Summary
La proteína de anticuerpo recombinante expresada en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO y anticuerpos monoclonales producidos utilizando la tecnología tradicional de hibridoma puede reconocer y unirse a la proteína N aminopeptidasa porcina (APN).
Abstract
La aminopeptidasa porcina N (APN), una metalopeptidasa unida a la membrana abundantemente presente en la mucosa del intestino delgado, puede iniciar una respuesta inmune de la mucosa sin ninguna interferencia, como baja expresión de proteínas, inactividad enzimática o cambios estructurales. Esto hace que APN sea un candidato atractivo en el desarrollo de vacunas que se dirigen selectivamente al epitelio de la mucosa. Estudios previos han demostrado que la APN es una proteína receptora tanto para la Escherichia coli enterotoxigénica (E. coli) F4 como para el virus de la gastroenteritis transmisible. Por lo tanto, APN se muestra prometedora en el desarrollo de conjugados anticuerpo-fármaco o nuevas vacunas basadas en anticuerpos específicos de APN. En este estudio, comparamos la producción de anticuerpos monoclonales específicos de APN (mAbs) utilizando la tecnología tradicional de hibridoma y el método de expresión de anticuerpos recombinantes. También establecimos una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) transfectada de manera estable utilizando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN y una cepa BL21 (DE3) de expresión de E. coli que alberga el vector pET28a (+)-rAbs-APN. Los resultados muestran que los anticuerpos expresados en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO y mAbs producidos mediante hibridomas podrían reconocer y unirse a la proteína APN. Esto proporciona la base para una mayor elucidación de la función del receptor de APN para el desarrollo de terapias dirigidas a diferentes epítopos específicos de APN.
Introduction
La aminopeptidasa N (APN), una enzima moonlighting que pertenece a la familia de la metaloproteinasa M1, actúa como marcador tumoral, receptor y molécula de señalización a través de vías dependientes de enzimas e independientes de enzimas 1,2. Además de escindir los residuos de aminoácidos N-terminales de varios péptidos bioactivos para la regulación de su actividad biológica, APN juega un papel importante en la patogénesis de diversas enfermedades inflamatorias. La NPA participa en el procesamiento y presentación de antígenos por péptidos recortados que se unen estrechamente a las principales moléculas del complejo de histocompatibilidad de clase II 2,3. La NPA también ejerce efectos antiinflamatorios al unirse con receptores acoplados a proteínas G que participan en la transducción de señales múltiples, modulando la secreción de citoquinas y contribuyendo a la fagocitosis mediada por el receptor gamma Fc en la respuesta inmune 4,5,6,7.
Como exopeptidasa unida a la membrana ampliamente distribuida, la NPA es abundante en la mucosa del intestino delgado porcino y está estrechamente asociada con la endocitosis mediada por receptores 1,5,8. La NPA reconoce y se une a la proteína espiga del virus de la gastroenteritis transmisible para la entrada celular, e interactúa directamente con la subunidad FaeG de las fimbrias enterotoxigénicas Escherichia coli F4 para afectar la adherencia bacteriana con las células huésped 9,10,11. Por lo tanto, la NPA es una potencial diana terapéutica en el tratamiento de enfermedades infecciosas virales y bacterianas.
Desde el desarrollo de la tecnología de hibridoma y otras estrategias para la producción de anticuerpos monoclonales (mAbs) en 1975, los mAbs se han utilizado ampliamente en inmunoterapia, administración de fármacos y diagnóstico12,13,14. Actualmente, los mAbs se utilizan con éxito para tratar enfermedades como el cáncer, la enfermedad inflamatoria intestinal y la esclerosis múltiple12,15. Debido a su fuerte afinidad y especificidad, los mAbs pueden ser objetivos ideales en el desarrollo de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) o nuevas vacunas16,17. La proteína APN es crítica para la entrega selectiva de antígenos a células específicas, y puede provocar una respuesta inmune de la mucosa específica y fuerte contra patógenos sin ninguna interferencia, incluida la baja expresión de proteínas, la inactividad enzimática o los cambios estructurales 5,8,18. Por lo tanto, los productos terapéuticos basados en mAbs específicos de APN son prometedores contra las infecciones bacterianas y virales. En este estudio, describimos la producción de mAbs específicos de APN utilizando tecnología de hibridoma y la expresión de anticuerpos recombinantes anti-APN (rAbs) utilizando vectores procariotas y eucariotas. El resultado indica que la proteína APN fue reconocida tanto por rAbs expresados en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO como por mAbs derivadas de hibridomas.
