Summary
Det rekombinante antistoffproteinet uttrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og monoklonale antistoffer produsert ved hjelp av tradisjonell hybridoma-teknologi kan gjenkjenne og binde seg til porcinaminopeptidase N (APN) proteinet.
Abstract
Svineaminopeptidase N (APN), en membranbundet metallopeptidase som er rikelig tilstede i tynntarmslimhinnen, kan initiere en mukosal immunrespons uten forstyrrelser som lavt proteinuttrykk, enzyminaktivitet eller strukturelle endringer. Dette gjør APN til en attraktiv kandidat i utviklingen av vaksiner som selektivt retter seg mot slimhinneepitelet. Tidligere studier har vist at APN er et reseptorprotein for både enterotoksigene Escherichia coli (E. coli) F4 og overførbart gastroenterittvirus. Dermed viser APN løfte om utvikling av antistoff-legemiddelkonjugater eller nye vaksiner basert på APN-spesifikke antistoffer. I denne studien sammenlignet vi produksjon av APN-spesifikke monoklonale antistoffer (mAbs) ved bruk av tradisjonell hybridoma-teknologi og rekombinant antistoffekspresjonsmetode. Vi etablerte også en stabilt transfektert kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinje ved bruk av pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN og en E. coli-uttrykk BL21 (DE3) stamme som inneholder pET28a (+) -rAbs-APN-vektoren. Resultatene viser at antistoffer uttrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og mAbs produsert ved hjelp av hybridomer kunne gjenkjenne og binde seg til APN-proteinet. Dette gir grunnlag for videre belysing av APN-reseptorfunksjonen for utvikling av terapeutika rettet mot ulike APN-spesifikke epitoper.
Introduction
Aminopeptidase N (APN), et måneskinnsenzym som tilhører metalloproteinase M1-familien, fungerer som en tumormarkør, reseptor og signalmolekyl via enzymavhengige og enzymuavhengige veier 1,2. I tillegg til å spalte de N-terminale aminosyrerester av forskjellige bioaktive peptider for regulering av deres biologiske aktivitet, spiller APN en viktig rolle i patogenesen av ulike inflammatoriske sykdommer. APN deltar i antigenbehandling og presentasjon av trimmede peptider som binder tett til store histokompatibilitetskompleks klasse II-molekyler 2,3. APN utøver også antiinflammatoriske effekter ved å binde seg til G-proteinkoblede reseptorer som deltar i multippel signaltransduksjon, modulerer cytokinsekresjon og bidrar til Fc gammareseptormediert fagocytose i immunresponsen 4,5,6,7.
Som en vidt distribuert membranbundet eksopeptidase er APN rikelig i svinens tynntarmslimhinne og er nært forbundet med reseptormediert endocytose 1,5,8. APN gjenkjenner og binder piggproteinet til det overførbare gastroenterittviruset for celleinngang, og interagerer direkte med FaeG-underenheten av enterotoksigene Escherichia coli F4 fimbriae for å påvirke bakteriell adherens med vertsceller 9,10,11. Dermed er APN et potensielt terapeutisk mål i behandlingen av virale og bakterielle infeksjonssykdommer.
Siden utviklingen av hybridoma-teknologi og andre strategier for monoklonale antistoffer (mAbs) produksjon i 1975, har mAbs blitt mye brukt i immunterapi, legemiddellevering og diagnose12,13,14. For tiden brukes mAbs med hell til å behandle sykdommer, som kreft, inflammatorisk tarmsykdom og multippel sklerose12,15. På grunn av deres sterke affinitet og spesifisitet kan mAbs være ideelle mål i utviklingen av antistoff-legemiddelkonjugater (ADC) eller nye vaksiner16,17. APN-proteinet er kritisk for selektivt å levere antigener til spesifikke celler, og kan fremkalle en spesifikk og sterk slimhinneimmunrespons mot patogener uten forstyrrelser, inkludert lavt proteinuttrykk, enzyminaktivitet eller strukturelle endringer 5,8,18. Derfor viser terapeutiske produkter basert på APN-spesifikke mAbs løfte mot bakterielle og virusinfeksjoner. I denne studien beskriver vi produksjon av APN-spesifikke mAbs ved hjelp av hybridoma-teknologi, og ekspresjon av anti-APN rekombinante antistoffer (rAbs) ved bruk av prokaryote og eukaryote vektorer. Resultatet indikerer at APN-proteinet ble gjenkjent av både rAbs uttrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og hybridomavledede mAbs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk i denne studien ble godkjent av Yangzhou University Institutional Animal Care and Use Committee (SYXK20200041).
