Summary
La proteina anticorpale ricombinante espressa nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e negli anticorpi monoclonali prodotti utilizzando la tecnologia tradizionale dell'ibridoma possono riconoscere e legarsi alla proteina N dell'aminopeptidasi suina (APN).
Abstract
L'aminopeptidasi suina N (APN), una metallopeptidasi legata alla membrana abbondantemente presente nella mucosa dell'intestino tenue, può avviare una risposta immunitaria della mucosa senza alcuna interferenza come bassa espressione proteica, inattività enzimatica o cambiamenti strutturali. Ciò rende APN un candidato interessante nello sviluppo di vaccini che colpiscono selettivamente l'epitelio della mucosa. Studi precedenti hanno dimostrato che l'APN è una proteina recettore sia per l'Escherichia coli enterotossigenico (E. coli) F4 che per il virus della gastroenterite trasmissibile. Pertanto, APN mostra risultati promettenti nello sviluppo di coniugati anticorpo-farmaco o nuovi vaccini basati su anticorpi APN-specifici. In questo studio, abbiamo confrontato la produzione di anticorpi monoclonali APN-specifici (mAbs) utilizzando la tecnologia tradizionale dell'ibridoma e il metodo di espressione degli anticorpi ricombinanti. Abbiamo anche stabilito una linea cellulare di ovaio di criceto cinese (CHO) stabilmente trasfettata utilizzando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN e un ceppo di espressione BL21 (DE3) di E. coli che ospita il vettore pET28a (+)-rAbs-APN. I risultati mostrano che gli anticorpi espressi nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e mAbs prodotti utilizzando ibridomi potrebbero riconoscere e legarsi alla proteina APN. Ciò fornisce la base per ulteriori chiarimenti sulla funzione del recettore APN per lo sviluppo di terapie mirate a diversi epitopi specifici dell'APN.
Introduction
L'aminopeptidasi N (APN), un enzima che appartiene alla famiglia delle metalloproteinasi M1, agisce come marcatore tumorale, recettore e molecola di segnalazione attraverso vie enzima-dipendenti ed enzima-indipendenti 1,2. Oltre a scindere i residui aminoacidici N-terminali di vari peptidi bioattivi per la regolazione della loro attività biologica, l'APN svolge un ruolo importante nella patogenesi di varie malattie infiammatorie. APN partecipa all'elaborazione e alla presentazione dell'antigene da parte di peptidi tagliati che si legano strettamente alle principali molecole di classe II del complesso di istocompatibilità 2,3. APN esercita anche effetti antinfiammatori legandosi con i recettori accoppiati a proteine G che partecipano alla trasduzione del segnale multiplo, modulando la secrezione di citochine e contribuendo alla fagocitosi mediata dal recettore Fc gamma nella risposta immunitaria 4,5,6,7.
Come esopeptidasi legata alla membrana ampiamente distribuita, l'APN è abbondante nella mucosa dell'intestino tenue suino ed è strettamente associata all'endocitosi mediata dal recettore 1,5,8. APN riconosce e lega la proteina spike del virus della gastroenterite trasmissibile per l'ingresso cellulare e interagisce direttamente con la subunità FaeG delle fimbrie enterotossigeniche di Escherichia coli F4 per influenzare l'aderenza batterica con le cellule ospiti 9,10,11. Pertanto, APN è un potenziale bersaglio terapeutico nel trattamento delle malattie infettive virali e batteriche.