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Protocol
Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yangzhou (SYXK20200041).
1. Preparación del antígeno de la proteína APN porcina
NOTA: La cepa pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) y las células APN expresadas establemente pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 fueron construidas en un estudio previo11.
- Recuperar bacterias de una cepa de glicerol congelada y rayar en placas de Luria-Bertani (LB) que contienen 50 μg / ml de kanamicina (Km+) para el aislamiento de colonias individuales.
- Seleccionar una sola colonia de la placa recién rayada, cultivar en 4 mL de medio LB (10 g/L triptona, 10 g/L de cloruro de sodio (NaCl) y 5 g/L de extracto de levadura, pH 7.2) suplementado con Km+ (50 μg/mL), y dejar crecer durante la noche (12-16 h) con agitación (178 rpm) a 37 °C.
- Diluir las bacterias preparadas a 1:100 en caldo fresco Km+ LB e incubar a 37 °C agitando durante 2-3 h hasta que el OD600 alcance 0,4-0,6.
- Añadir isopropil β-d-1-tiogalactopiranosido (IPTG) al medio hasta una concentración final de 0,4 mM, e incubar los cultivos durante 10 h adicionales a 16 °C.
- En consecuencia, centrifugar y cosechar las bacterias mediante inducción IPTG (10.000 × g, 4 °C 15 min).
- Resuspender el pellet celular utilizando 5 mL de tampón LEW (Lisis/Equilibrio/Lavado) (50 mM fosfato sódico anhidro monobásico (NaH2PO4) y 300 mM NaCl, pH 8.0) que contiene 1 mg/ml lisozima. Revuelva la suspensión bacteriana durante 30 minutos sobre hielo y sonicar completamente (15 s pulso y 20 s apagado, 15 min) usando un homogeneizador ultrasónico.
- Centrifugar el lisado de células crudas a 4 °C y 10.000 × g durante 30 min para eliminar los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a una columna preequilibrada e incube 1-2 minutos antes del drenaje por gravedad. Repita este paso tres veces.
- Lave la columna con 20 ml de tampón LEW y drene por gravedad. Eluya la proteína APN marcada con histidina, utilizando 9 ml de tampón de elución (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl y 250 mM de imidazol, pH 8.0) y recoja en un tubo de diálisis.
- Dializar la solución proteica durante la noche a 4 °C en tampón carbonato de sodio-bicarbonato sódico (PBS, 135 mM NaCl, 4,7 mM cloruro de potasio, 2 mMNaH2PO4 y 10 mM dodecahidrato fosfato sódico dibásico, pH 7,2).
- Analizar utilizando un gel SDS-PAGE al 12,0% y Western blotting para evaluar la pureza de la proteína APN.
- Cargue 5 μg de proteína en cada pocillo del gel y deje correr a 110 V durante 1,5 h. Luego, transfiera la proteína a una membrana de PVDF durante 50 minutos a 15 V. Determine la concentración de la proteína purificada mediante un ensayo de BCA.
2. Inmunización animal
- Subcutáneos (s.c) inyectan ratones hembra BALB/c, de 6 a 8 semanas de edad, con 50 μg de proteína APN o PBS (control negativo) mezclado con adyuvantes una vez cada 2 semanas. Use el adyuvante de Freund completo que contiene las micobacterias muertas por calor para la inmunización inicial, y el adyuvante de Freund incompleto para las vacunas de refuerzo. Mezcle volúmenes iguales de proteína APN (o PBS) y adyuvante de Freund o adyuvante de Freund incompleto, respectivamente.
- Detectar títulos de anticuerpos contra APN en sueros de estos ratones mediante ensayo indirecto de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA) utilizando una placa de microtitulación recubierta con 5 μg/ml de proteína APN diluida en 0,05 M PBS (pH 9,6). .
3. Tecnología de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales contra APN
- Intraperitoneally (i.p.) inyectar 100 μg de proteína APN en los ratones seleccionados para un refuerzo final del antígeno.
- Tres días después, eutanasia a los ratones usando pentobarbital sódico (50 mg / kg, v / v, intraperitoneal) y luxación cervical.
