد من التهجين ، اجمع البلاعم من التجاويف البريتونية للفئران وفقا لطريقة منشورة مسبقا12,19.
- البلاعم البريتونية للبذور بكثافة 0.1-0.2 × 105 / مل في 96 صفيحة بئر ، كل بئر يحتوي على 100 ميكرولتر من وسط HAT (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1x HAT Supplement) ، وتحضن عند 37 درجة مئوية ، 6٪ CO2 جو مرطب طوال الليل.
- للتهجين ، قم بشفط خلايا SP2 / 0 برفق باستخدام ماصة من 8-10 زجاجات ، وقم بتعليقها في 10 مل من وسط DMEM الخالي من المصل. اغسل الخلايا باستخدام DMEM الطازج ، وأجهزة الطرد المركزي (1500 × جم ، 10 دقائق) مرتين ، ثم أعد تعليقها في 10 مل من DMEM.
- امزج خلايا الطحال الكمية مع خلايا SP2 / 0 بنسبة 10: 1 وانقلها إلى أنابيب سعة 50 مل. أجهزة الطرد المركزي (1500 × جم ، 10 دقائق) وتخلص من المادة الطافية. اجمع كريات الخلايا في الجزء السفلي من الأنابيب واضغط براحة اليد لفك الكريات قبل التهجين.
- أضف 1 مل من البولي إيثيلين جلايكول 1500 (PEG 1500) ، مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، بالتنقيط باستخدام قطارة إلى حبيبات الخلية المفكوكة على مدار فترة زمنية تبلغ 45 ثانية أثناء تدوير قاع الأنبوب برفق.
- أضف ببطء 1 مل من DMEM المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية إلى الخليط أعلاه على مدار 90 ثانية ، متبوعا ب 30 مل أخرى من DMEM الطازج. ضع أنبوب الانصهار في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بعد الحضانة في الحمام الدافئ ، قم بحصاد الخلايا وإعادة تعليقها في وسط HAT. ثم الثقافة في صفيحة 96 بئرا ملقحة بالبلاعم البريتونية.
- بعد خمسة أيام ، أضف 100 ميكرولتر من وسط HAT الطازج إلى كل بئر ، واحتضن اللوحة لمدة 5 أيام إضافية ، وبعد ذلك استبدل الوسط بوسط HT (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1x HT Supplement).
- استخدم صفيحة عيار دقيقة مغلفة ببروتين APN 5 ميكروغرام / مل مخفف في 0.05 M PBS (درجة الحموضة 9.6) لتحليل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في طافية الورم الهجين باستخدام مقايسة ELISA.
- عندما يتحول الوسط الموجود في آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى اللون الأصفر (بسبب نمو الخلايا وإطلاق المستقلب ، ينخفض الرقم الهيدروجيني في الوسط إلى 6.8 ، ويتحول الفينول الأحمر من الفوشيه إلى الأصفر) أو تلاحظ مجموعات الخلايا ، احصل على 100 ميكرولتر طاف من الآبار المختارة وأضفها إلى آبار صفيحة ELISA المطلية. استخدم قارئ الصفائح الدقيقة لقياس قيم OD450.
- استخدم الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد APN ومصل الفأر غير المصاب كعنصر تحكم إيجابي وسلبي ، على التوالي ، واستخدم PBS كعنصر تحكم فارغ. في هذه الدراسة ، تم التعرف على نسبة OD450 للعينة إلى التحكم السلبي (P / N) ≥ 2.1 كمعيار اختيار إيجابي.
- بعد ثلاث جولات اختيار إيجابية متتالية ، حدد الورم الهجين الذي يظهر استجابة مصلية متزايدة ضد بروتين APN لمقايسة تخفيف محدودة.
- تحضير الضامة البريتونية والبذور في 96 لوحة بئر كما هو موضح سابقا.
- تعليق خلايا الورم الهجين في وسط HT بمعدل 0.5-2 خلية لكل بئر وزراعةفي حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 6٪. كرر هذه الخطوة ثلاث أو أربع مرات حتى يصل المعدل الإيجابي المشار إليه بواسطة المقايسة المناعية ELISA إلى 100٪.
