Summary
Белок рекомбинантных антител, экспрессируемый в клетках pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO, и моноклональные антитела, полученные с использованием традиционной гибридомной технологии, могут распознавать и связываться с белком N-аминопептидазы свиней (APN).
Abstract
Свиная аминопептидаза N (APN), связанная с мембраной металлопептидаза, в изобилии присутствующая в слизистой оболочке тонкой кишки, может инициировать иммунный ответ слизистой оболочки без каких-либо помех, таких как низкая экспрессия белка, неактивность ферментов или структурные изменения. Это делает APN привлекательным кандидатом при разработке вакцин, которые избирательно нацелены на эпителий слизистой оболочки. Предыдущие исследования показали, что APN является рецепторным белком как для энтеротоксигенной Escherichia coli (E. coli) F4, так и для трансмиссивного вируса гастроэнтерита. Таким образом, APN показывает перспективность в разработке конъюгатов антитело-лекарственное средство или новых вакцин на основе APN-специфических антител. В этом исследовании мы сравнили продукцию APN-специфических моноклональных антител (mAb) с использованием традиционной гибридомной технологии и метода экспрессии рекомбинантных антител. Мы также создали стабильно трансфицированную клеточную линию яичников китайского хомяка (CHO) с использованием pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN и штамма экспрессии E. coli BL21 (DE3), содержащего вектор pET28a (+)-rAbs-APN. Результаты показывают, что антитела, экспрессируемые в клетках pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO и mAb, продуцированных с использованием гибридом, могут распознавать и связываться с белком APN. Это обеспечивает основу для дальнейшего выяснения функции рецептора APN для разработки терапевтических средств, нацеленных на различные APN-специфические эпитопы.
Introduction
Аминопептидаза N (APN), фермент подработки, принадлежащий к семейству металлопротеиназ M1, действует как онкомаркер, рецептор и сигнальная молекула через ферментозависимые и ферментнезависимые пути 1,2. Помимо расщепления N-концевых аминокислотных остатков различных биологически активных пептидов для регуляции их биологической активности, АПН играет важную роль в патогенезе различных воспалительных заболеваний. APN участвует в процессинге и презентации антигена обрезанными пептидами, которые плотно связываются с основными молекулами комплекса гистосовместимости II класса 2,3. APN также оказывает противовоспалительное действие, связываясь с рецепторами, связанными с G-белком, участвующими в множественной передаче сигнала, модулирующими секрецию цитокинов и способствующими фагоцитозу, опосредованному гамма-рецептором Fc в иммунном ответе 4,5,6,7.
Как широко распространенная мембраносвязанная экзопептидаза, APN в изобилии присутствует в слизистой оболочке тонкой кишки свиньи и тесно связана с рецептор-опосредованным эндоцитозом 1,5,8. APN распознает и связывает спайковый белок трансмиссивного вируса гастроэнтерита для проникновения в клетки и напрямую взаимодействует с субъединицей FaeG энтеротоксигенных фимбрий Escherichia coli F4, влияя на бактериальную адгезию с клетками-хозяевами 9,10,11. Таким образом, АПН является потенциальной терапевтической мишенью при лечении вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний.
С момента разработки гибридомной технологии и других стратегий производства моноклональных антител (mAb) в 1975 году мАТ широко используются в иммунотерапии, доставке лекарств и диагностике12,13,14. В настоящее время мАТ успешно используются для лечения таких заболеваний, как рак, воспалительные заболевания кишечника и рассеянный склероз12,15. Из-за их сильного сродства и специфичности мАТ могут быть идеальными мишенями при разработке конъюгатов антитело-лекарственное средство (АЦП) или новых вакцин16,17. Белок APN имеет решающее значение для селективной доставки антигенов в определенные клетки и может вызывать специфический и сильный иммунный ответ слизистой оболочки против патогенов без какого-либо вмешательства, включая низкую экспрессию белка, неактивность ферментов или структурные изменения 5,8,18. Таким образом, терапевтические продукты на основе APN-специфических мАТ показывают многообещающие результаты против бактериальных и вирусных инфекций. В этом исследовании мы описываем продукцию APN-специфических mAb с использованием гибридомной технологии и экспрессию анти-APN-рекомбинантных антител (rAb) с использованием прокариотических и эукариотических векторов. Результат указывает на то, что белок APN был распознан как rAb, экспрессируемыми в клетках pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO, так и mAb, полученными из гибридомы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных в этом исследовании были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Янчжоу (SYXK20200041).
