Summary
Det rekombinante antistofprotein udtrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og monoklonale antistoffer produceret ved hjælp af traditionel hybridomteknologi kan genkende og binde til svineaminopeptidase N (APN) proteinet.
Abstract
Porcinaminopeptidase N (APN), en membranbundet metallopeptidase, der er rigeligt til stede i tyndtarmens slimhinde, kan initiere et slimhindeimmunrespons uden interferens, såsom lavt proteinekspression, enzyminaktivitet eller strukturelle ændringer. Dette gør APN til en attraktiv kandidat i udviklingen af vacciner, der selektivt målretter mod slimhindepitelet. Tidligere undersøgelser har vist, at APN er et receptorprotein for både enterotoksinfremkaldende Escherichia coli (E. coli) F4 og overførbar gastroenteritisvirus. APN viser således løfte i udviklingen af antistof-lægemiddelkonjugater eller nye vacciner baseret på APN-specifikke antistoffer. I denne undersøgelse sammenlignede vi produktionen af APN-specifikke monoklonale antistoffer (mAbs) ved hjælp af traditionel hybridomteknologi og rekombinant antistofekspressionsmetode. Vi etablerede også en stabilt transfekteret kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinje ved hjælp af pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN og en E. coli-ekspression BL21 (DE3) stamme, der huser pET28a (+)-rAbs-APN-vektoren . Resultaterne viser, at antistoffer udtrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og mAbs produceret ved hjælp af hybridomer kunne genkende og binde til APN-proteinet. Dette giver grundlag for yderligere belysning af APN-receptorfunktionen til udvikling af lægemidler rettet mod forskellige APN-specifikke epitoper.
Introduction
Aminopeptidase N (APN), et måneskinsenzym, der tilhører metalloproteinase M1-familien, fungerer som en tumormarkør, receptor og signalmolekyle via enzymafhængige og enzymuafhængige veje 1,2. Ud over at spalte de N-terminale aminosyrerester af forskellige bioaktive peptider til regulering af deres biologiske aktivitet spiller APN en vigtig rolle i patogenesen af forskellige inflammatoriske sygdomme. APN deltager i antigenbehandling og præsentation af trimmede peptider, der binder tæt til større histokompatibilitetskomplekserklasse II-molekyler 2,3. APN udøver også antiinflammatoriske virkninger ved at binde med G-proteinkoblede receptorer, der deltager i multipel signaltransduktion, modulerer cytokinsekretion og bidrager til Fc gammareceptormedieret fagocytose i immunresponset 4,5,6,7.
Som en bredt distribueret membranbundet exopeptidase er APN rigelig i svinetyndtarmens slimhinde og er tæt forbundet med receptormedieret endocytose 1,5,8. APN genkender og binder spikeproteinet i den overførbare gastroenteritisvirus til celleindgang og interagerer direkte med FaeG-underenheden af enterotoksinfremkaldende Escherichia coli F4 fimbriae for at påvirke bakteriel adhærens med værtsceller 9,10,11. APN er således et potentielt terapeutisk mål i behandlingen af virale og bakterielle infektionssygdomme.
Siden udviklingen af hybridomteknologi og andre strategier til produktion af monoklonale antistoffer (mAbs) i 1975 har mAbs været meget udbredt i immunterapi, lægemiddelafgivelse og diagnose12,13,14. I øjeblikket anvendes mAbs med succes til behandling af sygdomme, såsom kræft, inflammatorisk tarmsygdom og multipel sklerose12,15. På grund af deres stærke affinitet og specificitet kan mAbs være ideelle mål i udviklingen af antistof-lægemiddelkonjugater (ADC) eller nye vacciner16,17. APN-proteinet er kritisk for selektivt at levere antigener til specifikke celler og kan fremkalde et specifikt og stærkt slimhindeimmunrespons mod patogener uden interferens, herunder lav proteinekspression, enzyminaktivitet eller strukturelle ændringer 5,8,18. Derfor viser terapeutiske produkter baseret på APN-specifikke mAbs løfte mod bakterielle og virale infektioner. I denne undersøgelse beskriver vi produktionen af APN-specifikke mAbs ved hjælp af hybridomteknologi og ekspression af anti-APN rekombinante antistoffer (rAbs) ved hjælp af prokaryote og eukaryote vektorer. Resultatet indikerer, at APN-proteinet blev genkendt af både rAbs udtrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og hybridomafledte mAbs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg i denne undersøgelse blev godkendt af Yangzhou University Institutional Animal Care and Use Committee (SYXK20200041).