Dopo lo sviluppo della tecnologia dell'ibridoma e di altre strategie per la produzione di anticorpi monoclonali (mAbs) nel 1975, i mAb sono stati ampiamente utilizzati nell'immunoterapia, nella somministrazione di farmaci e nella diagnosi12,13,14. Attualmente, i mAbs sono usati con successo per trattare malattie come il cancro, le malattie infiammatorie intestinali e la sclerosi multipla12,15. A causa della loro forte affinità e specificità, i mAb possono essere bersagli ideali nello sviluppo di coniugati anticorpo-farmaco (ADC) o di nuovi vaccini16,17. La proteina APN è fondamentale per la somministrazione selettiva di antigeni a cellule specifiche e può suscitare una risposta immunitaria mucosa specifica e forte contro i patogeni senza alcuna interferenza, tra cui bassa espressione proteica, inattività enzimatica o cambiamenti strutturali 5,8,18. Pertanto, gli agenti terapeutici a base di mAbs specifici per APN mostrano risultati promettenti contro le infezioni batteriche e virali. In questo studio, descriviamo la produzione di mAbs APN-specifici utilizzando la tecnologia dell'ibridoma e l'espressione di anticorpi ricombinanti anti-APN (rAbs) utilizzando vettori procariotici ed eucariotici. Il risultato indica che la proteina APN è stata riconosciuta sia dagli rAbs espressi nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO che dai mAb derivati dall'ibridoma.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yangzhou (SYXK20200041).
1. Preparazione dell'antigene della proteina APN suina
NOTA: Il ceppo pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) e le cellule APN stabilmente espresse pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 sono stati costruiti in uno studio precedente11.
- Recuperare i batteri da uno stock di glicerolo congelato e strisciare su piastre di Luria-Bertani (LB) contenenti 50 μg/mL di kanamicina (Km+) per l'isolamento di una singola colonia.
- Selezionare una singola colonia dalla piastra appena striata, coltura in 4 mL di terreno LB (10 g/L triptone, 10 g/L cloruro di sodio (NaCl) e 5 g/L di estratto di lievito, pH 7,2) integrata con Km+ (50 μg/mL), e lasciare crescere per una notte (12-16 h) agitando (178 rpm) a 37 °C.
- Diluire i batteri preparati a 1:100 in brodo fresco Km+ LB e incubare a 37 °C agitando per 2-3 ore fino a quando l'OD600 raggiunge 0,4-0,6.
- Aggiungere isopropile β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) al terreno fino a una concentrazione finale di 0,4 mM e incubare le colture per altre 10 ore a 16 °C.
- Di conseguenza, centrifugare e raccogliere i batteri utilizzando l'induzione IPTG (10.000 × g, 4 °C 15 min).
- Risospendere il pellet cellulare utilizzando 5 mL di tampone LEW (Lisi/Bilanciazione/Lavaggio) (50 mM di fosfato di sodio anidro monobasico (NaH2PO4) e 300 mM NaCl, pH 8,0) contenente 1 mg/mL di lisozima. Mescolare la sospensione batterica per 30 minuti sul ghiaccio e sonicare completamente (15 s di impulso e 20 s di spegnimento, 15 min) utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni.
- Centrifugare il lisato di cellule grezze a 4 °C e 10.000 × g per 30 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in una colonna pre-equilibrata e incubare 1-2 minuti prima del drenaggio per gravità. Ripetere questo passaggio tre volte.
- Lavare la colonna con 20 ml di tampone LEW e scaricare per gravità. Eluire la proteina APN marcata con istidina utilizzando 9 mL di tampone di eluizione (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl e 250 mM imidazolo, pH 8,0) e raccogliere nel tubo di dialisi.
- Dializzare la soluzione proteica per una notte a 4 °C in tampone bicarbonato di sodio-bicarbonato di sodio (PBS, 135 mM NaCl, 4,7 mM cloruro di potassio, 2 mM NaH 2 PO4 e 10 mM di fosfato di sodio dodecaidrato bibasico, pH7,2).
- Analizzare utilizzando un gel SDS-PAGE al 12,0% e western blotting per valutare la purezza della proteina APN.
- Caricare 5 μg di proteine in ciascun pozzetto del gel e lasciare funzionare a 110 V per 1,5 ore. Quindi, trasferire la proteina su una membrana PVDF per 50 minuti a 15 V. Determinare la concentrazione della proteina purificata utilizzando un test BCA.