1. Получение антигена белка APN свиньи
ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) и стабильно экспрессируемые клетки APN pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 были построены в предыдущем исследовании11.
- Извлеките бактерии из замороженного глицерина и нанесите на пластины Лурия-Бертани (LB), содержащие 50 мкг/мл канамицина (Km+) для выделения одной колонии.
- Выберите одну колонию из свежепрожилочной пластины, культивируйте в 4 мл среды LB (10 г / л триптона, 10 г / л хлорида натрия (NaCl) и 5 г / л дрожжевого экстракта, pH 7,2) с добавлением Km + (50 мкг / мл) и оставьте расти на ночь (12-16 часов) при перемешивании (178 об/мин) при 37 ° C.
- Разведите приготовленные бактерии в соотношении 1:100 в свежем бульоне Km+ LB и инкубируйте при 37 °C при встряхивании в течение 2-3 ч, пока OD600 не достигнет 0,4-0,6.
- Добавляют изопропил β-d-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в среду до конечной концентрации 0,4 мМ и инкубируют культуры еще 10 ч при 16 °C.
- Следовательно, центрифугируют и собирают бактерии с помощью индукции IPTG (10 000 × г, 4 ° C 15 мин).
- Ресуспендируют клеточную гранулу, используя 5 мл буфера LEW (лизис/уравновешивание/промывка) (50 мМ безводного одноосновного фосфата натрия (2PO4) и 300 мМ NaCl, pH 8,0), содержащего 1 мг / мл лизоцима. Перемешайте бактериальную суспензию в течение 30 минут на льду и полностью обработайте ультразвуком (импульс 15 с и выключение 20 с, 15 минут) с использованием ультразвукового гомогенизатора.
- Центрифугируют сырой клеточный лизат при 4 °C и 10 000 × г в течение 30 мин для удаления клеточного мусора. Переложить надосадочную жидкость в предварительно уравновешенную колонну и инкубировать 1-2 мин до самотечного дренажа. Повторите этот шаг три раза.
- Промойте колонку, используя 20 мл буфера LEW, и слейте воду под действием силы тяжести. Разбавьте белок APN, меченный гистидином, используя 9 мл элюирующего буфера (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазола, pH 8,0) и соберите в диализную трубку.
- Диализируйте белковый раствор в течение ночи при 4 ° C в буфере карбонат натрия-бикарбонат натрия (PBS, 135 мМ NaCl, 4,7 мМ хлорид калия, 2 мМ 2 PO4 и 10 мМ додекагидрат двуосновного фосфата натрия, рН7,2).
- Проведите анализ с использованием 12,0% геля SDS-PAGE и вестерн-блоттинга для оценки чистоты белка APN.
- Загрузите по 5 мкг белка в каждую лунку геля и дайте поработать при напряжении 110 В в течение 1,5 ч. Затем перенесите белок на мембрану PVDF в течение 50 мин при 15 В. Определите концентрацию очищенного белка с помощью анализа BCA.
2. Иммунизация животных
- Подкожно (s.c) вводят самкам мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель 50 мкг белка APN или PBS (отрицательный контроль) один раз в 2 недели. Используйте полный адъювант Фройнда, который содержит убитые теплом микобактерии для первоначальной иммунизации, и неполный адъювант Фройнда для бустерной иммунизации. Смешайте равные объемы белка APN (или PBS) и адъюванта Фройнда или неполного адъюванта Фройнда соответственно.
- Определите титры антител против APN в сыворотках этих мышей с помощью непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием микротитровальной пластины, покрытой белком APN 5 мкг/мл, разбавленным в 0,05 М PBS (рН 9,6). .
3. Гибридомная технология получения моноклональных антител против APN
- Внутрибрюшинно (внутривенно) вводят 100 мкг белка APN выбранным мышам для окончательного повышения антигена.
- Через три дня усыпляют мышей с помощью пентобарбитала натрия (50 мг / кг, об./об., внутрибрюшинно) и вывиха шейки матки.
