Summary
Det rekombinanta antikroppsproteinet uttryckt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler och monoklonala antikroppar producerade med traditionell hybridomteknik kan känna igen och binda till svinaminopeptidas N (APN) -proteinet.
Abstract
Svinaminopeptidas N (APN), ett membranbundet metallopeptidas som finns rikligt i tunntarmslimhinnan, kan initiera ett slemhinneimmunsvar utan störningar såsom lågt proteinuttryck, enzyminaktivitet eller strukturella förändringar. Detta gör APN till en attraktiv kandidat i utvecklingen av vacciner som selektivt riktar sig mot slemhinneepitelet. Tidigare studier har visat att APN är ett receptorprotein för både enterotoxinproducerande Escherichia coli (E. coli) F4 och överförbart gastroenteritvirus. Således visar APN löfte i utvecklingen av antikropps-läkemedelskonjugat eller nya vacciner baserade på APN-specifika antikroppar. I denna studie jämförde vi produktion av APN-specifika monoklonala antikroppar (mAbs) med traditionell hybridomteknik och rekombinant antikroppsuttrycksmetod. Vi etablerade också en stabilt transfekterad kinesisk hamsteräggstockscellinje (CHO) med pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN och en E. coli-uttryck BL21 (DE3) stam som innehåller pET28a (+) -rAbs-APN-vektorn. Resultaten visar att antikroppar uttryckta i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler och mAbs producerade med hybridom kunde känna igen och binda till APN-proteinet. Detta utgör grunden för ytterligare klarläggande av APN-receptorns funktion för utveckling av läkemedel riktade mot olika APN-specifika epitoper.
Introduction
Aminopeptidas N (APN), ett månskensenzym som tillhör metalloproteinas M1-familjen, fungerar som en tumörmarkör, receptor och signalmolekyl via enzymberoende och enzymoberoende vägar 1,2. Förutom att klyva N-terminala aminosyrarester av olika bioaktiva peptider för reglering av deras biologiska aktivitet spelar APN en viktig roll i patogenesen av olika inflammatoriska sjukdomar. APN deltar i antigenbearbetning och presentation av trimmade peptider som binder tätt till stora histokompatibilitetskomplexa klass II-molekyler 2,3. APN utövar också antiinflammatoriska effekter genom att binda med G-proteinkopplade receptorer som deltar i multipel signaltransduktion, modulerar cytokinsekretion och bidrar till Fc-gammareceptormedierad fagocytos i immunsvaret 4,5,6,7.
Som ett brett distribuerat membranbundet exopeptidas är APN rikligt i svinets tunntarmslimhinna och är nära associerad med receptormedierad endocytos 1,5,8. APN känner igen och binder spikproteinet hos det överförbara gastroenteritviruset för cellinträde och interagerar direkt med FaeG-underenheten av enterotoxinbildande Escherichia coli F4-fimbrier för att påverka bakteriell vidhäftning med värdceller 9,10,11. Således är APN ett potentiellt terapeutiskt mål vid behandling av virus- och bakterieinfektionssjukdomar.
Sedan utvecklingen av hybridomteknik och andra strategier för monoklonala antikroppar (mAbs) produktion 1975 har mAbs använts i stor utsträckning inom immunterapi, läkemedelsleverans och diagnos12,13,14. För närvarande används mAbs framgångsrikt för att behandla sjukdomar, såsom cancer, inflammatorisk tarmsjukdom och multipel skleros12,15. På grund av deras starka affinitet och specificitet kan mAbs vara idealiska mål vid utveckling av antikropps-läkemedelskonjugat (ADC) eller nya vacciner16,17. APN-proteinet är avgörande för att selektivt leverera antigener till specifika celler och kan framkalla ett specifikt och starkt mukosalt immunsvar mot patogener utan störningar inklusive lågt proteinuttryck, enzyminaktivitet eller strukturella förändringar 5,8,18. Därför visar terapeutiska produkter baserade på APN-specifika mAbs löfte mot bakteriella och virusinfektioner. I denna studie beskriver vi produktionen av APN-specifika mAbs med hjälp av hybridomteknik och uttryck av anti-APN-rekombinanta antikroppar (rAbs) med hjälp av prokaryota och eukaryota vektorer. Resultatet indikerar att APN-proteinet kändes igen av både rAbs uttryckt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler och hybridom-härledda mAbs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök i denna studie godkändes av Yangzhou University Institutional Animal Care and Use Committee (SYXK20200041).