2. Immunizzazione animale
- Sottocutaneo (s.c) iniettare topi femmina BALB/c, 6-8 settimane di età, con 50 μg di proteina APN o PBS (controllo negativo) miscelati con adiuvanti una volta ogni 2 settimane. Utilizzare l'adiuvante completo di Freund che contiene i micobatteri uccisi dal calore per l'immunizzazione iniziale e l'adiuvante incompleto di Freund per le vaccinazioni di richiamo. Mescolare volumi uguali di proteina APN (o PBS) e adiuvante di Freund o adiuvante di Freund incompleto, rispettivamente.
- Rilevare i titoli anticorpali contro APN nei sieri di questi topi mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico indiretto (ELISA) utilizzando una piastra di microtitolazione rivestita con 5 μg/mL di proteina APN diluita in 0,05 M PBS (pH 9,6). .
3. Tecnologia dell'ibridoma per produrre anticorpi monoclonali contro APN
- Per via intraperitoneale (i.p.) iniettare 100 μg di proteina APN nei topi selezionati per un boost finale dell'antigene.
- Tre giorni dopo, eutanasia i topi usando pentobarbital sodico (50 mg / kg, v / v, intraperitoneale) e lussazione cervicale.
- Raccogliere la milza e lavare con DMEM due volte per rimuovere il sangue e le cellule adipose. Filtrare la sospensione di cellule della milza utilizzando una griglia di rame a 200 maglie per rimuovere i detriti tissutali e raccogliere le cellule della milza utilizzando la centrifugazione (1500 × g, 10 min) per rimuovere la membrana della milza.
- Cellule SP2/0 del mieloma di topo da seme in un matraccio di 25 cm2 contenente 5 ml di DMEM integrato con siero bovino fetale al 6% (FBS) e coltura a 37 °C, atmosfera al 6% di CO2 per mantenere la vitalità cellulare. Dopo 5-6 giorni di coltura, le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza post-rianimazione e sono in fase di log di crescita. Al microscopio, le cellule sono rotonde, luminose e chiare.
- Un giorno prima dell'ibridazione, raccogliere i macrofagi dalle cavità peritoneali dei topi secondo un metodo precedentemente pubblicato12,19.
- Seminare macrofagi peritoneali ad una densità di 0,1-0,2 × 105/mL in piastre da 96 pozzetti, ciascuno contenente 100 μL di mezzo HAT (DMEM integrato con 10% FBS e 1x HAT Supplement), e incubare a 37 °C, 6 % CO2 atmosfera umidificata durante la notte.
- Per l'ibridazione, aspirare delicatamente le cellule SP2/0 con una pipetta da 8-10 flaconi e sospenderle in 10 ml di mezzo DMEM privo di siero. Lavare le celle con DMEM fresco, centrifugare (1500 × g, 10 min) due volte, quindi risospendere in 10 mL di DMEM.
- Mescolare le cellule quantificate della milza con cellule SP2/0 in un rapporto di 10:1 e trasferirle in provette da 50 ml. Centrifugare (1500 × g, 10 min) e scartare il surnatante. Raccogliere i pellet cellulari sul fondo dei tubi e picchiettare con il palmo per allentare i pellet prima dell'ibridazione.
- Aggiungere 1 mL di polietilenglicole 1500 (PEG 1500), preriscaldato a 37 °C, goccia a goccia utilizzando un contagocce al pellet cellulare allentato per un periodo di tempo di 45 s mentre si ruota delicatamente il fondo del tubo.
- Aggiungere lentamente 1 mL di DMEM preriscaldato a 37 °C alla miscela di cui sopra per un periodo di 90 s, seguito da altri 30 mL di DMEM fresco. Mettere il tubo di fusione a bagnomaria a 37 °C per 30 minuti.
- Dopo l'incubazione nel bagno caldo, raccogliere le cellule e risospenderle nel mezzo HAT. Quindi coltura in una piastra a 96 pozzetti inoculata con macrofagi peritoneali.
- Cinque giorni dopo, aggiungere 100 μL di terreno HAT fresco a ciascun pozzetto e incubare la piastra per altri 5 giorni, dopodiché sostituire il mezzo con il mezzo HT (DMEM integrato con 10% FBS e 1x HT Supplement).