1. Fremstilling af svin APN-proteinantigen
BEMÆRK: pET28a (+)-APN-BL21 (DE3)-stammen og APN-cellerne med stabilt udtrykt indhold pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 blev konstrueret i en tidligere undersøgelse11.
- Genvind bakterier fra en frossen glycerolbestand og stribe på Luria-Bertani (LB) plader indeholdende 50 μg / ml kanamycin (KM +) til isolering af en enkelt koloni.
- Vælg en enkelt koloni fra den friskstribede plade, kultur i 4 ml LB-medium (10 g / L trypton, 10 g / L natriumchlorid (NaCl) og 5 g / L gærekstrakt, pH 7,2) suppleret med Km + (50 μg / ml), og lad det vokse natten over (12-16 timer) med omrøring (178 o / min) ved 37 ° C.
- De tilberedte bakterier fortyndes ved 1:100 i frisk Km+ LB bouillon og inkuberes ved 37 °C under omrystning i 2-3 timer, indtil OD600 når 0,4-0,6.
- Der tilsættes isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til substratet til en slutkoncentration på 0,4 mM, og kulturerne inkuberes i yderligere 10 timer ved 16 °C.
- Derefter centrifugeres og høstes bakterierne ved hjælp af IPTG-induktion (10.000 × g, 4 °C 15 min).
- Cellepellet resuspenderes med 5 ml LEW-buffer (lysis/ligevægt/vask) (50 mM vandfrit natriumphosphatmonobasisk (NaH2PO4) og 300 mM NaCl, pH 8,0) indeholdende 1 mg/ml lysozym. Rør bakteriesuspensionen i 30 min på is og soniker helt (15 s puls og 20 s slukket, 15 min) ved hjælp af en ultralydhomogenisator.
- Centrifuger råcellelysatet ved 4 °C og 10.000 × g i 30 minutter for at fjerne celleaffald. Supernatanten overføres til en præækvilibreret kolonne og inkuberes 1-2 minutter før tyngdekraftsdræning. Gentag dette trin tre gange.
- Søjlen vaskes med 20 ml LEW-buffer og drænes med tyngdekraften. Eluer det histidinmærkede APN-protein ved hjælp af 9 ml elueringsbuffer (50 mMNaH2PO4, 300 mM NaCl og 250 mM imidazol, pH 8,0) og opsaml det i dialyseslanger.
- Dialyserer proteinopløsningen natten over ved 4 °C i natriumcarbonat-natriumbicarbonat (PBS, 135 mM NaCl, 4,7 mM kaliumchlorid, 2 mMNaH2PO4 og 10 mM dodecahydratnatriumphosphatdibasisk, pH 7,2) buffer.
- Analyser ved hjælp af en 12,0% SDS-PAGE gel og western blotting for at vurdere renheden af APN-proteinet.
- Kom 5 μg protein i hver hul i gelen og lad den køre ved 110 V i 1,5 timer. Overfør derefter protein til en PVDF-membran i 50 minutter ved 15 V. Bestem koncentrationen af det oprensede protein ved hjælp af et BCA-assay.
2. Immunisering af dyr
- Subkutane (s.c) injicerer kvindelige BALB/c-mus, 6-8 uger gamle, med 50 μg APN-protein eller PBS (negativ kontrol) blandet med adjuvanser en gang hver 2. uge. Brug komplet Freunds adjuvans, der indeholder de varmedræbte mykobakterier til indledende immunisering og ufuldstændig Freunds adjuvans til boosterimmuniseringer. Bland lige store mængder APN-protein (eller PBS) og Freunds adjuvans eller ufuldstændig Freunds adjuvans.
- Der påvises antistoftitere mod APN i sera hos disse mus ved indirekte enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) ved hjælp af en mikrotiterplade belagt med 5 μg/ml APN-protein fortyndet i 0,05 M PBS (pH 9,6). .
3. Hybridomteknologi til fremstilling af monoklonale antistoffer mod APN
- Intraperitonealt (i.p.) injiceres 100 μg APN-protein i de udvalgte mus for et sidste antigenboost.
- Tre dage senere aflives musene ved hjælp af pentobarbitalnatrium (50 mg / kg, v / v, intraperitoneal) og cervikal dislokation.