- Recoja los bazos y lávese con DMEM dos veces para eliminar la sangre y las células grasas. Filtre la suspensión de células de bazo con una rejilla de cobre de malla 200 para eliminar los restos de tejido y recolecte las células del bazo mediante centrifugación (1500 × g, 10 min) para eliminar la membrana del bazo.
- Células de mieloma de ratón SP2/0 en un matraz de 25 cm2 que contiene 5 ml de DMEM suplementado con 6% de suero fetal bovino (FBS) y cultivo a 37 °C, 6% deCO2 atmósfera para mantener la viabilidad celular. Después de 5-6 días de cultivo, las células alcanzan el 80%-90% de confluencia después de la reanimación y están en fase de registro de crecimiento. Bajo el microscopio, las células son redondas, brillantes y claras.
- Un día antes de la hibridación, recolectar macrófagos de cavidades peritoneales de los ratones de acuerdo con un método previamente publicado12,19.
- Macrófagos peritoneales de semilla a una densidad de 0.1-0.2 × 105/mL en placas de 96 pocillos, cada pocillo conteniendo 100 μL de medio HAT (DMEM suplementado con 10% FBS y 1x suplemento de HAT), e incubar a 37 °C, 6 % deCO2 en atmósfera humidificada durante la noche.
- Para la hibridación, aspire suavemente las células SP2/0 con una pipeta de 8-10 botellas y suspenda en 10 ml de medio DMEM sin suero. Lave las celdas con DMEM fresco, centrifugar (1500 × g, 10 min) dos veces y luego vuelva a suspender en 10 ml de DMEM.
- Mezclar las células cuantificadas del bazo con células SP2/0 en una proporción de 10:1 y transferir a tubos de 50 ml. Centrifugar (1500 × g, 10 min) y desechar el sobrenadante. Recoja los gránulos celulares en la parte inferior de los tubos y golpee con la palma de la mano para aflojar los gránulos antes de la hibridación.
- Añadir 1 ml de polietilenglicol 1500 (PEG 1500), precalentado a 37 °C, gotero a gotero en el pellet de celda aflojado durante el período de 45 s mientras gira suavemente el fondo del tubo.
- Agregue lentamente 1 ml de DMEM precalentado a 37 °C a la mezcla anterior durante el período de 90 s, seguido de otros 30 ml de DMEM fresco. Coloque el tubo de fusión en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.
- Después de la incubación en el baño caliente, cosechar las células y volver a suspender en medio HAT. Luego cultivo en una placa de 96 pocillos inoculada con macrófagos peritoneales.
- Cinco días después, agregue 100 μL de medio HAT fresco a cada pocillo e incube la placa durante 5 días adicionales, después de lo cual reemplace el medio con medio HT (DMEM suplementado con 10% FBS y 1x suplemento HT).
- Utilice una placa de microtitulación recubierta con 5 μg/ml de proteína APN diluida en 0,05 M PBS (pH 9,6) para analizar anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de hibridoma mediante ensayo ELISA.
- Cuando el medio en los pocillos de la placa de 96 pocillos se vuelve amarillo (debido al crecimiento celular y la liberación de metabolitos, el pH en el medio disminuye a 6.8, y el rojo fenol cambia de fucsia a amarillo) o se observan grupos de células, adquiera 100 μL de sobrenadante de los pocillos seleccionados y agregue a los pocillos de la placa ELISA recubierta. Utilice un lector de microplacas para medir los valores OD450.
- Utilice los anticuerpos policlonales contra APN y suero de ratón no infectado como control positivo y negativo, respectivamente, y use PBS como control en blanco. En este estudio, la relación OD450 de muestra a control negativo (P/N) ≥ 2,1 fue reconocida como estándar de selección positiva.
- Después de tres rondas consecutivas de selección positiva, seleccione el hibridoma que muestra una mayor respuesta serológica contra la proteína APN para un ensayo de dilución limitada.
- Prepare macrófagos peritoneales y semillas en placas de 96 pocillos como se describió anteriormente.
- Suspender células de hibridoma en medio HT a un promedio de 0,5-2 células por pocillo y cultivo en una incubadora de 37 °C, 6% de CO2 . Repita este paso tres o cuatro veces hasta que la tasa de positivos indicada por el inmunoensayo ELISA alcance el 100%.
- Bajo la presión de congelación y descongelación continuas, seleccione las células de hibridoma positivas capaces de secretar de manera estable anticuerpos anti-APN y proliferar normalmente.