- Соберите селезенку и дважды промойте DMEM, чтобы удалить кровь и жировые клетки. Отфильтруйте суспензию клеток селезенки с помощью медной сетки 200 меш для удаления тканевого мусора и соберите клетки селезенки с помощью центрифугирования (1500 × г, 10 мин) для удаления мембраны селезенки.
- Семенные клетки миеломы мыши SP2/0 в колбе размером 25см2 , содержащей 5 мл DMEM с добавлением 6% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и культуры при 37 °C, 6% атмосфере CO2 для поддержания жизнеспособности клеток. После 5-6 дней культивирования клетки достигают 80-90% слияния после реанимации и находятся в фазе логарифма роста. Под микроскопом клетки получаются круглыми, яркими и четкими.
- За сутки до гибридизации собирают макрофаги из брюшных полостей мышей по ранее опубликованному методу12,19.
- Семенные перитонеальные макрофаги плотностью 0,1-0,2 × 105 / мл в 96-луночных планшетах, каждая лунка содержит 100 мкл среды HAT (DMEM с добавлением 10% FBS и 1x добавки HAT), и инкубируют при 37 ° C, 6% CO2 увлажненной атмосфере в течение ночи.
- Для гибридизации аккуратно аспирируют клетки SP2/0 пипеткой из 8-10 флаконов и суспендируют в 10 мл безсывороточной среды DMEM. Промойте клетки свежим DMEM, центрифугой (1500 × г, 10 мин) дважды, а затем повторно суспендируйте в 10 мл DMEM.
- Смешайте количественно выраженные клетки селезенки с клетками SP2/0 в соотношении 10:1 и перенесите в пробирки объемом 50 мл. Центрифугу (1500 × г, 10 мин) и выбросьте надосадочную жидкость. Соберите гранулы клеток на дне пробирок и постучите ладонью, чтобы ослабить гранулы перед гибридизацией.
- Добавьте 1 мл полиэтиленгликоля 1500 (ПЭГ 1500), предварительно нагретого до 37 °C, по каплям с помощью пипетки к разрыхленной грануле ячейки в течение 45 с, осторожно вращая дно пробирки.
- Медленно добавьте 1 мл предварительно нагретого до 37 ° C DMEM в вышеуказанную смесь в течение 90 с, а затем еще 30 мл свежего DMEM. Поместите термосварную трубку на водяную баню с температурой 37 °C на 30 минут.
- После инкубации в теплой ванне заготавливают ячейки и повторно суспендируют в среде HAT. Затем посев в 96-луночную пластину инокулируют перитонеальными макрофагами.
- Через пять дней добавьте 100 мкл свежей среды HAT в каждую лунку и инкубируйте пластину еще 5 дней, после чего замените среду средой HT (DMEM с добавлением 10% FBS и 1x добавки HT).
- Используйте микротитровальную пластину, покрытую белком APN 5 мкг/мл, разбавленным в 0,05 М PBS (рН 9,6), для анализа моноклональных антител в надосадочной жидкости гибридомы с помощью анализа ИФА.
- Когда среда в лунках 96-луночной пластины становится желтой (из-за роста клеток и высвобождения метаболитов рН в среде снижается до 6,8, а фенольный красный цвет превращается из фуксии в желтый) или наблюдаются клеточные кластеры, приобретают 100 мкл надосадочной жидкости из выбранных лунок и добавляют в лунки покрытой ИФА пластины. Используйте считыватель микропланшетов для измерения значений OD450.
- Используйте поликлональные антитела против APN и неинфицированной мышиной сыворотки в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно и используйте PBS в качестве пустого контроля. В этом исследовании отношение OD450 образца к отрицательному контролю (P/N) ≥ 2,1 было признано положительным стандартом отбора.
- После трех последовательных положительных раундов отбора выберите гибридому, демонстрирующую повышенный серологический ответ против белка APN, для анализа ограниченного разведения.
- Подготовьте перитонеальные макрофаги и семена в 96-луночные пластины, как описано ранее.
- Суспендировать клетки гибридомы в среде HT в среднем 0,5-2 клетки на лунку и культивировать в инкубаторе 37 °C, 6% CO2 . Повторите этот шаг три или четыре раза, пока положительный показатель, указанный иммуноферментным анализом ИФА, не достигнет 100%.
- Под давлением непрерывного замораживания и оттаивания отбирают положительные клетки гибридомы, способные стабильно секретировать антитела против APN и нормально размножаться.