- Utilizzare una piastra di microtitolazione rivestita con 5 μg/mL di proteina APN diluita in 0,05 M PBS (pH 9,6) per analizzare gli anticorpi monoclonali nell'ibridoma surnatante utilizzando il test ELISA.
- Quando il mezzo nei pozzetti della piastra a 96 pozzetti diventa giallo (a causa della crescita cellulare e del rilascio di metaboliti, il pH nel mezzo diminuisce a 6,8 e il rosso fenolo passa dal fucsia al giallo) o si osservano cluster di cellule, acquisire 100 μL di surnatante dai pozzetti selezionati e aggiungere ai pozzetti della piastra ELISA rivestita. Utilizzare un lettore di micropiastre per misurare i valori OD450.
- Utilizzare gli anticorpi policlonali contro APN e siero di topo non infetto come controllo positivo e negativo, rispettivamente, e utilizzare PBS come controllo in bianco. In questo studio, il rapporto OD450 tra campione e controllo negativo (P/N) ≥ 2,1 è stato riconosciuto come standard di selezione positivo.
- Dopo tre cicli consecutivi di selezione positiva, selezionare l'ibridoma che mostra una maggiore risposta sierologica contro la proteina APN per un test di diluizione limitato.
- Preparare i macrofagi peritoneali e il seme in piastre a 96 pozzetti come descritto in precedenza.
- Sospendere le cellule di ibridoma in mezzo HT ad una media di 0,5-2 cellule per pozzetto e coltura in un incubatore a 37 °C, 6% di CO2 . Ripetere questo passaggio tre o quattro volte fino a quando il tasso di positività indicato dal test immunologico ELISA raggiunge il 100%.
- Sotto la pressione del continuo congelamento e scongelamento, selezionare le cellule di ibridoma positivo in grado di secernere stabilmente anticorpi anti-APN e proliferare normalmente.
- Somministrare una singola iniezione i.p. di 0,3 mL di pristane a ciascun topo (8-10 settimane). A 10 giorni dalla somministrazione di materiale incontaminato, iniettare a ciascun topo 2-5 x 10 5 cellule di ibridoma in0,5 mL di PBS (pH 7,2).
- Raccogliere con cura il liquido peritoneale dalla cavità peritoneale di questi topi da 8 a 10 giorni dopo l'iniezione.
- Raccogliere i supernatanti mediante centrifugazione a 5.000 × g per 15 minuti e purificare gli anticorpi nei surnatanti utilizzando il 33% di precipitazione satura di solfato di ammonio [(NH 4) 2SO4] e agarosio di proteina A.
4. Caratterizzazione di mAbs contro la proteina APN
- Determinare il sottotipo di immunoglobuline dei mAbs raccolti utilizzando un SBA Clonotyping System-HRP20. Utilizzare SDS-PAGE e western blotting per valutare la purezza e la specificità di mAb.
- Analizzare la specificità dell'epitopo mAb rispetto alla proteina APN utilizzando ELISA21. Il valore di additività (AV) è il rapporto tra OD mAbs (a+b) e (OD mAbs-a+ODmAbs-b), che viene utilizzato per valutare se imAb riconoscono lo stesso sito antigenico; ODmAbs-a e OD mAbs-b rappresentano i valori OD450 di diversi anticorpi monoclonali contro APN da solo, e OD mAbs(a+b) rappresentano i valori OD450 di una miscela 1:1 di duemAbs contro APN.
- Valutare ogni campione almeno quattro repliche e ripetere l'intero esperimento almeno tre volte.
5. Espressione di rAbs contro APN
- Estrarre l'RNA totale dalle cellule di ibridoma sopra menzionate e dalla milza di topi immunizzati APN (ad esempio, TRIzol)22. Sintetizzare il DNA complementare (cDNA) utilizzando un kit di sintesi del cDNA secondo le istruzioni del produttore.