1. Beredning av APN-proteinantigen från svin
OBS: Stammen pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) och de APN stabilt uttryckta cellerna pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 konstruerades i en tidigare studie11.
- Extrahera bakterier från en fryst glycerolstam och stryk på Luria-Bertani (LB) plattor innehållande 50 μg/ml kanamycin (Km+) för isolering av en enda koloni.
- Välj en enda koloni från den nystrimmiga plattan, odla i 4 ml LB-medium (10 g / L trypton, 10 g / L natriumklorid (NaCl) och 5 g / L jästextrakt, pH 7,2) kompletterat med Km+ (50 μg / ml) och låt växa över natten (12-16 timmar) med omrörning (178 rpm) vid 37 ° C.
- Späd de beredda bakterierna vid 1:100 i färsk Km+ LB-buljong och inkubera vid 37 °C med skakning i 2-3 timmar tills OD600 når 0,4-0,6.
- Tillsätt isopropyl β-d-1-tiogalaktospyranosid (IPTG) till mediet till en slutlig koncentration på 0,4 mM och inkubera kulturerna i ytterligare 10 timmar vid 16 °C.
- Följaktligen centrifugera och skörda bakterierna med IPTG-induktion (10 000 × g, 4 °C 15 min).
- Återsuspendera cellpelleten med 5 ml LEW (lysis/jämvikt/tvätt) buffert (50 mM vattenfritt natriumfosfatmonobasiskt (NaH2PO4) och 300 mM NaCl, pH 8,0) innehållande 1 mg/ml lysozym. Rör om bakteriesuspensionen i 30 minuter på is och sonikat helt (15 s puls och 20 s av, 15 min) med hjälp av en ultraljudshomogenisator.
- Centrifugera råcellslysatet vid 4 °C och 10 000 × g i 30 minuter för att avlägsna cellulärt skräp. Överför supernatanten till en förbalanserad kolonn och inkubera 1-2 minuter före tyngdkraftsdränering. Upprepa detta steg tre gånger.
- Tvätta kolonnen med 20 ml LEW-buffert och töm med tyngdkraften. Eluera det histidinmärkta APN-proteinet med 9 ml elueringsbuffert (50 mMNaH2PO4, 300 mM NaCl och 250 mM imidazol, pH 8,0) och samla i dialysslangar.
- Dialysera proteinlösningen över natten vid 4 °C i natriumkarbonat-natriumbikarbonat (PBS, 135 mM NaCl, 4,7 mM kaliumklorid, 2 mMNaH2PO4och 10 mM dodekahydratnatriumfosfat dibasisk, pH 7,2) buffert.
- Analysera med en 12.0% SDS-PAGE gel och western blotting för att bedöma renheten hos APN-proteinet.
- Fyll 5 μg protein i varje brunn i gelen och låt köra vid 110 V i 1,5 timmar. Överför sedan protein till ett PVDF-membran i 50 minuter vid 15 V. Bestäm koncentrationen av det renade proteinet med hjälp av en BCA-analys.
2. Immunisering av djur
- Subkutan (s.c) injicera kvinnliga BALB/c-möss, 6-8 veckors ålder, med 50 μg APN-protein eller PBS (negativ kontroll) blandat med adjuvans en gång varannan vecka. Använd komplett Freunds adjuvans som innehåller de värmedödade Mycobacteria för initial immunisering och ofullständig Freunds adjuvans för boosterimmuniseringar. Blanda lika stora volymer APN-protein (eller PBS) och Freunds adjuvans respektive ofullständiga Freunds adjuvans.
- Påvisa antikroppstitrar mot APN i serum hos dessa möss genom indirekt enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) med hjälp av en mikrotiterplatta belagd med 5 μg/ml APN-protein utspätt i 0,05 M PBS (pH 9,6). .
3. Hybridomteknik för att producera monoklonala antikroppar mot APN
- Injicera intraperitonealt (i.p.) 100 μg APN-protein i de utvalda mössen för en slutlig antigenförstärkning.
- Tre dagar senare, avliva mössen med pentobarbitalnatrium (50 mg / kg, v / v, intraperitoneal) och cervikal dislokation.