- Вводят однократную внутривенную инъекцию 0,3 мл пристана каждой мыши (8-10 недель). Через 10 дней после приема первозданности вводят каждой мыши 2-5 х 10,5 клеток гибридомы в0,5 мл PBS (рН 7,2).
- Осторожно собирают перитонеальную жидкость из брюшной полости этих мышей через 8 - 10 дней после инъекции.
- Собирают надосадочные жидкости центрифугированием при 5000 × г в течение 15 мин и очищают антитела в надосадочных продуктах, используя 33% насыщенный сульфат аммония [(NH)2SO4] осаждение и белок А агарозы.
4. Характеристика мАТ по отношению к белку APN
- Определите подтип иммуноглобулина собранных мАТ с помощью системы клонотипирования SBA-HRP20. Используйте SDS-PAGE и вестерн-блоттинг для оценки чистоты и специфичности mAb.
- Проанализируйте специфичность эпитопа mAb по отношению к белку APN с помощью ИФА21. Значение аддитивности (AV) - это отношение ODmAbs (a+b) к (OD mAbs-a+ODmAbs-b), которое используется для оценки того, распознают ли мАТ один и тот же антигенный сайт; OD mAbs-a и ODmAbs-b представляют собой значения OD450 различных моноклональных антител только против APN, аOD mAb (a + b) представляют значения OD450 смеси 1: 1 из двух mAb против APN.
- Оцените каждый образец не менее четырех повторений и повторите весь эксперимент не менее трех раз.
5. Выражение rAbs против APN
- Извлеките общую РНК из вышеупомянутых клеток гибридомы и селезенки мышей, иммунизированных APN (например, TRIzol)22. Синтезируйте комплементарную ДНК (кДНК) с помощью набора для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя.
- Амплифицируйте вариабельные области мАТ с помощью вложенной ПЦР и определяйте последовательности тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL) с помощью секвенирования. Проанализируйте гены, кодирующие VH и VL, с помощью инструмента анализа генома мыши IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Объедините гены VH и VL с лидерными последовательностями и последовательно субклонируйте их в векторы pET28a (+) и pIRES2-ZsGreen1 соответственно, используя технологию бесшовного клонирования, чтобы обеспечить вставку фрагментов ДНК без рубцов. Конкретные грунтовки перечислены в таблице 1.
- Выращивайте pET28a (+)-rAbs-APN-BL21-трансформированные бактерии в присутствии 0,4 мМ IPTG в орбитальных шейкерах при 37 ° C в течение 10 часов. Затем индуцируют, очищают и оценивают экспрессию белка rAbs с помощью обычной очистки белка.
- Засейте 100 мкл 0,5 x 105 клеток СНО в лунку в 96-луночную пластину и инкубируйте при 37 ° C в атмосфере 6% CO2 в течение 18-24 часов. Когда клетки достигнут слияния 80-90%, разбавьте плазмиду pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN с помощью Opti-MEM до конечной концентрации 0,1 мкг/мкл и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре перед использованием для трансфекции.
- Аккуратно смешайте 50 мкл разбавленной плазмиды pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN с 1 мкл липофектамина 2000 и 49 мкл Opti-MEM и инкубируйте смесь еще 20 минут при комнатной температуре. Добавьте по 100 мкл смеси в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего ячейки СНО, и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 6% CO2 в течение 4-6 часов.
- Через 4-6 ч после трансфекции замените среду средой DMEM-F12 с добавлением 10% FBS и инкубируйте планшет еще 48 ч. Затем добавьте 400 мкг/мл G418 в каждую лунку, чтобы выбрать стабильно трансфицированные клетки.
- После 10 дней отбора с использованием среды DMEM-F12 с добавлением 10% FBS и 400 мкг/мл G418 отсортируйте клетки (3,0 × 107 клеток/мл) путем сортировки клеток, активированной флуоресценцией. Примерно 10-15% клеточной популяции были положительными.
- Серийно разбавляют собранные положительные клетки, высевают в среднем 0,5-2 клетки на лунку в 96-луночном планшете и культивируют в инкубаторе 37 °C, 6% CO2 . Поддерживайте стабильно трансфицированные клетки pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO с помощью отбора с помощью G418 (200 мкг / мл).