- Amplifica le regioni variabili di mAbs utilizzando la PCR nidificata e determina le sequenze a catena pesante (VH) e a catena leggera (VL) utilizzando il sequenziamento. Analizza i geni che codificano VH e VL utilizzando lo strumento di analisi del genoma del topo IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Combinare i geni VH e VL con le sequenze leader e subclonarli sequenzialmente rispettivamente nei vettori pET28a (+) e pIRES2-ZsGreen1, utilizzando la tecnologia di clonazione senza soluzione di continuità per consentire l'inserimento di frammenti di DNA senza cicatrici. I primer specifici sono elencati nella Tabella 1.
- Far crescere i batteri trasformati in pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 in presenza di 0,4 mM IPTG in agitatori orbitali a 37 °C per 10 ore. Quindi inducere, purificare e valutare l'espressione della proteina rAbs utilizzando la purificazione proteica di routine.
- Seminare 100 μL 0,5 x 105 cellule CHO per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti e incubare a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 6% per 18-24 ore. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, diluire il plasmide pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN con Opti-MEM a una concentrazione finale di 0,1 μg/μL e incubare 5 minuti a temperatura ambiente prima di utilizzarlo per la trasfezione.
- Mescolare delicatamente 50 μL di plasmide diluito pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN con 1 μL di Lipofectamine 2000 e 49 μL di Opti-MEM e incubare la miscela per altri 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 100 μL di miscela a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti contenente celle CHO e incubare a 37 °C in atmosfera di CO2 al 6% per 4-6 ore.
- A 4-6 ore dopo la trasfezione, sostituire il mezzo con DMEM-F12 integrato con il 10% di FBS e incubare la piastra per altre 48 ore. Quindi, aggiungere 400 μg / mL G418 a ciascun pozzetto per selezionare le celle stabilmente trasfettate.
- Dopo 10 giorni di selezione utilizzando terreno DMEM-F12 integrato con FBS al 10% e 400 μg/mL G418, ordinare le cellule (3,0 × 107 cellule/ml) mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Circa il 10-15% della popolazione cellulare era positiva.
- Cellule positive raccolte in serie, semina in media di 0,5-2 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti e coltura in un incubatore a 37 °C, 6% di CO2 . Mantenere le cellule pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO stabilmente trasfettate utilizzando la selezione con G418 (200 μg/mL).
- La concentrazione di FBS nel terreno di coltura cellulare sopra descritto diminuisce gradualmente dal 10% allo 0% durante la fase di crescita logaritmica nel periodo di tempo di 3 settimane. Quindi, adattare le cellule CHO aderenti alla crescita della sospensione in un mezzo privo di siero.
- Coltura delle cellule pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO seminate nella fase di crescita logaritmica in mezzo privo di siero ad una densità di 0,8-1,0 × 105 cellule/ml in matraccio di agitazione a 80-110 giri/min velocità di agitazione e 37°C, 6% CO2.
- Raccogliere la sospensione cellulare ogni 12 ore per determinare i cambiamenti nella vitalità e nella vitalità delle cellule utilizzando un kit di conteggio delle cellule (ad esempio, CCK-8) secondo le istruzioni del produttore.
- L'espressione anticorpale raggiunge i livelli di picco quando la vitalità cellulare diminuisce all'80% e la densità cellulare raggiunge 1,0-2,0 × 106 cellule/ml. Raccogliere i surnatanti cellulari mediante centrifugazione, filtrare utilizzando un filtro a membrana in politetrafluoroetilene da 0,22 μm e purificare utilizzando la proteina A agarosio.
- Confermare la produzione di anticorpi APN-specifici utilizzando saggi di immunofluorescenza indiretta (IFA).
- Determinare i titoli anticorpali e le affinità di legame utilizzando il test ELISA come descritto in precedenza. 23 Calcolare la costante di dissociazione all'equilibrio (valore KD ) degli anticorpi con un'equazione logistica a quattro parametri utilizzando un software.