- Samla mjälte och tvätta med DMEM två gånger för att ta bort blod och fettceller. Filtrera mjältcellssuspensionen med ett koppargaller med 200 nät för att avlägsna vävnadsskräp och skörda mjältceller med centrifugering (1500 × g, 10 min) för att avlägsna mjältens membran.
- Frömusmyelom SP2/0-celler i en 25 cm 2-kolv innehållande 5 ml DMEM kompletterat med 6% fetalt bovint serum (FBS) och odling vid 37 °C, 6% CO2-atmosfär för att bibehålla cellviabiliteten. Efter 5-6 dagars odling når cellerna 80% -90% sammanflöde efter återupplivning och är i tillväxtloggfas. Under mikroskopet är cellerna runda, ljusa och klara.
- En dag före hybridisering, samla makrofager från peritoneala håligheter hos mössen enligt en tidigare publicerad metod12,19.
- Frö peritoneala makrofager med en densitet av 0,1-0,2 × 105 / ml i 96-brunnsplattor, var och en innehållande 100 μL HAT-medium (DMEM kompletterat med 10% FBS och 1x HAT-tillägg) och inkubera vid 37 ° C, 6% CO2 fuktad atmosfär över natten.
- För hybridisering, aspirera försiktigt SP2 / 0-celler med en pipett från 8-10 flaskor och suspendera i 10 ml serumfritt DMEM-medium. Tvätta cellerna med färsk DMEM, centrifugera (1500 × g, 10 min) två gånger och suspendera sedan igen i 10 ml DMEM.
- Blanda de kvantifierade mjältcellerna med SP2/0-celler i förhållandet 10:1 och överför till 50 ml rör. Centrifugera (1500 × g, 10 min) och kassera supernatanten. Samla cellpellets i botten av rören och knacka med handflatan för att lossa pelletsna före hybridisering.
- Tillsätt 1 ml polyetylenglykol 1500 (PEG 1500), förvärmd till 37 °C, droppvis med en pipett till den lossade cellpelleten under tidsperioden 45 s medan rörets botten försiktigt roteras.
- Tillsätt långsamt 1 ml DMEM förvärmt till 37 °C till ovanstående blandning under 90 s, följt av ytterligare 30 ml färsk DMEM. Placera fusionsröret i ett 37 °C vattenbad i 30 minuter.
- Efter inkubation i det varma badet, skörda cellerna och återsuspendera i HAT-medium. Sedan kultur i en 96-brunnsplatta inokulerad med peritoneala makrofager.
- Fem dagar senare, tillsätt 100 μL färskt HAT-medium till varje brunn och inkubera plattan i ytterligare 5 dagar, varefter ersätt mediet med HT-medium (DMEM kompletterat med 10% FBS och 1x HT-tillskott).
- Använd en mikrotiterplatta belagd med 5 μg/ml APN-protein utspätt i 0,05 M PBS (pH 9,6) för att analysera monoklonala antikroppar i hybridomsupernatanten med ELISA-analys.
- När mediet i brunnarna på 96-brunnsplattan blir gult (på grund av celltillväxt och metabolitfrisättning minskar pH i mediet till 6,8 och fenolrött vänder från fuchsia till gult) eller cellkluster observeras, förvärva 100 μL supernatant från de valda brunnarna och lägg till brunnarna på den belagda ELISA-plattan. Använd en mikroplattläsare för att mäta OD450-värdena.
- Använd polyklonala antikroppar mot APN och icke-infekterat musserum som positiv respektive negativ kontroll och använd PBS som blindkontroll. I denna studie erkändes OD450-förhållandet mellan prov och negativ kontroll (P / N) ≥ 2.1 som positiv urvalsstandard.
- Efter tre på varandra följande positiva urvalsomgångar, välj hybridom som visar ökat serologiskt svar mot APN-proteinet för en begränsad utspädningsanalys.
- Förbered peritoneala makrofager och frö i 96-brunnsplattor som beskrivits tidigare.
- Suspendera hybridomceller i HT-medium vid i genomsnitt 0,5-2 celler per brunn och odla i en 37 °C, 6% CO2-inkubator . Upprepa detta steg tre eller fyra gånger tills den positiva hastigheten som indikeras av ELISA-immunanalysen når 100%.