- Saml milt, og vask med DMEM to gange for at fjerne blod og fedtceller. Miltcellesuspensionen filtreres ved hjælp af et 200-masket kobbergitter for at fjerne vævsaffald, og høst miltceller ved hjælp af centrifugering (1500 × g, 10 min) for at fjerne miltens membran.
- Seed mus myelom SP2/0 celler i en 25 cm 2 kolbe indeholdende 5 ml DMEM suppleret med 6% føtalt bovin serum (FBS) og kultur ved 37 °C, 6% CO2 atmosfære for at opretholde cellelevedygtighed. Efter 5-6 dages dyrkning når cellerne 80% -90% sammenløb efter genoplivning og er i vækstlogfase. Under mikroskopet er cellerne runde, lyse og klare.
- En dag før hybridisering indsamles makrofager fra musenes bughulrum i henhold til en tidligere offentliggjort metode12,19.
- Frø peritoneale makrofager ved en densitet på 0,1-0,2 × 105/ml i plader med 96 brønde, hver brønd indeholdende 100 μL HAT-medium (DMEM suppleret med 10% FBS og 1x HAT-tilskud), og inkuberes ved 37 °C, 6 % CO2 -befugtet atmosfære natten over.
- Til hybridisering aspireres forsigtigt SP2/0-celler med en pipette fra 8-10 flasker og suspenderes i 10 ml serumfrit DMEM-medium. Cellerne vaskes med frisk DMEM, centrifugeres (1500 × g, 10 min) to gange, og opslæmmes derefter igen i 10 ml DMEM.
- Bland de kvantificerede miltceller med SP2/0-celler i forholdet 10:1 og overfør dem til 50 ml rør. Der centrifugeres (1500 × g, 10 min), og supernatanten kasseres. Saml cellepillerne i bunden af rørene og bank med håndfladen for at løsne pellets inden hybridisering.
- Der tilsættes 1 ml polyethylenglycol 1500 (PEG 1500), forvarmet til 37 °C, dråbevis med en dråber til den løsnede cellepille over en periode på 45 s, mens du forsigtigt roterer bunden af røret.
- Der tilsættes langsomt 1 ml DMEM, der er forvarmet til 37 °C, til ovennævnte blanding i løbet af 90 s, efterfulgt af yderligere 30 ml frisk DMEM. Fusionsrøret anbringes i et 37 °C vandbad i 30 minutter.
- Efter inkubation i det varme bad høstes cellerne og suspenderes igen i HAT-medium. Derefter kultur i en 96-brøndplade inokuleret med peritoneale makrofager.
- Fem dage senere tilsættes 100 μL frisk HAT-medium til hvert hul, og pladen inkuberes i yderligere 5 dage, hvorefter substratet udskiftes med HT-medium (DMEM suppleret med 10% FBS og 1x HT Supplement).
- Brug en mikrotiterplade belagt med 5 μg/ml APN-protein fortyndet i 0,05 M PBS (pH 9,6) til at analysere monoklonale antistoffer i hybridomsupernatanten ved hjælp af ELISA-assay.
- Når substratet i hullerne i 96-brøndpladen bliver gult (på grund af cellevækst og metabolitfrigivelse falder pH i mediet til 6,8, og phenolrødt skifter fra fuchsia til gult) eller celleklynger observeres, erhverves 100 μL supernatant fra de udvalgte huller og tilsættes til hullerne i den coatede ELISA-plade. Brug en mikropladelæser til at måle OD450-værdierne.
- Brug de polyklonale antistoffer mod APN og ikke-inficeret museserum som henholdsvis positiv og negativ kontrol, og brug PBS som blind kontrol. I denne undersøgelse blev OD450-forholdet mellem prøve og negativ kontrol (P / N) ≥ 2,1 anerkendt som positiv selektionsstandard.
- Efter tre på hinanden følgende positive udvælgelsesrunder vælges hybridomet, der viser øget serologirespons mod APN-proteinet for et begrænset fortyndingsassay.
- Forbered peritoneale makrofager og frø i plader med 96 brønde som beskrevet tidligere.
- Suspender hybridomceller i HT-medium i gennemsnit 0,5-2 celler pr. brønd og kultur i en 37 ° C, 6% CO2 -inkubator. Gentag dette trin tre eller fire gange, indtil den positive hastighed angivet ved ELISA-immunoassay når 100%.