- Administrar una única inyección i.p. de 0,3 ml de pristano a cada ratón (8-10 semanas). A los 10 días después de recibir prístino, inyecte a cada ratón 2-5 x 10 5 células de hibridoma en0,5 ml de PBS (pH 7,2).
- Recoja cuidadosamente el líquido peritoneal de la cavidad peritoneal de estos ratones de 8 a 10 días después de la inyección.
- Cosechar los sobrenadantes por centrifugación a 5.000 × g durante 15 minutos, y purificar los anticuerpos en los sobrenadantes utilizando sulfato de amonio saturado al 33% [(NH 4)2SO4] precipitación y proteína A agarosa.
4. Caracterización de mAbs frente a proteína APN
- Determinar el subtipo de inmunoglobulina de los mAbs recolectados utilizando un Sistema de Clonotipado SBA-HRP20. Use SDS-PAGE y Western blot para evaluar la pureza y especificidad de mAb.
- Analizar la especificidad del epítopo mAb contra la proteína APN utilizando ELISA21. El valor de aditividad (AV) es la relación entre OD mAbs (a+b) y (OD mAbs-a+ODmAbs-b), que se utiliza para evaluar si los mAbs reconocen el mismo sitio antigénico; OD mAbs-a y ODmAbs-b representan los valores de OD450 de diferentes anticuerpos monoclonales contra APN solo, yOD mAbs(a + b) representan los valores de OD450 de una mezcla 1: 1 de dos mAbs contra APN.
- Evalúe cada muestra al menos cuatro réplicas y repita todo el experimento al menos tres veces.
5. Expresión de rAbs contra APN
- Extraer ARN total de las células de hibridoma y bazo mencionadas anteriormente de ratones inmunizados con APN (por ejemplo, TRIzol)22. Sintetice ADN complementario (ADNc) utilizando un kit de síntesis de ADNc según las instrucciones del fabricante.
- Amplíe regiones variables de mAbs mediante PCR anidada y determine secuencias de cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) mediante secuenciación. Analice los genes que codifican VH y VL utilizando la herramienta de análisis del genoma del ratón IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Combine los genes VH y VL con secuencias líderes y subclónelos secuencialmente en los vectores pET28a (+) y pIRES2-ZsGreen1, respectivamente, utilizando tecnología de clonación sin fisuras para permitir la inserción de fragmentos de ADN sin cicatrices. Los cebadores específicos se enumeran en la Tabla 1.
- Cultivar la bacteria transformada pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 en presencia de 0,4 mM de IPTG en agitadores orbitales a 37 °C durante 10 h. Luego induzca, purifique y evalúe la expresión de la proteína rAbs utilizando la purificación rutinaria de proteínas.
- Sembrar 100 μL 0,5 x 105 células CHO por pocillo en una placa de 96 pocillos e incubar a 37 °C en una atmósfera deCO2 al 6% durante 18-24 h. Cuando las células alcancen el 80-90% de confluencia, diluir el plásmido pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN con Opti-MEM a una concentración final de 0,1 μg/μL, e incubar 5 min a temperatura ambiente antes de usarlo para la transfección.
- Mezclar suavemente 50 μL de plásmido pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN diluido con 1 μL de lipofectamina 2000 y 49 μL de Opti-MEM, e incubar la mezcla durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente. Añadir 100 μL de mezcla a cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contenga células CHO e incubar a 37 °C en atmósfera deCO2 al 6% durante 4-6 h.
- A las 4-6 h después de la transfección, reemplace el medio con medio DMEM-F12 suplementado con 10% de FBS e incube la placa durante otras 48 h. Luego, agregue 400 μg / ml de G418 a cada pocillo para seleccionar las células transfectadas de manera estable.
- Después de 10 días de selección utilizando medio DMEM-F12 suplementado con 10% FBS y 400 μg/mL G418, clasifique las células (3.0 × 107 células/mL) por clasificación celular activada por fluorescencia. Aproximadamente el 10-15% de la población celular fue positiva.
- Diluir en serie las células positivas cosechadas, sembrar a un promedio de 0.5-2 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y cultivar en una incubadora de 37 °C, 6% deCO2 . Mantener las células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO transfectadas de forma estable mediante selección con G418 (200 μg/ml).