- Концентрация ФБС в вышеописанной среде для культивирования клеток постепенно снижается с 10% до 0% в течение логарифмической фазы роста в течение 3 недель. Затем адаптируют адгезивные клетки СНО к росту суспензии в среде, не содержащей сыворотки.
- Культивируют засеянные клетки pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO в фазе логарифмического роста в безсывороточной среде при плотности 0,8-1,0 ×10,5 клеток/мл в встряхивающих колбах при скорости встряхивания 80-110 об/мин и 37°С, 6%СО2.
- Собирайте клеточную суспензию каждые 12 часов, чтобы определить изменения жизнеспособности и жизнеспособности клеток, используя набор для подсчета клеток (например, CCK-8) в соответствии с инструкциями производителя.
- Экспрессия антител достигает пиковых уровней, когда жизнеспособность клеток снижается до 80%, а плотность клеток достигает 1,0-2,0 ×10,6 клеток/мл. Собирают надосадочные жидкости клеток с помощью центрифугирования, фильтруют с помощью мембранного фильтра из политетрафторэтилена 0,22 мкм и очищают с помощью агарозы белка А.
- Подтвердите выработку APN-специфических антител с помощью непрямых иммунофлюоресцентных анализов (IFA).
- Определите титры антител и сродство связывания с помощью анализа ИФА, как описано ранее. 23 Рассчитайте константу равновесной диссоциации (значениеKD ) антител с помощью четырехпараметрического логистического уравнения с помощью программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании очищенный растворимый белок APN (2,12 мг / мл) использовался для иммунизации мышей. Мыши, иммунизированные белком APN четыре раза с интервалом в 14 дней, показали более высокий титр антител против APN в сыворотке крови. Хотя 14 гибридом были получены с помощью экспериментов по слиянию, только 9 гибридом пережили три непрерывных цикла замораживания-оттаивания, в результате чего получилось 9 стабильных клонов, которые секретировали антитела против APN. Все эти ячейки круглые, яркие и четкие (рис. 1). Очищенные мАТ, обладающие тяжелыми и легкими цепями (50 кДа и 25 кДа соответственно), были подтверждены SDS-PAGE и обнаружены в очищенном асците (рис. 2). Титры этих анти-APN mAb в культуральных супернатантах и асците показаны в таблице 2.
В результате изотипирования мАТ мышей было выявлено, что мАТ, полученные из клонов 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 и 6C56, обладали подклассами IgG2b, в то время как APN-2A20 представлял собой антитело типа κappa- (κ) IgG2a, а мАТ APN-3FD9, -3F10 и -10F3 принадлежали к типу IgM и обрабатывали легкие цепи κ (табл. 3). Как показано в таблице 4, большинство из этих мАТ показали значения AV более 50%, что указывает на то, что они нацелены на разные эпитопы в APN, в то время как антитело APN-5C51 распознавало антигенные эпитопы, аналогичные тем, которые распознаются APN-3C48, -5B31 и -6C56 mAbs.
APN-5B36 показал значительно более высокий титр антител по сравнению с другими мАТ. Таким образом, ген APN-5B36 VH-VL был амплифицирован и лигирован в вектор pET28a (+) или pIRES2-ZsGreen1 для построения плазмид рекомбинантной экспрессии pET28a (+)-rAbs-APN и pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN соответственно (рис. 3). Антитела, экспрессируемые клетками pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) и pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO, были очищены и проанализированы с использованием анализов ИФА и ИФА. Однако, как показано на рисунке 4, только антитело, экспрессируемое в надосадочной жидкости клеток pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO, распознавало белок APN, как и mAb, полученные из гибридомы. Это рекомбинантное антитело состояло из тяжелых цепей IgG2b и легких цепей лямбда и показало титр 2,56 × 105, определенный с помощью ИФА. Связывание APN-5B36 mAbs с белками APN достигло равновесия раньше, чем rAb (рис. 5), показывая значение KD (4,232±0,475) × 10-9 и (2,201±0,367) × 10-8 моль/л соответственно.
| Букварь | Последовательность (5'-3') | ||
| ВН-ВЛ-Ф | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG | ||
| ВН-ВЛ-Р | CCGGCCCAATAGGCCCCCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pIRES2-ZsGreen1-R | ГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГ | ||
Таблица 1. Конкретные грунтовки, использованные в этом исследовании.