- Under trycket av kontinuerlig frysning och upptining, välj de positiva hybridomcellerna som stabilt kan utsöndra anti-APN-antikroppar och proliferera normalt.
- Administrera en enda i.p. injektion av 0,3 ml pristan till varje mus (8-10 veckor). Vid 10 dagar efter att ha fått orörda, injicera varje mus med 2-5 x 10 5 hybridomceller i0,5 ml PBS (pH 7,2).
- Samla försiktigt peritonealvätska från bukhålan hos dessa möss 8 till 10 dagar efter injektionen.
- Skörda supernatanterna genom centrifugering vid 5 000 × g i 15 minuter och rena antikroppar i supernatanterna med 33% mättat ammoniumsulfat [(NH 4)2SO4] utfällning och protein A-agaros.
4. Karakterisering av mAbs mot APN-protein
- Bestäm immunoglobulinsubtypen av de uppsamlade mAbs med hjälp av ett SBA Clonotyping System-HRP20. Använd SDS-PAGE och western blotting för att bedöma mAb-renhet och specificitet.
- Analysera mAb-epitopspecificitet mot APN-proteinet med ELISA21. Additivitetsvärde (AV) är förhållandet mellan OD mAbs (a + b) och (OD mAbs-a + OD mAbs-b), som används för att utvärdera ommAbs känner igen samma antigena plats; ODmAbs-a och OD mAbs-b representerar OD450-värdena för olika monoklonala antikroppar mot APN ensam, och OD mAbs(a + b) representerar OD450-värdena för en 1: 1-blandning av tvåmAbs mot APN.
- Bedöm varje prov minst fyra replikat och upprepa hela experimentet minst tre gånger.
5. Uttryck av rAbs mot APN
- Extrahera totalt RNA från ovan nämnda hybridomceller och mjälte av APN-immuniserade möss (t.ex. TRIzol)22. Syntetisera komplementärt DNA (cDNA) med hjälp av ett cDNA-synteskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Förstärk variabla regioner av mAbs med kapslad PCR och bestäm sekvenser med tung kedja (VH) och lätt kedja (VL) med hjälp av sekvensering. Analysera generna som kodar för VH och VL med hjälp av IMGT-musens genomanalysverktyg (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Kombinera VH- och VL-generna med ledarsekvenser och subklona dem sekventiellt i vektorerna pET28a (+) respektive pIRES2-ZsGreen1 med hjälp av sömlös kloningsteknik för att möjliggöra ärrlös insättning av DNA-fragment. De specifika primrarna anges i tabell 1.
- Odla de pET28a (+)-rAbs-APN-BL21-transformerade bakterierna i närvaro av 0,4 mM IPTG i orbitalshakers vid 37 °C i 10 timmar. Inducera, rena och utvärdera sedan för uttrycket av rAbs-proteinet med hjälp av rutinmässig proteinrening.
- Frö 100 μL 0,5 x 105 CHO celler per brunn i en 96-brunnsplatta och inkubera vid 37 ° C i en 6% CO2-atmosfär i 18-24 timmar. När cellerna når 80-90% sammanflöde, späd pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-plasmiden med Opti-MEM till en slutlig koncentration av 0,1 μg / μL och inkubera 5 min vid rumstemperatur innan den används för transfektion.
- Blanda försiktigt 50 μL utspädd pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-plasmid med 1 μL lipofectamine 2000 och 49 μL Opti-MEM och inkubera blandningen i ytterligare 20 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt 100 μl blandning till varje brunn på en platta med 96 brunnar innehållande CHO-celler och inkubera vid 37 °C i 6 %CO2-atmosfär i 4–6 timmar.
- Vid 4-6 timmar efter transfektion, ersätt mediet med DMEM-F12-medium kompletterat med 10% FBS och inkubera plattan i ytterligare 48 timmar. Tillsätt sedan 400 μg / ml G418 till varje brunn för att välja de stabilt transfekterade cellerna.
- Efter 10 dagars urval med DMEM-F12-medium kompletterat med 10% FBS och 400 μg / ml G418, sortera cellerna (3,0 × 107 celler / ml) genom fluorescensaktiverad cellsortering. Cirka 10-15% av cellpopulationen var positiva.