- La concentración de FBS en el medio de cultivo celular descrito anteriormente disminuye gradualmente del 10% al 0% durante la fase de crecimiento logarítmico durante el período de tiempo de 3 semanas. Luego, adapte las células CHO adherentes al crecimiento en suspensión en un medio libre de suero.
- Cultivar las células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO sembradas en la fase de crecimiento logarítmico en medio libre de suero a una densidad de 0,8-1,0 × 105 células/ml en matraces de batido a una velocidad de agitación de 80-110 rpm y 37°C, 6% deCO2.
- Recoja la suspensión celular cada 12 h para determinar los cambios en la viabilidad y vitalidad celular utilizando un kit de conteo celular (por ejemplo, CCK-8) según las instrucciones del fabricante.
- La expresión de anticuerpos alcanza niveles máximos cuando la viabilidad celular disminuye al 80% y la densidad celular alcanza 1.0-2.0 × 106 células / ml. Recolectar sobrenadantes celulares mediante centrifugación, filtrar con un filtro de membrana de politetrafluoroetileno de 0,22 μm y purificar con agarosa de proteína A.
- Confirmar la producción de anticuerpos específicos de APN mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA).
- Determinar los títulos de anticuerpos y las afinidades de unión mediante el ensayo ELISA como se describió anteriormente. 23 Calcular la constante de disociación de equilibrio (valor KD ) de los anticuerpos con una ecuación logística de cuatro parámetros utilizando software.
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Representative Results
En este estudio, la proteína APN soluble purificada (2,12 mg/ml) se utilizó para la inmunización con ratones. Los ratones inmunizados con la proteína APN cuatro veces a intervalos de 14 días exhibieron un título de anticuerpos más alto contra APN en sus sueros. Aunque se obtuvieron 14 hibridomas utilizando los experimentos de fusión, solo 9 hibridomas sobrevivieron a los tres ciclos continuos de congelación-descongelación, lo que resultó en 9 clones estables que secretaron anticuerpos contra APN. Todas estas celdas son redondas, brillantes y claras (Figura 1). Los mAbs purificados que poseen cadenas pesadas y ligeras (50 kDa y 25 kDa, respectivamente) fueron confirmados por SDS-PAGE y encontrados en la ascitis purificada (Figura 2). Los títulos de estos mAbs anti-APN en sobrenadantes de cultivo y ascitis se muestran en la Tabla 2.
El resultado del isotipado de mAbs en ratones reveló que los mAbs derivados de los clones 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 y 6C56 poseían subclases de IgG2b, mientras que APN-2A20 era un anticuerpo de tipo κappa- (κ) de IgG2a, y los mAbs APN-3FD9, -3F10 y -10F3 pertenecían al tipo IgM y procesaban cadenas ligeras κ (Tabla 3). Como se muestra en la Tabla 4, la mayoría de estos mAbs mostraron valores AV superiores al 50%, lo que indica que se dirigieron a diferentes epítopos en el APN, mientras que el anticuerpo APN-5C51 reconoció epítopos antigénicos similares a los reconocidos por APN-3C48, -5B31 y -6C56 mAbs.
APN-5B36 mostró un título de anticuerpos considerablemente más alto en comparación con los de otros mAbs. Por lo tanto, el gen APN-5B36 VH-VL se amplificó y ligó en un vector pET28a (+) o pIRES2-ZsGreen1 para construir los plásmidos de expresión recombinante pET28a (+)-rAbs-APN y pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN, respectivamente (Figura 3). Los anticuerpos expresados por las células pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) y pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO se purificaron y analizaron mediante ensayos ELISA e IFA. Sin embargo, como se muestra en la Figura 4, solo el anticuerpo expresado en el sobrenadante de las células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO reconoció la proteína APN, al igual que los mAbs derivados del hibridoma. Este anticuerpo recombinante consistió en cadenas pesadas IgG2b y cadenas ligeras lambda, y mostró un título de 2,56 × 105 según lo determinado mediante ELISA. La unión de APN-5B36 mAbs a las proteínas APN alcanzó un equilibrio antes que rAbs (Figura 5), mostrando un valor KD de (4.232±0.475) × 10-9 y (2.201±0.367) × 10-8 mol/L, respectivamente.
| Cebador | Secuencia (5'-3') | ||
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG | ||
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
Tabla 1. Los cebadores específicos utilizados en este estudio.