1. Fremstilling av svinekjøtt APN protein antigen
MERK: pET28a (+)-APN-BL21 (DE3)-stammen og APN-stabilt uttrykte celler pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 ble konstruert i en tidligere studie11.
- Gjenopprett bakterier fra en frossen glyserolbestand og strek på Luria-Bertani (LB) plater som inneholder 50 μg / ml kanamycin (Km +) for enkeltkoloniisolasjon.
- Velg en enkelt koloni fra den nystripete platen, kultur i 4 ml LB-medium (10 g / L trypton, 10 g / l natriumklorid (NaCl) og 5 g / L gjærekstrakt, pH 7,2) supplert med Km + (50 μg / ml), og la vokse over natten (12-16 timer) med omrøring (178 rpm) ved 37 ° C.
- Fortynn de tilberedte bakteriene ved 1:100 i fersk Km + LB buljong og inkuber ved 37 ° C med risting i 2-3 timer til OD600 når 0,4-0,6.
- Tilsett isopropyl β-d-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) til mediet til en endelig konsentrasjon på 0,4 mM, og inkuber kulturene i ytterligere 10 timer ved 16 °C.
- Sentrifuge og høste bakteriene ved hjelp av IPTG-induksjon (10 000 × g, 4 °C 15 min).
- Resuspender cellepelleten med 5 ml LEW (lysis/likevekt/vask) buffer (50 mM vannfritt natriumfosfat monobasisk (NaH2PO4) og 300 mM NaCl, pH 8,0) inneholdende 1 mg/ml lysozym. Rør bakteriell suspensjon i 30 minutter på is og sonicate helt (15 s puls og 20 s av, 15 min) ved hjelp av en ultralyd homogenisator.
- Sentrifuger råcellelysatet ved 4 °C og 10 000 × g i 30 minutter for å fjerne cellulært avfall. Overfør supernatant til en forhåndsekvilibrert kolonne og inkuber 1-2 min før gravitasjonsdrenering. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Vask kolonnen med 20 ml LEW-buffer og tøm ved hjelp av tyngdekraften. Eluer det histidinmerkede APN-proteinet ved bruk av 9 ml elueringsbuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl og 250 mM imidazol, pH 8,0) og samle inn i dialyseslangen.
- Dialyser proteinoppløsningen over natten ved 4 °C i natriumkarbonat-natriumbikarbonat (PBS, 135 mM NaCl, 4,7 mM kaliumklorid, 2 mM NaH 2 PO 4 og 10 mM dodekahydratnatriumfosfat dibasisk, pH7,2) buffer.
- Analyser ved hjelp av en 12,0% SDS-PAGE gel og vestlig blotting for å vurdere renheten til APN-proteinet.
- Legg 5 μg protein i hver brønn av gelen og la den løpe ved 110 V i 1,5 timer. Deretter overfører du protein til en PVDF-membran i 50 minutter ved 15 V. Bestem konsentrasjonen av det rensede proteinet ved hjelp av en BCA-analyse.
2. Immunisering av dyr
- Subkutane (s.c) injiserer kvinnelige BALB / c mus, 6-8 ukers alder, med 50 μg APN-protein eller PBS (negativ kontroll) blandet med adjuvans en gang hver 2. uke. Bruk komplett Freunds adjuvans som inneholder de varmedrepte mykobakteriene for innledende immunisering, og ufullstendig Freunds adjuvans for boosterimmuniseringer. Bland like store mengder APN-protein (eller PBS) og Freunds adjuvans eller ufullstendige Freunds adjuvans.
- Pådag antistofftitere mot APN i sera hos disse musene ved indirekte enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) ved bruk av en mikrotiterplate belagt med 5 μg / ml APN-protein fortynnet i 0,05 M PBS (pH 9,6). .
3. Hybridoma-teknologi for å produsere monoklonale antistoffer mot APN
- Intraperitonealt (i.p.) injiserer 100 μg APN-protein i de utvalgte musene for en endelig antigenboost.
- Tre dager senere, avlive musene ved hjelp av pentobarbitalnatrium (50 mg / kg, v / v, intraperitoneal) og cervikal dislokasjon.