- Seriellt späd skördade positiva celler, frö i genomsnitt 0,5-2 celler per brunn i en 96-brunnsplatta och odling i en 37 ° C, 6% CO2-inkubator . Underhåll de stabilt transfekterade pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-cellerna med selektion med G418 (200 μg/ml).
- FBS-koncentrationen i det ovan beskrivna cellodlingsmediet minskar gradvis från 10% till 0% under den logaritmiska tillväxtfasen under tidsperioden av 3 veckor. Anpassa sedan de vidhäftande CHO-cellerna till suspensionstillväxt i ett serumfritt medium.
- Odla de sådda pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-cellerna i den logaritmiska tillväxtfasen i serumfritt medium med en densitet av 0,8-1,0 × 105 celler/ml i skakkolvarna vid 80-110 rpm skakhastighet och 37 °C, 6% CO2.
- Samla upp cellsuspensionen var 12:e timme för att bestämma förändringar i cellviabilitet och vitalitet med hjälp av ett cellräkningskit (t.ex. CCK-8) enligt tillverkarens instruktioner.
- Antikroppsuttryck når toppnivåer när cellviabiliteten minskade till 80% och celldensiteten når 1,0-2,0 × 106 celler / ml. Skörda cellsupernatanter med centrifugering, filtrera med ett 0,22 μm polytetrafluoretylenmembranfilter och rena med protein A-agaros.
- Bekräfta produktion av APN-specifika antikroppar med hjälp av indirekta immunofluorescensanalyser (IFA).
- Bestäm antikroppstitrar och bindningsaffiniteter med ELISA-analys enligt beskrivningen ovan. 23 Beräkna jämviktsdissociationskonstanten (KD-värde ) för antikropparna med en logistisk ekvation med fyra parametrar med hjälp av programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie användes det renade lösliga APN-proteinet (2.12 mg / ml) för immunisering av möss. Möss immuniserade med APN-proteinet fyra gånger med 14-dagars mellanrum uppvisade en högre antikroppstiter mot APN i deras serum. Även om 14 hybridom erhölls med hjälp av fusionsexperimenten, överlevde endast 9 hybridom de tre kontinuerliga frys-tina cyklerna, vilket resulterade i 9 stabila kloner som utsöndrade antikroppar mot APN. Alla dessa celler är runda, ljusa och klara (figur 1). De renade mAbs som har tunga och lätta kedjor (50 kDa respektive 25 kDa) bekräftades av SDS-PAGE och hittades i de renade ascites (figur 2). Titrarna av dessa anti-APN mAbs i kultursupernatanter och ascites visas i tabell 2.
Resultatet av mAbs-isotypning hos möss avslöjade att mAbs härledda från klonerna 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 och 6C56 hade IgG2b-underklasser, medan APN-2A20 var en antikropp av IgG2a-κappa- (κ) -typ och mAbs APN-3FD9, -3F10 och -10F3 tillhörde IgM-typ och bearbetade κ-ljuskedjor (tabell 3). Som visas i tabell 4 visade de flesta av dessa mAbs AV-värden på över 50%, vilket indikerar att de riktade sig mot olika epitoper i APN, medan APN-5C51-antikroppen kände igen antigena epitoper som liknar dem som känns igen av APN-3C48, -5B31 och -6C56 mAbs.
APN-5B36 visade betydligt högre antikroppstiter jämfört med andra mAbs. Därför amplifierades och ligerades APN-5B36 VH-VL-genen till en pET28a (+) eller pIRES2-ZsGreen1-vektor för att konstruera de rekombinanta expressionsplasmiderna pET28a (+)-rAbs-APN respektive pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN (figur 3). Antikropparna uttryckta av både pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) och pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler renades och analyserades med ELISA- och IFA-analyser. Som visas i figur 4 kände emellertid endast antikroppen uttryckt i supernatanten av pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler igen APN-proteinet, liksom hybridom-härledda mAbs. Denna rekombinanta antikropp bestod av IgG2b tunga kedjor och lambda lätta kedjor och visade en titer på 2,56 × 105 bestämd med ELISA. Bindningen av APN-5B36 mAbs till APN-proteiner nådde en jämvikt tidigare än rAbs gjorde (figur 5), vilket visar KD-värde på (4,232±0,475) × 10-9 respektive (2,201±0,367) × 10-8 mol / L.
| Abc-bok | Sekvens (5'-3') | ||
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG | ||
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGGAGAGGGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
Tabell 1. De specifika primrar som används i denna studie.