| Células | Títulos de sobrenadantes (U/mL) | Títulos de ascitis (U/mL) |
| 2A20 | 0,64×104 | 3.20×105 |
| 5B31 | 1.28×104 | 1.60×105 |
| 5B36 | 0,64×104 | 1.28×106 |
| 3C48 | 0,16×104 | 0,80×105 |
| 5C51 | 0,16×104 | 0,80×104 |
| 6C56 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3FD9 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3F10 | 0,16×104 | 0,16×105 |
| 10F3 | 0,80×103 | 0,32×105 |
Tabla 2. Los títulos ELISA de APN mAbs.
| Ig | IgA | Igm | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | Kappa | Lambda | Resumen | |
| 2A20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a, Kappa |
| 5B31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b, Lambda |
| 5B36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b, Lambda |
| 3C48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b, Lambda |
| 5C51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b, Lambda |
| 6C56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b, Lambda |
| 3FD9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM, Kappa |
| 3F10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM, Kappa |
| 10F3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM, Kappa |
Tabla 3. Isotipos de aPn mAbs derivados de hibridomas.
| mAbs | AV (100 %) | ||||||||
| 2A20 | 5B31 | 5B36 | 3C48 | 5C51 | 6C56 | 3FD9 | 3F10 | 10F3 | |
| 2A20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5B31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5B36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3C48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5C51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6C56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3FD9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3F10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10F3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
Tabla 4. Discriminación de la especificidad antígeno-epítopo de mAbs específicos de APN. Los valores AV superiores a 0,5 indican que estos dos mAbs reconocen diferentes sitios antigénicos; Los valores AV inferiores a 0,5 indican que estos dos mAbs reconocen un sitio antigénico similar.
Figura 1. Imagen de hibridomas. Bajo análisis microscópico, los hibridomas son redondos, brillantes y claros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Niveles de expresión de anticuerpos recombinantes y ascitis analizados mediante SDS-PAGE. (A) Carril M, marcador de proteína; carril 1, lisado purificado de pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); carril 2, sobrenadante pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); carril 3, líquido de ascitis purificado en un 33% (NH 4)2SO4 de precipitación. (B) Carril M, marcador de proteína; carril 1, líquido de ascitis purificado usando proteína A agarosa. En este ensayo, se cargaron 3-5 μg de proteína total en cada carril del gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Plásmidos de expresión recombinante pET28a (+)-rAbs-APN y pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN analizados mediante electroforesis en gel de agarosa. Carril M, Trans 2K más marcador de ADN; carril 1, vector pET28a (+) (5369 pb); carril 2 y 5, gen VH-VL combinado con la secuencia líder APN-5B36; carril 3, plásmido pET28a (+)-rAbs-APN expresado en BL21 (DE3) E. coli; carril 4, vector pIRES2-ZsGreen1 (5283 pb); carril 6, plásmido pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN expresado en DH5α E. coli. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Expresión de proteínas de anticuerpos recombinantes y ascitis analizada mediante inmunofluorescencia indirecta. Las células pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 (fluorescencia verde) que expresan APN de manera estable se trataron con (A) PBS, utilizado como tratamiento de control; (B) proteína purificada expresada por pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); C) anticuerpo policlonal APN (1:500); (D) líquido de ascitis purificado (1:500); E) sobrenadante purificado obtenido a partir de células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO (1:500). DAPI se utilizó como contratinción nuclear en microscopía confocal. Las células incubadas con el anticuerpo secundario IgG de cabra conjugado con DyLight 549 (1:200) y tratadas con ascitis purificada y sobrenadante purificado de células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO mostraron una señal robusta de fluorescencia roja indicativa como lo hizo el anticuerpo policlonal APN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Determinación de las afinidades relativas de unión de anticuerpos mediante el ELISA22. La absorción de muestras que contienen APN-5B36 mAbs o rAbs, en ausencia y presencia de proteína APN, se midió a una longitud de onda de 450 nm. La curva de unión se trazó utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros; El eje X muestra la concentración logarítmica de anticuerpos, y el eje Y muestra la absorbancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La inducción de la inmunidad de la mucosa es uno de los enfoques más efectivos para contrarrestar los patógenos y en la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades. La NPA, una proteína unida a la membrana altamente expresada en la mucosa intestinal, está implicada en la inducción de la respuesta inmune adaptativa y en la endocitosis viral y bacteriana mediada por receptores 1,5,8. La NPA se utiliza como partícula de antígeno en muchos formatos de carga de antígenos y administración de vacunas. La administración oral de anticuerpos dirigidos a APN también puede provocar respuestas inmunes efectivas 18,24,25. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales dirigidos a diferentes epítopos específicos de APN requieren más investigación.