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Representative Results
In questo studio, la proteina APN solubile purificata (2,12 mg / ml) è stata utilizzata per l'immunizzazione del topo. I topi immunizzati con la proteina APN quattro volte a intervalli di 14 giorni hanno mostrato un titolo anticorpale più elevato contro APN nei loro sieri. Sebbene siano stati ottenuti 14 ibridomi utilizzando gli esperimenti di fusione, solo 9 ibridomi sono sopravvissuti ai tre cicli continui di congelamento-disgelo, risultando in 9 cloni stabili che hanno secreto anticorpi contro APN. Tutte queste celle sono rotonde, luminose e chiare (Figura 1). I mAb purificati che possiedono catene pesanti e leggere (50 kDa e 25 kDa, rispettivamente) sono stati confermati da SDS-PAGE e trovati nell'ascite purificata (Figura 2). I titoli di questi mAb anti-APN nei surnatanti e nell'ascite di coltura sono mostrati nella Tabella 2.
Il risultato dell'isotipizzazione dei mAbs di topo ha rivelato che i mAbs derivati dai cloni 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 e 6C56 possedevano sottoclassi IgG2b, mentre APN-2A20 era un anticorpo di tipo κappa- (κ) IgG2a e mAbs APN-3FD9, -3F10 e -10F3 appartenevano al tipo IgM e trasformavano catene leggere κ (Tabella 3). Come mostrato nella Tabella 4, la maggior parte di questi mAb ha mostrato valori AV superiori al 50%, indicando che hanno preso di mira diversi epitopi nell'APN, mentre l'anticorpo APN-5C51 ha riconosciuto epitopi antigenici simili a quelli riconosciuti dai mAb APN-3C48, -5B31 e -6C56.
APN-5B36 ha mostrato un titolo anticorpale considerevolmente più elevato rispetto a quelli di altri mAb. Pertanto, il gene APN-5B36 VH-VL è stato amplificato e legato in un vettore pET28a (+) o pIRES2-ZsGreen1 per costruire rispettivamente i plasmidi di espressione ricombinante pET28a (+)-rAbs-APN e pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN (Figura 3). Gli anticorpi espressi da entrambe le cellule pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) e pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO sono stati purificati e analizzati utilizzando saggi ELISA e IFA. Tuttavia, come mostrato in Figura 4, solo l'anticorpo espresso nel surnatante delle cellule pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO ha riconosciuto la proteina APN, così come i mAbs derivati dall'ibridoma. Questo anticorpo ricombinante consisteva in catene pesanti IgG2b e catene leggere lambda e mostrava un titolo di 2,56 × 105 come determinato utilizzando ELISA. Il legame dei mAb APN-5B36 alle proteine APN ha raggiunto un equilibrio prima di rAbs (Figura 5), mostrando un valore KD di (4.232±0.475) × 10-9 e (2.201±0.367) × 10-8 mol/L, rispettivamente.
| Abbecedario | Sequenza (5'-3') | ||
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG | ||
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
Tabella 1. I primer specifici utilizzati in questo studio.
| Cellule | Titoli di surnatanti (U/mL) | Titoli di ascite (U/mL) |
| 2A20 | 0,64×104 | 3,20×105 |
| 5B31 | 1,28×104 | 1,60×105 |
| 5B36 | 0,64×104 | 1,28×106 |
| 3C48 | 0,16×104 | 0,80×105 |
| 5C51 | 0,16×104 | 0,80×104 |
| 6C56 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3FD9 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3F10 | 0,16×104 | 0,16×105 |
| 10F3 | 0,80×103 | 0,32×105 |
Tabella 2. I titoli ELISA dei mAbs APN.
| Ig | IgA | Igm | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | Kappa | Lambda | Sommario | |
| 2A20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a, Kappa |
| 5B31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b, Lambda |
| 5B36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b, Lambda |
| 3C48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b, Lambda |
| 5C51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b, Lambda |
| 6C56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b, Lambda |
| 3FD9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM, Kappa |
| 3F10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM, Kappa |
| 10F3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM, Kappa |
Tabella 3. Isotipi di APN mAbs derivati da ibridi.