- Under tryk af kontinuerlig frysning og optøning skal du vælge de positive hybridomceller, der er i stand til stabilt at udskille anti-APN-antistoffer og proliferere normalt.
- Administrer en enkelt i.p. injektion af 0,3 ml pristan til hver mus (8-10 uger). 10 dage efter uberørt injektion injiceres hver mus med 2-5 x 10 5 hybridomceller i0,5 ml PBS (pH 7,2).
- Opsaml forsigtigt peritonealvæske fra peritonealhulen hos disse mus 8 til 10 dage efter injektionen.
- Supernatanterne høstes ved centrifugering ved 5 000 × g i 15 min, og antistofferne renses i supernatanterne med 33 % mættet ammoniumsulfat [(NH4)2SO4] udfældning og protein A agarose.
4. Karakterisering af mAbs mod APN-protein
- Bestem immunoglobulinundertypen af den indsamlede mAbs ved hjælp af et SBA Clonotyping System-HRP20. Brug SDS-PAGE og western blotting til at vurdere mAb renhed og specificitet.
- Analyser mAb-epitopspecificiteten mod APN-proteinet ved hjælp af ELISA21. Additivitetsværdi (AV) er forholdet mellem OD mAbs (a + b) til (OD mAbs-a + OD mAbs-b), som bruges til at evaluere, ommAbs genkender det samme antigene sted; ODmAbs-a og OD mAbs-b repræsenterer OD450-værdierne for forskellige monoklonale antistoffer mod APN alene, og OD mAbs(a + b) repræsenterer OD450-værdierne for en 1: 1 blanding af tomAbs mod APN.
- Vurder hver prøve mindst fire replikater, og gentag hele eksperimentet mindst tre gange.
5. Ekspression af rAbs mod APN
- Uddrag total RNA fra de ovennævnte hybridomceller og milt fra APN-immuniserede mus (fx TRIzol)22. Syntetiser komplementært DNA (cDNA) ved hjælp af et cDNA-syntesesæt i henhold til producentens instruktioner.
- Forstærk variable områder af mAbs ved hjælp af indlejret PCR, og bestem sekvenser med tung kæde (VH) og let kæde (VL) ved hjælp af sekventering. Analyser de gener, der koder for VH og VL ved hjælp af IMGT-musegenomanalyseværktøjet (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Kombiner VH- og VL-generne med ledersekvenser og subklon dem sekventielt i henholdsvis pET28a (+) og pIRES2-ZsGreen1-vektorerne ved hjælp af sømløs kloningsteknologi for at muliggøre arfri DNA-fragmentindsættelse. De specifikke primere er anført i tabel 1.
- De pET28a (+)-rAbs-APN-BL21-transformerede bakterier dyrkes under tilstedeværelse af 0,4 mM IPTG i orbitalrystere ved 37 °C i 10 timer. Derefter inducerer, renser og vurderer for ekspression af rAbs-proteinet ved hjælp af rutinemæssig proteinoprensning.
- Der sås 100 μL 0,5 x 105 CHO-celler pr. brønd i en plade med 96 brønde og inkuberes ved 37 °C i en 6 % CO2 atmosfære i 18-24 timer. Når cellerne når 80-90% sammenløb, fortyndes pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-plasmidet med Opti-MEM til en slutkoncentration på 0,1 μg / μL og inkuberes 5 min ved stuetemperatur, før de bruges til transfektion.
- 50 μL fortyndet pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-plasmid blandes forsigtigt med 1 μL lipofectamin 2000 og 49 μL Opti-MEM, og blandingen inkuberes i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur. Der tilsættes 100 μL blanding til hvert hul i en 96 brøndplade indeholdende CHO-celler, og der inkuberes ved 37 °C i 6 % CO2 atmosfære i 4-6 timer.
- Ved 4-6 timer efter transfektion udskiftes mediet med DMEM-F12-medium suppleret med 10% FBS og inkuberer pladen i yderligere 48 timer. Derefter tilsættes 400 μg/ml G418 til hvert hul for at vælge de stabilt transfekterede celler.
- Efter 10 dages udvælgelse med DMEM-F12-medium suppleret med 10% FBS og 400 μg/ml G418 sorteres cellerne (3,0 × 107 celler/ml) ved fluorescensaktiveret cellesortering. Ca. 10-15% af cellepopulationen var positive.