Los métodos descritos aquí se emplearon para producir anticuerpos monoclonales contra APN utilizando tanto el hibridoma tradicional como las tecnologías recombinantes. Este enfoque se puede utilizar en la producción de otros mAbs. En primer lugar, seguimos un protocolo mencionado anteriormente para obtener nueve mAbs derivados de diferentes clones de hibridomas. Aunque los títulos de estos mAbs en sobrenadantes celulares y ascitis fueron diferentes, todos los mAbs contenían la cadena pesada de 50 kDa y la cadena ligera de 25 kDa y mostraron una unión específica con la proteína APN porcina. Los resultados del isotipado y la identificación de epítopos de antígenos mostraron que la mayoría de los mAbs se dirigieron a diferentes epítopos y pertenecían a diferentes tipos de anticuerpos. Estos resultados indican que la tecnología tradicional de hibridoma sigue siendo una opción efectiva en la producción de mAbs.
Los enfoques utilizados para la producción de anticuerpos recombinantes pueden aumentar la eficiencia de la producción de mAb y minimizar los costos asociados con la mano de obra y el tiempo. Por lo tanto, estos enfoques han crecido en popularidad, especialmente en el desarrollo de anticuerpos para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas16,17,26. Los rAbs muestran varias ventajas sobre los mAbs derivados del hibridoma. En primer lugar, los rAbs pueden producirse in vitro clonando genes de anticuerpos en vectores de expresión, eliminando así el uso animal en la producción de anticuerpos. Además, el uso de sistemas de expresión eucariotas o procariotas para producir rAbs da como resultado bajas variaciones de lote a lote y aumenta la confiabilidad y estabilidad del producto final. Por el contrario, los mAbs producidos mediante hibridomas a menudo no reconocen ni se unen a los epítopos del antígeno objetivo, y se ven afectados por la deriva de la línea celular del hibridoma, la contaminación y la pérdida y mutaciones genéticas. Actualmente, los mAbs derivados de hibridoma se utilizan principalmente en inmunorreactivos diagnósticos o terapéuticos, lo que destaca la necesidad de producir anticuerpos estables y confiables en un período de producción limitado. Para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas, la tecnología de anticuerpos recombinantes es una mejor opción que el enfoque tradicional basado en el hibridoma. Esto se debe a que la tecnología de anticuerpos recombinantes nos permite modificar la secuencia de rAbs para cambiar los isotipos de inmunoglobulina, aumentando así la especificidad de unión del anticuerpo14,16,17.
En este estudio, utilizamos tecnología de ingeniería de anticuerpos para obtener anticuerpos recombinantes dirigidos a APN. Encontramos que tanto el bazo de ratones inmunizados como las células de hibridoma fueron igualmente efectivos para amplificar las secuencias de cadena pesada y ligera de mAb. El anticuerpo expresado por pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) no reconoció eficazmente la APN ni en ELISA ni en ensayos de inmunofluorescencia indirecta. Sin embargo, los rAbs expresados por la suspensión celular pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO y los mAbs derivados de hibridoma reconocieron y se unieron eficazmente a la proteína APN. Los métodos descritos en este estudio se pueden utilizar para desarrollar ADC basado en anticuerpos APN y otros productos terapéuticos dirigidos a diferentes epítopos específicos de APN. Este estudio también ayudará a aclarar aún más el papel de la NPA en la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades. Sin embargo, las estrategias para mejorar la afinidad y el rendimiento de los rAbs requieren más investigación.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Todos los autores aprobaron y dieron su consentimiento explícito para la publicación del manuscrito.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Beca de la Fundación Nacional de Ciencias de China (No. 32072820, 31702242), subvenciones de la Beca del Gobierno de Jiangsu para Estudios en el Extranjero (JS20190246) y Talentos de Alto Nivel de la Fundación de Investigación Científica de la Universidad de Yangzhou, un proyecto fundado por el Programa Académico Prioritario de Desarrollo de la Institución de Educación Superior de Jiangsu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
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