| mAbs | AV (100 %) | ||||||||
| 2A20 | 5B31 | 5B36 | 3C48 | 5C51 | 6C56 | 3FD9 | 3F10 | 10F3 | |
| 2A20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5B31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5B36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3C48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5C51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6C56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3FD9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3F10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10F3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
Tabella 4. Discriminazione della specificità antigene-epitopo dei mAbs APN-specifici. Valori AV superiori a 0,5 indicano che questi due mAb riconoscono siti antigenici diversi; Valori AV inferiori a 0,5 indicano che questi due mAb riconoscono un sito antigenico simile.
Figura 1. Immagine di ibridomi. Sotto l'analisi microscopica, gli ibridomi sono rotondi, luminosi e chiari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Livelli di espressione degli anticorpi ricombinanti e ascite analizzati utilizzando SDS-PAGE. (A) corsia M, marcatore proteico; corsia 1, lisato purificato pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); corsia 2, pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) supernatante; corsia 3, liquido ascite purificato dal 33% (NH 4)2SO4 precipitazioni. (B) corsia M, marcatore proteico; corsia 1, liquido ascite purificato con la proteina A agarosio. In questo test, 3-5 μg di proteine totali sono stati caricati in ciascuna corsia del gel. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. I plasmidi di espressione ricombinante pET28a (+)-rAbs-APN e pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio. Lane M, Trans 2K più marcatore del DNA; corsia 1, vettore pET28a (+) (5369 bp); corsia 2 e 5, gene VH-VL combinato con sequenza leader APN-5B36; corsia 3, plasmide pET28a (+)-rAbs-APN espresso in BL21 (DE3) E. coli; corsia 4, vettore pIRES2-ZsGreen1 (5283 bp); corsia 6, plasmide pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN espresso in DH5α E. coli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Espressione della proteina anticorpale ricombinante e dell'ascite analizzata mediante immunofluorescenza indiretta. Le cellule pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 (fluorescenza verde) che esprimono stabilmente APN sono state trattate con (A) PBS, usato come trattamento di controllo; (B) proteina purificata espressa da pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); (C) anticorpo policlonale APN (1:500); D) liquido di ascite purificato (1:500); E) surnatante purificato ottenuto da cellule pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO (1:500). DAPI è stato utilizzato come controcolorante nucleare nella microscopia confocale. Le cellule incubate con l'anticorpo secondario IgG anti-topo coniugato DyLight 549 (1:200) e trattate con ascite purificata e surnatante purificato da cellule pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO hanno mostrato un robusto segnale di fluorescenza rossa indicativo come l'anticorpo policlonale APN. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5. Determinazione delle affinità di legame relative agli anticorpi mediante ELISA22. L'assorbimento di campioni contenenti APN-5B36 mAbs o rAbs, in assenza e presenza di proteina APN, è stato misurato alla lunghezza d'onda di 450 nm. La curva di legame è stata tracciata utilizzando una curva logistica a quattro parametri; L'asse X mostra la concentrazione logaritmica degli anticorpi e l'asse Y mostra l'assorbanza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'induzione dell'immunità mucosale è uno degli approcci più efficaci nel contrastare gli agenti patogeni e nella prevenzione e nel trattamento di varie malattie. L'APN, una proteina legata alla membrana altamente espressa nella mucosa intestinale, è coinvolta nell'induzione della risposta immunitaria adattativa e nell'endocitosi virale e batterica mediata dai recettori 1,5,8. APN è usato come antigene particolato in molti formati di carico dell'antigene e consegna del vaccino. La somministrazione orale di anticorpi mirati all'APN può anche suscitare risposte immunitarie efficaci 18,24,25. Tuttavia, gli anticorpi monoclonali che colpiscono diversi epitopi specifici dell'APN richiedono ulteriori indagini.