| Клетки | Титры супернатантов (Ед/мл) | Титры асцита (ЕД/мл) |
| 2А20 | 0.64×104 | 3.20×105 |
| 5Б31 | 1.28×104 | 1,60×105 |
| 5Б36 | 0,64×104 | 1.28×106 |
| 3С48 | 0.16×104 | 0,80×105 |
| 5С51 | 0.16×104 | 0,80×104 |
| 6С56 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3ФД9 | 0,80×103 | 0.80×104 |
| 3Ф10 | 0.16×104 | 0.16×105 |
| 10Ф3 | 0,80×103 | 0,32×105 |
Таблица 2. Титры ИФА APN mAbs.
| Иг | IgA | IgM | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | Каппа | Лямбда | Сводка | |
| 2А20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a, каппа |
| 5Б31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b, лямбда |
| 5Б36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b, лямбда |
| 3С48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b, лямбда |
| 5С51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b, лямбда |
| 6С56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b, лямбда |
| 3ФД9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM, Каппа |
| 3Ф10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM, Каппа |
| 10Ф3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM, Каппа |
Таблица 3. Изотипы APN mAb, полученных из гибридомы.
| мАТ | AV (100 %) | ||||||||
| 2А20 | 5Б31 | 5Б36 | 3С48 | 5С51 | 6С56 | 3ФД9 | 3Ф10 | 10Ф3 | |
| 2А20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5Б31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5Б36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3С48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5С51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6С56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3ФД9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3Ф10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10Ф3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
Таблица 4. Различение антиген-эпитопной специфичности APN-специфических mAb. Значения AV более 0,5 указывают на то, что эти два мАТ распознают разные антигенные сайты; Значения AV менее 0,5 указывают на то, что эти два мАТ распознают сходный антигенный сайт.
Рисунок 1. Изображение гибридомы. При микроскопическом анализе гибридомы получаются круглыми, яркими и четкими. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Уровни экспрессии рекомбинантных антител и асцит анализируются с помощью SDS-PAGE. (А) Лейн М, белковый маркер; полоса 1, очищенный лизат pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); полоса 2, надосадочная жидкость pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); полоса 3, асцитовая жидкость, очищенная 33%-ным (NH 4)2SO4 осадками. (B) Lane M, белковый маркер; полоса 1, асцитная жидкость, очищенная с использованием белка А агарозы. В этом анализе 3-5 мкг общего белка загружали в каждую полосу геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Рекомбинантные экспрессионные плазмиды pET28a (+)-rAbs-APN и pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN анализируются с помощью электрофореза в агарозном геле. Лейн М, Trans 2K плюс ДНК-маркер; полоса 1, вектор pET28a (+) (5369.н.); полосы 2 и 5, ген VH-VL в сочетании с лидерной последовательностью APN-5B36; полоса 3, плазмида pET28a (+)-rAbs-APN, экспрессируемая в BL21 (DE3) E. coli; полоса 4, вектор pIRES2-ZsGreen1 (5283 б..); полоса 6, плазмида pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN, экспрессируемая в DH5α E. coli. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Экспрессия белка рекомбинантных антител и асцита анализируется с помощью непрямой иммунофлюоресценции. Клетки pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 (зеленая флуоресценция), стабильно экспрессирующие APN, обрабатывали (A) PBS, используемым в качестве контрольной обработки; (B) очищенный белок, экспрессируемый pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); (C) поликлональное антитело APN (1:500); (D) очищенная асцитическая жидкость (1:500); Д) очищенная надосадочная жидкость, полученная из клеток pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO (1:500). DAPI использовался в качестве ядерного противостояния в конфокальной микроскопии. Клетки, инкубированные с вторичным антителом IgG против мышей DyLight 549 конъюгированного козья (1: 200) и обработанные очищенным асцитом и очищенным надосадочным продуктом из клеток pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO, показали устойчивый сигнал красной флуоресценции, указывающий на то, что это было с поликлональным антителом APN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Определение относительного сродства связывания антител с помощью ИФА22. Абсорбцию образцов, содержащих APN-5B36 mAbs или rAbs, в отсутствие и присутствии белка APN, измеряли на длине волны 450 нм. Кривая привязки была построена с использованием четырехпараметрической логистической кривой; Ось X показывает логарифмическую концентрацию антител, а ось Y показывает поглощение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Индукция иммунитета слизистой оболочки является одним из наиболее эффективных подходов в противодействии болезнетворным микроорганизмам, а также в профилактике и лечении различных заболеваний. APN, высокоэкспрессируемый мембраносвязанный белок в слизистой оболочке кишечника, участвует в индукции адаптивного иммунного ответа и в рецептор-опосредованном вирусном и бактериальном эндоцитозе 1,5,8. APN используется в качестве частиц антигена во многих форматах загрузки антигена и доставки вакцины. Пероральное введение антител, нацеленных на APN, также может вызывать эффективные иммунные ответы 18,24,25. Однако моноклональные антитела, нацеленные на различные APN-специфические эпитопы, требуют дальнейшего изучения.