- Serielt fortyndet høstede positive celler, frø i gennemsnit 0,5-2 celler pr. brønd i en 96-brøndplade og kultur i en 37 ° C, 6% CO2 -inkubator. Bevar de stabilt transfekterede pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler ved hjælp af markering med G418 (200 μg/ml).
- FBS-koncentrationen i det ovenfor beskrevne cellekulturmedium falder gradvist fra 10% til 0% i den logaritmiske vækstfase over en periode på 3 uger. Tilpas derefter de klæbende CHO-celler til suspensionsvækst i et serumfrit medium.
- De podede pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler dyrkes i den logaritmiske vækstfase i serumfrit medium med en densitet på 0,8-1,0 × 105 celler/ml i rystekolber ved 80-110 omdr./min. rystehastighed og 37 °C, 6 % CO2.
- Opsaml cellesuspensionen hver 12. time for at bestemme ændringer i cellelevedygtighed og vitalitet ved hjælp af et celletællingssæt (f.eks. CCK-8) i henhold til producentens anvisninger.
- Antistofekspression når topniveauer, når cellelevedygtigheden faldt til 80%, og celletætheden når 1,0-2,0 × 106 celler / ml. Der høstes cellesupernatanter ved centrifugering, filtreres med et 0,22 μm polytetrafluorethylenmembranfilter, og protein A agaroseprotein renses.
- Bekræft produktionen af APN-specifikke antistoffer ved hjælp af indirekte immunofluorescensassays (IFA).
- Bestem antistoftitere og bindingsaffiniteter ved hjælp af ELISA-assay som beskrevet tidligere. 23 Antistoffernes ligevægtsdissociationskonstant (KD-værdi ) beregnes med en logistisk ligning med fire parametre ved hjælp af software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse blev det oprensede opløselige APN-protein (2,12 mg / ml) anvendt til museimmunisering. Mus, der blev immuniseret med APN-proteinet fire gange med 14-dages intervaller, udviste en højere antistoftiter mod APN i deres sera. Selvom 14 hybridomer blev opnået ved hjælp af fusionseksperimenterne, overlevede kun 9 hybridomer de tre kontinuerlige fryse-optøningscyklusser, hvilket resulterede i 9 stabile kloner, der udskilte antistoffer mod APN. Alle disse celler er runde, lyse og klare (figur 1). De rensede mAbs med tunge og lette kæder (henholdsvis 50 kDa og 25 kDa) blev bekræftet af SDS-PAGE og fundet i de rensede ascites (figur 2). Titre af disse anti-APN mAbs i kultursupernatanter og ascites er vist i tabel 2.
Resultatet af muse-mAbs-isotyping afslørede, at mAbs afledt af kloner 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 og 6C56 havde IgG2b-underklasser, mens APN-2A20 var et IgG2a κappa- (κ) type antistof, og mAbs APN-3FD9, -3F10 og -10F3 tilhørte IgM-typen og forarbejdede κ-lyskæder (tabel 3). Som vist i tabel 4 viste de fleste af disse mAbs AV-værdier på over 50%, hvilket indikerer, at de målrettede mod forskellige epitoper i APN, mens APN-5C51-antistoffet genkendte antigene epitoper svarende til dem, der genkendes af APN-3C48, -5B31 og -6C56 mAbs.
APN-5B36 viste betydeligt højere antistoftiter sammenlignet med andre mAbs. Derfor blev APN-5B36 VH-VL-genet amplificeret og ligeret til en pET28a (+) eller pIRES2-ZsGreen1-vektor for at konstruere henholdsvis de rekombinante ekspressionsplasmider pET28a (+)-rAbs-APN og pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN (figur 3). Antistofferne udtrykt af både pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) og pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler blev oprenset og analyseret ved hjælp af ELISA- og IFA-assays. Som vist i figur 4 var det imidlertid kun antistoffet udtrykt i supernatanten af pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler, der genkendte APN-proteinet, ligesom hybridomafledte mAbs. Dette rekombinante antistof bestod af IgG2b tunge kæder og lambda lette kæder og viste en titer på 2,56 × 105 som bestemt ved anvendelse af ELISA. Bindingen af APN-5B36 mAbs til APN-proteiner nåede en ligevægt tidligere end rAbs gjorde (figur 5), hvilket viser KD-værdi på (4.232±0.475) × 10-9 og (2.201±0.367) × 10-8 mol / L.