- تحت ضغط التجميد والذوبان المستمر ، حدد خلايا الورم الهجين الإيجابية القادرة على إفراز الأجسام المضادة المضادة ل APN بثبات والتكاثر بشكل طبيعي.
- تطبيق حقنة واحدة بحجم 0.3 مل من البريستان لكل فأر (8-10 أسابيع). في 10 أيام بعد تلقي البكر ، حقن كل فأر مع 2-5 × 10 5 خلايا الورم الهجين في0.5 مل من PBS (درجة الحموضة 7.2).
- جمع بعناية السائل البريتوني من التجويف البريتوني لهذه الفئران بعد 8 إلى 10 أيام من الحقن.
- حصاد المواد الطافية عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 15 دقيقة ، وتنقية الأجسام المضادة في المواد الطافية باستخدام 33٪ كبريتات الأمونيوم المشبعة [(NH 4) 2SO4] الترسيب وبروتين أغاروز.
4. توصيف mAbs مقابل بروتين APN
- تحديد النوع الفرعي للغلوبولين المناعي ل mAbs التي تم جمعها باستخدام نظام التنميط الاستنسيلي SBA-HRP20. استخدم SDS-PAGE والنشاف الغربي لتقييم نقاء mAb ونوعيته.
- تحليل خصوصية mAb epitope مقابل بروتين APN باستخدام ELISA21. قيمة الإضافة (AV) هي نسبة OD mAbs (a + b) إلى (OD mAbs-a + OD mAbs-b) ، والتي تستخدم لتقييم ما إذا كانتmAbs تتعرف على نفس موقع المستضد. يمثل OD mAbs-a و OD mAbs-b قيم OD450 لمختلف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد APN وحده ، ويمثل OD mAbs(a + b) قيم OD450 لمزيج 1: 1 من اثنين منmAbs ضد APN.
- قم بتقييم كل عينة على الأقل أربع نسخ مكررة ، وكرر التجربة بأكملها ثلاث مرات على الأقل.
5. التعبير عن rAbs ضد APN
- استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من خلايا الورم الهجين المذكورة أعلاه والطحال من الفئران المحصنة ضد APN (على سبيل المثال ، TRIzol) 22. توليف الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة تخليق cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تضخيم المناطق المتغيرة من mAbs باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل وتحديد تسلسل السلسلة الثقيلة (VH) والسلسلة الخفيفة (VL) باستخدام التسلسل. تحليل الجينات التي تشفر VH و VL باستخدام أداة تحليل جينوم الماوس IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- اجمع بين جينات VH و VL مع التسلسلات الرائدة واستنساخها بالتتابع في متجهات pET28a (+) و pIRES2-ZsGreen1 ، على التوالي ، باستخدام تقنية الاستنساخ السلس للسماح بإدخال جزء الحمض النووي بدون ندبات. يتم سرد الاشعال المحددة في الجدول 1.
- تنمو البكتيريا المحولة pET28a (+) -rAbs-APN-BL21 في وجود 0.4 mM IPTG في الهزازات المدارية عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات. ثم حث وتنقية وتقييم للتعبير عن بروتين rAbs باستخدام تنقية البروتين الروتينية.
- بذرة 100 ميكرولتر 0.5 × 105 خلايا CHO لكل بئر في صفيحة 96 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 6٪ لمدة 18-24 ساعة. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80-90٪ ، قم بتخفيف بلازميد pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN مع Opti-MEM إلى تركيز نهائي قدره 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر ، واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامه للنقل.
- امزج بلطف 50 ميكرولتر من بلازميد pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN المخفف مع 1 ميكرولتر من ليبوفيكتامين 2000 و 49 ميكرولتر من Opti-MEM ، واحتضن الخليط لمدة 20 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. أضف 100 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا تحتوي على خلايا CHO واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 6٪ لمدة 4-6 ساعات.
- في 4-6 ساعات بعد النقل ، استبدل الوسط بوسط DMEM-F12 المكمل ب 10٪ FBS ، واحتضان اللوحة لمدة 48 ساعة أخرى. ثم أضف 400 ميكروغرام / مل G418 إلى كل بئر لتحديد الخلايا المنقولة بثبات.