| Celler | Titrar av supernatanter (U / ml) | Tirar av ascites (U / ml) |
| 2A20 | 0.64×104 | 3.20×105 |
| 5B31 | 1.28×104 | 1.60×105 |
| 5B36 | 0.64×104 | 1.28×106 |
| 3C48 | 0.16×104 | 0.80×105 |
| 5C51 | 0.16×104 | 0.80×104 |
| 6C56 | 0.80×103 | 0.80×104 |
| 3FD9 | 0.80×103 | 0.80×104 |
| 3F10 | 0.16×104 | 0.16×105 |
| 10F3 | 0.80×103 | 0.32×105 |
Tabell 2. ELISA-titrarna av APN mAbs.
| Ig | IgA | Igm | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | Kappa | Lambda | Sammanfattning | |
| 2A20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a, Kappa |
| 5B31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b, Lambda |
| 5B36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b, Lambda |
| 3C48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b, Lambda |
| 5C51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b, Lambda |
| 6C56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b, Lambda |
| 3FD9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM, Kappa |
| 3F10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM, Kappa |
| 10F3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM, Kappa |
Tabell 3. Isotyper av hybridom-härledda APN mAbs.
| mAbs | AV-värde (100 %) | ||||||||
| 2A20 | 5B31 | 5B36 | 3C48 | 5C51 | 6C56 | 3FD9 | 3F10 | 10F3 | |
| 2A20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5B31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5B36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3C48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5C51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6C56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3FD9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3F10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10F3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
Tabell 4. Diskriminering av antigen-epitopspecificitet av APN-specifika mAbs. AV-värden större än 0,5 indikerar att dessa två mAbs känner igen olika antigena platser; AV-värden mindre än 0,5 indikerar att dessa två mAbs känner igen en liknande antigen plats.
Figur 1. Bild av hybridom. Under mikroskopisk analys är hybridom runda, ljusa och klara. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Rekombinanta antikroppsuttrycksnivåer och ascites analyseras med SDS-PAGE. a) Lane M, proteinmarkör. bana 1, renat pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) lysat; körfält 2, pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) supernatant; körfält 3, ascites vätska renad med 33% (NH 4)2SO4 nederbörd. b) Lane M, proteinmarkör. lane 1, ascites vätska renad med protein A agaros. I denna analys laddades 3-5 μg totalt protein i varje bana i gelén. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Rekombinanta expressionsplasmider pET28a (+)-rAbs-APN och pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN analyserade med agarosgelelektrofores. Lane M, Trans 2K plus DNA-markör; Lane 1, pET28a (+) vektor (5369 bp); bana 2 och 5, VH-VL-genen kombinerad med APN-5B36-ledarsekvens; bana 3, pET28a (+)-rAbs-APN-plasmid uttryckt i BL21 (DE3) E. coli; körfält 4, pIRES2-ZsGreen1 vektor (5283 bp); bana 6, pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN plasmid uttryckt i DH5α E. coli. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Uttryck av rekombinant antikroppsprotein och ascites analyseras med indirekt immunofluorescens. pEGFP-C1-APN-IPEC-J2-celler (grön fluorescens) som stabilt uttrycker APN behandlades med (A) PBS, som användes som kontrollbehandling; b) renat protein uttryckt som pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3), (C) APN polyklonal antikropp (1:500); (D) renad ascites vätska (1:500); E) renat supernatant erhållet från pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler (1:500). DAPI användes som nukleär motfläck vid konfokalmikroskopi. Cellerna inkuberade med DyLight 549-konjugerad getanti-mus IgG sekundär antikropp (1: 200) och behandlades med renade ascites och renad supernatant från pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler visade en robust rödfluorescenssignal som indikerar som APN-polyklonal antikropp gjorde. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5. Bestämning av antikroppsrelativ bindningsaffinitet med hjälp av ELISA22. Absorptionen av prover innehållande APN-5B36 mAbs eller rAbs, i frånvaro och närvaro av APN-protein, mättes vid våglängden 450 nm. Bindningskurvan ritades med hjälp av en logistisk kurvpassning med fyra parametrar; x-axeln visar den logaritmiska koncentrationen av antikroppar och y-axeln visar absorbansen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Induktion av slemhinneimmunitet är ett av de mest effektiva tillvägagångssätten för att motverka patogener och förebygga och behandla olika sjukdomar. APN, ett starkt uttryckt membranbundet protein i tarmslemhinnan, är involverat i induktionen av adaptivt immunsvar och i receptormedierad viral och bakteriell endocytos 1,5,8. APN används som antigenpartiklar i många format av antigenladdning och vaccinleverans. Den orala administreringen av APN-riktade antikroppar kan också framkalla effektiva immunsvar 18,24,25. Monoklonala antikroppar riktade mot olika APN-specifika epitoper kräver dock ytterligare undersökning.