| Primer | Sekvens (5'-3') | ||
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG | ||
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGAGAGAGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
Tabel 1. De specifikke primere, der anvendes i denne undersøgelse.
| Celler | Titre af supernatanter (U/ml) | Titre af ascites (U/ml) |
| 2A20 | 0,64×104 | 3.20×105 |
| 5B31 | 1.28×104 | 1.60×105 |
| 5B36 | 0,64×104 | 1.28×106 |
| 3C48 | 0.16×104 | 0,80×105 |
| 5C51 | 0.16×104 | 0,80×104 |
| 6C56 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3FD9 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3F10 | 0.16×104 | 0,16×105 |
| 10F3 | 0,80×103 | 0,32×105 |
Tabel 2. ELISA-titerne af APN mAbs.
| Ig | IgA | Igm | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | Kappa | Lambda | Resumé | |
| 2A20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a, Kappa |
| 5B31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b, Lambda |
| 5B36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b, Lambda |
| 3C48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b, Lambda |
| 5C51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b, Lambda |
| 6C56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b, Lambda |
| 3FD9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM, Kappa |
| 3F10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM, Kappa |
| 10F3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM, Kappa |
Tabel 3. Isotyper af hybridom-afledte APN mAbs.
| mAbs | AV (100 %) | ||||||||
| 2A20 | 5B31 | 5B36 | 3C48 | 5C51 | 6C56 | 3FD9 | 3F10 | 10F3 | |
| 2A20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5B31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5B36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3C48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5C51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6C56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3FD9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3F10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10F3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
Tabel 4. Diskrimination af antigen-epitopspecificitet af APN-specifikke mAbs. AV-værdier større end 0,5 indikerer, at disse to mAbs genkender forskellige antigene steder; AV-værdier mindre end 0,5 indikerer, at disse to mAb'er genkender et lignende antigent sted.
Figur 1. Billede af hybridomer. Under mikroskopisk analyse er hybridomer runde, lyse og klare. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Rekombinante antistofekspressionsniveauer og ascites analyseret ved hjælp af SDS-PAGE. A) bane M, proteinmarkør bane 1, renset pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) lysat; bane 2, pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) supernatant; bane 3, ascitesvæske renset med 33% (NH 4) 2SO4 nedbør. B) bane M, proteinmarkør bane 1, ascitesvæske renset ved hjælp af protein A agarose. I denne analyse blev 3-5 μg totalt protein indlæst i hver bane af gelen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Rekombinante ekspressionsplasmider pET28a (+)-rAbs-APN og pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN analyseret ved hjælp af agarosegelelektroforese. Bane M, Trans 2K plus DNA-markør; bane 1, pET28a (+) vektor (5369 bp); bane 2 og 5, VH-VL-gen kombineret med APN-5B36-ledersekvens; bane 3, pET28a (+)-rAbs-APN-plasmid udtrykt i BL21 (DE3) E. coli; bane 4, pIRES2-ZsGreen1-vektor (5283 bp); bane 6, pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-plasmid udtrykt i DH5α E. coli. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Ekspression af rekombinant antistofprotein og ascites analyseret ved anvendelse af indirekte immunofluorescens. pEGFP-C1-APN-IPEC-J2-celler (grøn fluorescens), der stabilt udtrykker APN, blev behandlet med (A) PBS, anvendt som kontrolbehandling; B) oprenset protein udtrykt ved pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) C) polyklonalt APN-antistof (1:500) D) renset ascitesvæske (1:500) E) renset supernatant fremstillet af pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler (1:500). DAPI blev brugt som nuklear modfarve i konfokal mikroskopi. Cellerne inkuberet med det sekundære IgG-stof mod DyLight 549-konjugeret gedeantimus (1:200) og behandlet med oprensede ascites og renset supernatant fra pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler, viste et robust rødt fluorescenssignal, der indikerer som APN's polyklonale antistof gjorde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5. Bestemmelse af antistofrelative bindingsaffiniteter ved anvendelse af ELISA22. Absorption af prøver indeholdende APN-5B36 mAbs eller rAbs, i fravær og tilstedeværelse af APN-protein, blev målt ved bølgelængden 450 nm. Bindingskurven blev plottet ved hjælp af en logistisk kurvetilpasning med fire parametre; X-aksen viser den logaritmiske koncentration af antistoffer, og y-aksen viser absorbansen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Induktion af slimhindeimmunitet er en af de mest effektive tilgange til modvirkning af patogener og forebyggelse og behandling af forskellige sygdomme. APN, et højt udtrykt membranbundet protein i tarmslimhinden, er involveret i induktion af adaptivt immunrespons og i receptormedieret viral og bakteriel endocytose 1,5,8. APN anvendes som antigenpartikler i mange formater af antigenbelastning og vaccinelevering. Den orale administration af APN-målrettede antistoffer kan også fremkalde effektive immunresponser 18,24,25. Imidlertid kræver monoklonale antistoffer rettet mod forskellige APN-specifikke epitoper yderligere undersøgelse.