- بعد 10 أيام من الاختيار باستخدام وسيط DMEM-F12 المكمل ب 10٪ FBS و 400 ميكروغرام / مل G418 ، قم بفرز الخلايا (3.0 × 107 خلايا / مل) عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. ما يقرب من 10-15 ٪ من سكان الخلايا كانت إيجابية.
- الخلايا الإيجابية المحصودة المخففة بشكل متسلسل ، والبذور بمعدل 0.5-2 خلية لكل بئر في صفيحة 96 بئرا ، والاستزراعفي حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 6٪. حافظ على خلايا pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO المنقولة بثبات باستخدام الانتقاء مع G418 (200 ميكروغرام / مل).
- ينخفض تركيز FBS في وسط زراعة الخلايا الموصوف أعلاه تدريجيا من 10٪ إلى 0٪ خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي خلال فترة زمنية مدتها 3 أسابيع. بعد ذلك ، قم بتكييف خلايا CHO الملتصقة لتعليق النمو في وسط خال من المصل.
- استزراع خلايا pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO البذرة في مرحلة النمو اللوغاريتمي في وسط خال من المصل بكثافة 0.8-1.0 × 105 خلايا / مل في قوارير اهتزاز بسرعة اهتزاز 80-110 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية ، 6٪ CO2.
- اجمع معلق الخلية كل 12 ساعة لتحديد التغييرات في صلاحية الخلية وحيويتها باستخدام مجموعة عد الخلايا (على سبيل المثال ، CCK-8) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- يصل تعبير الأجسام المضادة إلى مستويات الذروة عندما تنخفض صلاحية الخلية إلى 80٪ وتصل كثافة الخلية إلى 1.0-2.0 × 106 خلايا / مل. طافات خلايا الحصاد باستخدام الطرد المركزي ، والتصفية باستخدام مرشح غشاء متعدد تترافلورو إيثيلين 0.22 ميكرومتر ، والتنقية باستخدام بروتين أغاروز.
- تأكيد إنتاج الأجسام المضادة الخاصة ب APN باستخدام مقايسات التألق المناعي غير المباشر (IFA).
- حدد عيار الأجسام المضادة وتقارب الارتباط باستخدام مقايسة ELISA كما هو موضح سابقا. 23 احسب ثابت تفكك التوازن (قيمة KD ) للأجسام المضادة باستخدام معادلة لوجستية رباعية المعلمات باستخدام البرنامج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة ، تم استخدام بروتين APN المنقى القابل للذوبان (2.12 مجم / مل) لتحصين الفئران. أظهرت الفئران المحصنة ببروتين APN أربع مرات كل 14 يوما عيار أجسام مضادة أعلى ضد APN في أمصالها. على الرغم من الحصول على 14 ورم هجين باستخدام تجارب الاندماج ، إلا أن 9 أورام هجينة فقط نجت من دورات التجميد والذوبان المستمرة الثلاث ، مما أدى إلى 9 استنساخ مستقر يفرز أجساما مضادة ضد APN. كل هذه الخلايا مستديرة ومشرقة وواضحة (الشكل 1). تم تأكيد mAbs المنقى الذي يمتلك سلاسل ثقيلة وخفيفة (50 كيلو دالتون و 25 كيلو دالتون ، على التوالي) بواسطة SDS-PAGE ووجد في الاستسقاء المنقى (الشكل 2). يبين الجدول 2 عيار هذه mAbs المضادة ل APN في طافات الاستزراع والاستسقاء.
كشفت نتيجة التنميط المتماثل mAbs للفأر أن mAbs المشتقة من الحيوانات المستنسخة 5B31 و 5B36 و 3C48 و 5C51 و 6C56 تمتلك فئات فرعية من IgG2b ، بينما كان APN-2A20 جسما مضادا من نوع IgG2a κappa- (κ) ، و mAbs APN-3FD9 و -3F10 و -10F3 ينتمي إلى نوع IgM ويعالج سلاسل ضوئية κ (الجدول 3). كما هو موضح في الجدول 4 ، أظهرت معظم هذه mAbs قيم AV تزيد عن 50٪ ، مما يشير إلى أنها استهدفت حوامل مختلفة في APN ، بينما تعرف الجسم المضاد APN-5C51 على حوامل مستضدية مماثلة لتلك التي تعرفها APN-3C48 و -5B31 و -6C56 mAbs.