I metodi qui descritti sono stati impiegati per produrre anticorpi monoclonali contro APN utilizzando sia l'ibridoma tradizionale che le tecnologie ricombinanti. Questo approccio può essere utilizzato nella produzione di altri mAb. In primo luogo, abbiamo seguito un protocollo precedentemente menzionato per ottenere nove mAb derivati da diversi cloni di ibridoma. Sebbene i titoli di questi mAb nei surnatanti cellulari e nell'ascite fossero diversi, tutti i mAb contenevano la catena pesante da 50 kDa e la catena leggera da 25 kDa e mostravano un legame specifico con la proteina APN suina. I risultati dell'isotipizzazione e dell'identificazione degli epitopi dell'antigene hanno mostrato che la maggior parte dei mAb mirava a diversi epitopi e apparteneva a diversi tipi di anticorpi. Questi risultati indicano che la tecnologia tradizionale dell'ibridoma rimane una scelta efficace nella produzione di mAbs.
Gli approcci utilizzati per la produzione di anticorpi ricombinanti possono aumentare l'efficienza della produzione di mAb e ridurre al minimo i costi associati al lavoro e al tempo. Pertanto, questi approcci sono cresciuti in popolarità, specialmente nello sviluppo di anticorpi per applicazioni diagnostiche e terapeutiche16,17,26. Gli rAb mostrano diversi vantaggi rispetto ai mAb derivati dall'ibridoma. In primo luogo, gli rAbs possono essere prodotti in vitro clonando geni anticorpali in vettori di espressione, eliminando così l'uso animale nella produzione di anticorpi. Inoltre, l'utilizzo di sistemi di espressione eucariotica o procariotica per produrre rAbs si traduce in basse variazioni da lotto a lotto e aumenta l'affidabilità e la stabilità del prodotto finale. Al contrario, i mAb prodotti utilizzando gli ibridomi spesso non riconoscono o non si legano agli epitopi dell'antigene bersaglio e sono influenzati dalla deriva della linea cellulare dell'ibridoma, dalla contaminazione e dalla perdita e dalle mutazioni geniche. Attualmente, i mAb derivati da ibridoma sono utilizzati principalmente in immunoreagenti diagnostici o terapeutici, evidenziando la necessità di produrre anticorpi stabili e affidabili in un periodo di produzione limitato. Per applicazioni diagnostiche e terapeutiche, la tecnologia degli anticorpi ricombinanti è una scelta migliore rispetto all'approccio tradizionale basato sull'ibridoma. Questo perché la tecnologia degli anticorpi ricombinanti ci consente di modificare la sequenza di rAbs per cambiare gli isotipi delle immunoglobuline, aumentando così la specificità di legame dell'anticorpo14,16,17.
In questo studio, abbiamo utilizzato la tecnologia di ingegneria anticorpale per ottenere anticorpi ricombinanti mirati all'APN. Abbiamo scoperto che sia le milze dei topi immunizzati che le cellule di ibridoma erano altrettanto efficaci per amplificare le sequenze di mAb a catena pesante e leggera. L'anticorpo espresso da pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) non ha riconosciuto efficacemente APN né nei saggi ELISA né in quelli di immunofluorescenza indiretta. Tuttavia, gli rAbs espressi dalla sospensione cellulare pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO e dai mAbs derivati dall'ibridoma hanno riconosciuto e legato efficacemente la proteina APN. I metodi descritti in questo studio possono essere utilizzati per sviluppare ADC basati su anticorpi APN e altri prodotti terapeutici mirati a diversi epitopi specifici APN. Questo studio aiuterà anche a chiarire ulteriormente il ruolo dell'APN nella prevenzione e nel trattamento di varie malattie. Tuttavia, le strategie per migliorare l'affinità e la resa dei rAbs richiedono ulteriori indagini.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi. Tutti gli autori hanno approvato e dato il loro esplicito consenso alla pubblicazione del manoscritto.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla Chinese National Science Foundation Grant (n. 32072820, 31702242), dalle sovvenzioni della borsa di studio del governo di Jiangsu per gli studi all'estero (JS20190246) e High-level Talents of Yangzhou University Scientific Research Foundation, un progetto fondato dal Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
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