Описанные здесь методы были использованы для получения моноклональных антител против APN с использованием как традиционной гибридомы, так и рекомбинантных технологий. Этот подход может быть использован при производстве других мАбс. Во-первых, мы следовали ранее упомянутому протоколу, чтобы получить девять мАТ, полученных из разных клонов гибридомы. Хотя титры этих мАТ в клеточных супернатантах и асците были разными, все мАТ содержали тяжелую цепь 50 кДа и легкую цепь 25 кДа и показали специфическое связывание с белком APN свиньи. Результаты изотипирования и идентификации эпитопов антигена показали, что большинство мАТ нацелены на разные эпитопы и принадлежат к разным типам антител. Эти результаты указывают на то, что традиционная гибридомная технология остается эффективным выбором при производстве mAb.
Подходы, используемые для производства рекомбинантных антител, могут повысить эффективность производства mAb и минимизировать затраты, связанные с трудом и временем. Поэтому популярность этих подходов возросла, особенно при разработке антител для диагностических и терапевтических применений16,17,26. rAb демонстрируют несколько преимуществ по сравнению с mAb, полученными из гибридомы. Во-первых, rAb могут быть получены in vitro путем клонирования генов антител в экспрессионные векторы, тем самым исключая использование животных в производстве антител. Кроме того, использование эукариотических или прокариотических систем экспрессии для производства rAb приводит к низким вариациям от партии к партии и повышает надежность и стабильность конечного продукта. Напротив, mAb, полученные с использованием гибридом, часто не распознают или не связываются с целевыми эпитопами антигена и подвержены дрейфу клеточной линии гибридомы, загрязнению, потере генов и мутациям. В настоящее время мАТ, полученные из гибридомы, в основном используются в диагностических или терапевтических иммунореагентах, что подчеркивает необходимость производства стабильных и надежных антител в течение ограниченного периода производства. Для диагностических и терапевтических применений технология рекомбинантных антител является лучшим выбором, чем традиционный подход, основанный на гибридоме. Это связано с тем, что технология рекомбинантных антител позволяет модифицировать последовательность rAb для переключения изотипов иммуноглобулинов, тем самым увеличивая специфичность связывания антитела14,16,17.
В этом исследовании мы использовали технологию инженерии антител для получения рекомбинантных антител, нацеленных на APN. Мы обнаружили, что как селезенка иммунизированных мышей, так и клетки гибридомы были одинаково эффективны для амплификации последовательностей тяжелой и легкой цепи mAb. Антитела, экспрессируемые pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3), не эффективно распознавали APN ни в ИФА, ни в непрямых иммунофлуоресцентных анализах. Тем не менее, rAb, экспрессируемые клеточной суспензией pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO и mAb, полученными из гибридомы, распознавали и эффективно связывали белок APN. Методы, описанные в этом исследовании, могут быть использованы для разработки АЦП на основе антител APN и других терапевтических продуктов, нацеленных на различные APN-специфические эпитопы. Это исследование также поможет в дальнейшем прояснении роли APN в профилактике и лечении различных заболеваний. Однако стратегии повышения сродства и выхода rAb требуют дальнейшего изучения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Все авторы одобрили и дали свое явное согласие на публикацию рукописи.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом Китайского национального научного фонда (No 32072820, 31702242), грантами Стипендии правительства Цзянсу для зарубежных исследований (JS20190246) и Научно-исследовательским фондом «Таланты высокого уровня Университета Янчжоу», проектом, основанным Приоритетной академической программой развития высшего учебного заведения провинции Цзянсу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), Hoboken, N.J. 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient's need. British Journal of Nursing. 24 (16), Suppl 1 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