أظهر APN-5B36 عيار أجسام مضادة أعلى بكثير مقارنة بتلك الموجودة في mAbs الأخرى. لذلك ، تم تضخيم جين APN-5B36 VH-VL وربطه في ناقل pET28a (+) أو pIRES2-ZsGreen1 لبناء بلازميدات التعبير المؤتلف pET28a (+) -rAbs-APN و pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN ، على التوالي (الشكل 3). تم تنقية وتحليل الأجسام المضادة التي تم التعبير عنها بواسطة كل من خلايا pET28a (+) -rAbs-APN-BL21 (DE3) و pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO باستخدام مقايسات ELISA و IFA. ومع ذلك ، كما هو موضح في الشكل 4 ، فإن الجسم المضاد المعبر عنه في طاف خلايا pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO هو الوحيد الذي تعرف على بروتين APN ، كما فعل mAbs المشتق من الورم الهجين. يتكون هذا الجسم المضاد المؤتلف من سلاسل IgG2b الثقيلة وسلاسل لامدا الخفيفة ، وأظهر عيار 2.56 × 105 كما هو محدد باستخدام ELISA. وصل ارتباط APN-5B36 mAbs ببروتينات APN إلى توازن أبكر من rAbs (الشكل 5) ، حيث أظهر قيمة KD (4.232±0.475) × 10-9 و (2.201±0.367) × 10-8 مول / لتر ، على التوالي.
| التمهيدي | التسلسل (5'-3') | ||
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG | ||
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGAGGGGGGGGGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
الجدول 1. الاشعال المحددة المستخدمة في هذه الدراسة.
| خلايا | عيار الطافات (U / مل) | عيار الاستسقاء (U / مل) |
| 2أ 20 | 0.64×104 | 3.20×105 |
| 5ب 31 | 1.28×104 | 1.60×105 |
| 5ب 36 | 0.64×104 | 1.28×106 |
| 3C48 | 0.16×104 | 0.80×105 |
| 5ج51 | 0.16×104 | 0.80×104 |
| 6ج56 | 0.80×103 | 0.80×104 |
| 3FD9 | 0.80×103 | 0.80×104 |
| 3F10 | 0.16×104 | 0.16×105 |
| 10F3 | 0.80×103 | 0.32×105 |
الجدول 2. عيار ELISA من APN mAbs.
| إيغ | إيغا أ | الغلوبولين | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | كابا | امدا | ملخص | |
| 2أ 20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a ، كابا |
| 5ب 31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b ، لامدا |
| 5ب 36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b ، لامدا |
| 3C48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b ، لامدا |
| 5ج51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b ، لامدا |
| 6ج56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b ، لامدا |
| 3FD9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM ، كابا |
| 3F10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM ، كابا |
| 10F3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM ، كابا |
الجدول 3. الأنماط المتماثلة ل APN mAbs المشتقة من الورم الهجين.
| mAbs | AV (100 ٪) | ||||||||
| 2أ 20 | 5ب 31 | 5ب 36 | 3C48 | 5ج51 | 6ج56 | 3FD9 | 3F10 | 10F3 | |
| 2أ 20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5ب 31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5ب 36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3C48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5ج51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6ج56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3FD9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3F10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10F3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
الجدول 4. التمييز بين خصوصية المستضد-الخاتمة ل mAbs الخاصة ب APN. تشير قيم AV الأكبر من 0.5 إلى أن هذين mAbs يتعرفان على مواقع مستضدات مختلفة. تشير قيم AV الأقل من 0.5 إلى أن هذين mAbs يتعرفان على موقع مستضد مماثل.