De her beskrevne metoder blev anvendt til at producere monoklonale antistoffer mod APN ved hjælp af både traditionelle hybridomer og rekombinante teknologier. Denne fremgangsmåde kan anvendes i produktionen af andre mAbs. Først fulgte vi en tidligere nævnt protokol for at opnå ni mAbs afledt af forskellige hybridomkloner. Selvom titerne af disse mAbs i cellesupernatanter og ascites var forskellige, indeholdt alle mAbs den 50 kDa tunge kæde og 25 kDa lyskæde og viste specifik binding med svin APN-proteinet. Resultaterne af isotypning og identifikation af antigenepitoper viste, at de fleste mAbs målrettede forskellige epitoper og tilhørte forskellige antistoftyper. Disse resultater indikerer, at traditionel hybridomteknologi fortsat er et effektivt valg i produktionen af mAbs.
Tilgange anvendt til rekombinant antistofproduktion kan øge mAb-produktionseffektiviteten og minimere arbejds- og tidsrelaterede omkostninger. Derfor er disse tilgange vokset i popularitet, især i udviklingen af antistoffer til diagnostiske og terapeutiske anvendelser16,17,26. rAbs viser flere fordele i forhold til hybridomafledte mAbs. For det første kan rAbs produceres in vitro ved at klone antistofgener til ekspressionsvektorer og derved eliminere animalsk anvendelse i antistofproduktion. Derudover resulterer brug af eukaryote eller prokaryote ekspressionssystemer til fremstilling af rAbs i lave batch-til-batch-variationer og øger pålideligheden og stabiliteten af slutproduktet. I modsætning hertil genkender eller binder mAbs produceret ved hjælp af hybridomer ofte ikke til de målrettede antigenepitoper og påvirkes af hybridomcellelinjedrift, forurening og gentab og mutationer. I øjeblikket anvendes hybridomafledte mAbs mest i diagnostiske eller terapeutiske immunreagenser, hvilket fremhæver behovet for at producere stabile og pålidelige antistoffer i en begrænset produktionsperiode. Til diagnostiske og terapeutiske anvendelser er rekombinant antistofteknologi et bedre valg end traditionel hybridombaseret tilgang. Dette skyldes, at rekombinant antistofteknologi giver os mulighed for at ændre sekvensen af rAbs for at skifte immunglobulinisotyper og derved øge bindingsspecificiteten af antistoffet14,16,17.
I denne undersøgelse brugte vi antistofteknisk teknologi til at opnå APN-målrettede rekombinante antistoffer. Vi fandt, at både milten fra immuniserede mus og hybridomceller var lige effektive til at forstærke mAb tunge og lette kædesekvenser. Antistoffet udtrykt ved pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) genkendte ikke APN effektivt i hverken ELISA eller indirekte immunfluorescensassays. Imidlertid genkendte rAbs udtrykt ved pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-cellesuspension og hybridomafledte mAbs APN-proteinet og bandt effektivt APN-proteinet. Metoderne beskrevet i denne undersøgelse kan bruges til at udvikle APN-antistofbaseret ADC og andre terapeutiske produkter rettet mod forskellige APN-specifikke epitoper. Denne undersøgelse vil også bidrage til yderligere at klarlægge APN's rolle i forebyggelse og behandling af forskellige sygdomme. Strategier til forbedring af rAbs affinitet og udbytte kræver imidlertid yderligere undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Alle forfatterne godkendte og gav deres udtrykkelige samtykke til offentliggørelse af manuskriptet.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Chinese National Science Foundation Grant (nr. 32072820, 31702242), tilskud fra Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) og High-level Talents of Yangzhou University Scientific Research Foundation, et projekt grundlagt af Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), Hoboken, N.J. 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient's need. British Journal of Nursing. 24 (16), Suppl 1 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