De metoder som beskrivs här användes för att producera monoklonala antikroppar mot APN med både traditionell hybridom och rekombinant teknik. Detta tillvägagångssätt kan användas vid produktion av andra mAbs. Först följde vi ett tidigare nämnt protokoll för att erhålla nio mAbs härledda från olika hybridomkloner. Även om titrarna av dessa mAbs i cellsupernatanter och ascites var olika, innehöll alla mAbs den tunga kedjan 50 kDa och den lätta kedjan 25 kDa och visade specifik bindning med APN-proteinet från svin. Resultaten av isotypning och identifiering av antigenepitoper visade att de flesta mAbs riktade sig mot olika epitoper och tillhörde olika antikroppstyper. Dessa resultat indikerar att traditionell hybridomteknik fortfarande är ett effektivt val vid produktion av mAbs.
Metoder som används för rekombinant-antikroppsproduktion kan öka mAb-produktionseffektiviteten och minimera arbets- och tidsrelaterade kostnader. Därför har dessa tillvägagångssätt ökat i popularitet, särskilt vid utveckling av antikroppar för diagnostiska och terapeutiska tillämpningar16,17,26. rAbs visar flera fördelar jämfört med hybridom-härledda mAbs. För det första kan rAbs produceras in vitro genom kloning av antikroppsgener till expressionsvektorer, vilket eliminerar djuranvändning i antikroppsproduktion. Dessutom resulterar användning av eukaryota eller prokaryota uttryckssystem för att producera rAbs i låga batch-till-batch-variationer och ökar slutproduktens tillförlitlighet och stabilitet. Däremot känner mAbs som produceras med hjälp av hybridom ofta inte igen eller binder till de riktade antigenepitoperna och påverkas av hybridomcellinjedrift, kontaminering och genförlust och mutationer. För närvarande används hybridom-härledda mAbs mest i diagnostiska eller terapeutiska immunreagens, vilket belyser behovet av att producera stabila och tillförlitliga antikroppar under en begränsad produktionsperiod. För diagnostiska och terapeutiska tillämpningar är rekombinant antikroppsteknik ett bättre val än traditionellt hybridombaserat tillvägagångssätt. Detta beror på att rekombinant antikroppsteknik tillåter oss att modifiera sekvensen av rAbs för att byta immunoglobulinisotyper, vilket ökar bindningsspecificiteten hos antikroppen14,16,17.
I denna studie använde vi antikroppsteknik för att erhålla APN-riktade rekombinanta antikroppar. Vi fann att både mjälten hos immuniserade möss och hybridomceller var lika effektiva för att förstärka mAb-tung- och ljuskedjesekvenserna. Antikroppen uttryckt av pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) kände inte effektivt igen APN i vare sig ELISA eller indirekta immunofluorescensanalyser. RAbs uttryckt av pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-cellsuspensionen och hybridom-härledda mAbs kände emellertid igen och effektivt binder APN-proteinet. Metoderna som beskrivs i denna studie kan användas för att utveckla APN-antikroppsbaserad ADC och andra terapeutiska produkter riktade mot olika APN-specifika epitoper. Denna studie kommer också att bidra till att ytterligare klargöra APN: s roll i förebyggande och behandling av olika sjukdomar. Strategier för att förbättra affiniteten och utbytet av rAbs kräver dock ytterligare undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt. Alla författare godkände och gav sitt uttryckliga samtycke till publicering av manuskriptet.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Chinese National Science Foundation Grant (nr 32072820, 31702242), bidrag från Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) och High-level Talents of Yangzhou University Scientific Research Foundation, ett projekt grundat av Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), Hoboken, N.J. 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient's need. British Journal of Nursing. 24 (16), Suppl 1 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