الشكل 1. صورة من الأورام الهجينة. تحت التحليل المجهري ، تكون الأورام الهجينة مستديرة ومشرقة وواضحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تم تحليل مستويات تعبير الأجسام المضادة المؤتلفة والاستسقاء باستخدام SDS-PAGE. (أ) لين م، علامة البروتين؛ الحارة 1 ، تنقية pET28a (+) -rAbs-APN-BL21 (DE3) محللة ؛ الحارة 2 ، pET28a (+) -rAbs-APN-BL21 (DE3) طاف ؛ حارة 3 ، استسقاء السائل المنقى بنسبة 33 ٪ (NH 4) 2SO4 هطول الأمطار. (ب) لين م، علامة البروتين؛ حارة 1 ، استسقاء السائل المنقى باستخدام البروتين A agarose. في هذا الفحص ، تم تحميل 3-5 ميكروغرام من البروتين الكلي في كل حارة من الهلام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. بلازميدات التعبير المؤتلف pET28a (+) -rAbs-APN و pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN تم تحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز. لين M ، ترانس 2K بالإضافة إلى علامة الحمض النووي ؛ حارة 1 ، pET28a (+) متجه (5369 نقطة أساس) ؛ الحارة 2 و 5 ، جين VH-VL جنبا إلى جنب مع تسلسل زعيم APN-5B36 ؛ حارة 3 ، pET28a (+) -rAbs-APN البلازميد معبرا عنه في BL21 (DE3) E. coli ؛ حارة 4 ، ناقل pIRES2-ZsGreen1 (5283 نقطة أساس) ؛ حارة 6 ، pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN البلازميد معبرا عنه في DH5α E. القولونية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. التعبير عن بروتين الأجسام المضادة المؤتلف والاستسقاء الذي تم تحليله باستخدام التألق المناعي غير المباشر. عولجت خلايا pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 (مضان أخضر) تعبر بثبات عن APN ب (A) PBS ، تستخدم كعلاج تحكم. (ب) البروتين المنقى المعبر عنه بواسطة pET28a (+) -rAbs-APN-BL21 (DE3) ؛ (ج) الأجسام المضادة متعددة النسيلة APN (1:500)؛ د: سائل الاستسقاء المنقى (1: 500)؛ E) طافية منقاة تم الحصول عليها من خلايا pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO (1: 500). تم استخدام DAPI كمضاد نووي في الفحص المجهري متحد البؤر. أظهرت الخلايا المحتضنة بالجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للفأر DyLight 549 (1: 200) والمعالجة بالاستسقاء المنقى والطافية المنقاة من خلايا pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO إشارة تألق حمراء قوية تدل على الجسم المضاد متعدد النسيلة APN. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. تحديد الصلات النسبية للأجسام المضادة باستخدام ELISA22. تم قياس امتصاص العينات التي تحتوي على APN-5B36 mAbs أو rAbs ، في غياب ووجود بروتين APN ، عند الطول الموجي 450 نانومتر. تم رسم منحنى الربط باستخدام ملاءمة منحنى لوجستي رباعي المعلمات ؛ يظهر المحور X التركيز اللوغاريتمي للأجسام المضادة ، ويظهر المحور Y الامتصاص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد تحريض المناعة المخاطية أحد أكثر الأساليب فعالية في مواجهة مسببات الأمراض وفي الوقاية من الأمراض المختلفة وعلاجها. يشارك APN ، وهو بروتين مرتبط بغشاء عالي التعبير في الغشاء المخاطي المعوي ، في تحريض الاستجابة المناعية التكيفية وفي التداخل الخلوي الفيروسي والبكتيري بوساطة المستقبلات1،5،8. يستخدم APN كجسيمات مستضد في العديد من أشكال تحميل المستضد وتوصيل اللقاح. يمكن أن يؤدي تناول الأجسام المضادة التي تستهدف APN عن طريق الفم أيضا إلى إثارة استجابات مناعية فعالة18،24،25. ومع ذلك ، فإن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تستهدف مختلف الحواتم الخاصة ب APN تتطلب مزيدا من التحقيق.
تم استخدام الطرق الموصوفة هنا لإنتاج أجسام مضادة وحيدة النسيلة ضد APN باستخدام كل من الورم الهجين التقليدي والتقنيات المؤتلفة. يمكن استخدام هذا النهج في إنتاج mAbs الأخرى. أولا ، اتبعنا بروتوكولا سبق ذكره للحصول على تسعة mAbs مشتقة من استنساخ مختلف للورم الهجين. على الرغم من أن عيار هذه mAbs في طافات الخلايا والاستسقاء كانت مختلفة ، إلا أن جميع mAbs احتوت على سلسلة ثقيلة 50 كيلو دالتون وسلسلة خفيفة 25 كيلو دالتون وأظهرت ارتباطا محددا ببروتين APN الخنازير. أظهرت نتائج التنميط المتماثل وتحديد حوامل المستضد أن معظم mAbs استهدفت حوامل مختلفة وتنتمي إلى أنواع مختلفة من الأجسام المضادة. تشير هذه النتائج إلى أن تقنية الورم الهجين التقليدية لا تزال خيارا فعالا في إنتاج mAbs.
يمكن للنهج المستخدمة لإنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة أن تزيد من كفاءة إنتاج mAb وتقلل من التكاليف المرتبطة بالعمالة والوقت. لذلك ، نمت شعبية هذه الأساليب ، خاصة في تطوير الأجسام المضادة للتطبيقات التشخيصية والعلاجية 16،17،26. تظهر rAbs العديد من المزايا على mAbs المشتقة من الورم الهجين. أولا ، يمكن إنتاج rAbs في المختبر عن طريق استنساخ جينات الأجسام المضادة في نواقل التعبير ، وبالتالي القضاء على استخدام الحيوانات في إنتاج الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام أنظمة التعبير حقيقية النواة أو بدائية النواة لإنتاج rAbs يؤدي إلى اختلافات منخفضة من دفعة إلى أخرى ويزيد من موثوقية واستقرار المنتج النهائي. في المقابل ، غالبا ما لا تتعرف mAbs المنتجة باستخدام الأورام الهجينة على حوائط المستضد المستهدفة أو ترتبط بها ، وتتأثر بانحراف خط خلية الورم الهجين والتلوث وفقدان الجينات والطفرات. في الوقت الحاضر ، تستخدم mAbs المشتقة من الورم الهجين في الغالب في الكواشف المناعية التشخيصية أو العلاجية ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى إنتاج أجسام مضادة مستقرة وموثوقة في فترة إنتاج محدودة. بالنسبة للتطبيقات التشخيصية والعلاجية ، تعد تقنية الأجسام المضادة المؤتلفة خيارا أفضل من النهج التقليدي القائم على الورم الهجين. وذلك لأن تقنية الأجسام المضادة المؤتلفة تسمح لنا بتعديل تسلسل rAbs لتبديل أنماط الغلوبولين المناعي ، وبالتالي زيادة خصوصية الارتباط للجسم المضاد14،16،17.
في هذه الدراسة ، استخدمنا تقنية هندسة الأجسام المضادة للحصول على الأجسام المضادة المؤتلفة التي تستهدف APN. وجدنا أن كلا من طحال الفئران المحصنة وخلايا الورم الهجين كانت فعالة بالمثل في تضخيم تسلسل سلسلة mAb الثقيلة والخفيفة. لم يتعرف الجسم المضاد الذي تم التعبير عنه بواسطة pET28a (+) -rAbs-APN-BL21 (DE3) بشكل فعال على APN في ELISA أو مقايسات التألق المناعي غير المباشر. ومع ذلك ، فإن rAbs التي تم التعبير عنها بواسطة تعليق الخلايا pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO و mAbs المشتقة من الورم الهجين قد تعرفت على بروتين APN وربطته بشكل فعال. يمكن استخدام الطرق الموضحة في هذه الدراسة لتطوير ADC القائم على الأجسام المضادة APN وغيرها من المنتجات العلاجية التي تستهدف مختلف الحواتم الخاصة ب APN. ستساعد هذه الدراسة أيضا في زيادة توضيح دور APN في الوقاية من الأمراض المختلفة وعلاجها. ومع ذلك ، فإن استراتيجيات تحسين تقارب وإنتاجية rAbs تتطلب مزيدا من التحقيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح. وافق جميع المؤلفين وأعطوا موافقتهم الصريحة على نشر المخطوطة.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة مؤسسة العلوم الوطنية الصينية (رقم 32072820 ، 31702242) ، والمنح المقدمة من منحة حكومة جيانغسو للدراسات الخارجية (JS20190246) والمواهب رفيعة المستوى لمؤسسة البحث العلمي بجامعة يانغتشو ، وهو مشروع أسسه البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لتطوير مؤسسة جيانغسو للتعليم العالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), Hoboken, N.J. 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient's need. British Journal of Nursing. 24 (16), Suppl 1 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