- Samle milt, og vask med DMEM to ganger for å fjerne blod og fettceller. Filtrer miltcellesuspensjonen ved hjelp av et 200-mesh kobbergitter for å fjerne vevsrester, og høst miltceller ved hjelp av sentrifugering (1500 × g, 10 minutter) for å fjerne miltens membran.
- SP2/0-celler fra frømusmyelom i en 25 cm 2 kolbe inneholdende 5 ml DMEM supplert med 6 % føtalt bovint serum (FBS) og dyrkning ved 37 °C, 6 % CO2 atmosfære for å opprettholde cellens levedyktighet. Etter 5-6 dager med kultur når cellene 80% -90% sammenløp etter gjenopplivning og er i vekstloggfase. Under mikroskopet er cellene runde, lyse og klare.
- En dag før hybridisering, samle makrofager fra peritoneale hulrom av musene i henhold til en tidligere publisert metode12,19.
- Frøperitoneale makrofager med en tetthet på 0,1-0,2 × 105/ml i 96-brønnsplater, hver brønn inneholder 100 μL HAT-medium (DMEM supplert med 10 % FBS og 1x HAT-tilskudd), og ruges ved 37 °C, 6 % CO2 fuktet atmosfære over natten.
- For hybridisering, aspirer SP2/0-celler forsiktig med en pipette fra 8-10 flasker, og suspender i 10 ml serumfritt DMEM-medium. Vask celler med fersk DMEM, sentrifuge (1500 × g, 10 min) to ganger, og deretter re-suspendere i 10 ml DMEM.
- Bland de kvantifiserte miltcellene med SP2/0-celler i forholdet 10:1 og overfør til 50 ml rør. Sentrifuge (1500 × g, 10 min) og kast supernatanten. Samle cellepellets i bunnen av rørene og trykk med håndflaten for å løsne pellets før hybridisering.
- Tilsett 1 ml polyetylenglykol 1500 (PEG 1500), forvarmet til 37 °C, dråpevis ved hjelp av en dråpeteller til den løsnede cellepelleten over tidsperioden på 45 s mens du forsiktig roterer bunnen av røret.
- Tilsett sakte 1 ml DMEM forvarmet til 37 °C til ovennevnte blanding i løpet av 90 s, etterfulgt av ytterligere 30 ml fersk DMEM. Sett fusjonsslangen i et vannbad på 37 °C i 30 minutter.
- Etter inkubering i det varme badet, høst cellene og re-suspendere i HAT-medium. Deretter kultur i en 96-brønns plate inokulert med peritoneale makrofager.
- Fem dager senere, tilsett 100 μL ferskt HAT-medium til hver brønn, og inkuber platen i ytterligere 5 dager, hvoretter du erstatter mediet med HT-medium (DMEM supplert med 10% FBS og 1x HT-tilskudd).
- Bruk en mikrotiterplate belagt med 5 μg / ml APN-protein fortynnet i 0,05 M PBS (pH 9,6) for å analysere monoklonale antistoffer i hybridomsupernatanten ved bruk av ELISA-analyse.
- Når mediet i brønnene til 96-brønnplaten blir gult (på grunn av cellevekst og metabolittfrigivelse, reduseres pH i mediet til 6, 8, og fenolrøde svinger fra fuchsia til gul) eller celleklynger observeres, oppnår 100 μL supernatant fra de valgte brønnene og legg til brønnene på den belagte ELISA-platen. Bruk en mikroplateleser til å måle OD450-verdiene.
- Bruk polyklonale antistoffer mot APN og ikke-infisert museserum som henholdsvis positiv og negativ kontroll, og bruk PBS som blank kontroll. I denne studien ble OD450-forholdet mellom prøve og negativ kontroll (P / N) ≥ 2.1 anerkjent som positiv seleksjonsstandard.
- Etter tre påfølgende positive seleksjonsrunder, velg hybridomet som viser økt serologirespons mot APN-proteinet for en begrenset fortynningsanalyse.
- Forbered peritoneale makrofager og frø i 96-brønnsplater som beskrevet tidligere.
- Suspendere hybridomceller i HT-medium ved gjennomsnittlig 0,5-2 celler per brønn og kultur i en 37 °C, 6% CO2 inkubator. Gjenta dette trinnet tre eller fire ganger til den positive frekvensen indikert av ELISA-immunoassay når 100%.
- Under trykket av kontinuerlig frysing og tining, velg de positive hybridomcellene som stabilt kan utskille anti-APN-antistoffer og proliferere normalt.
- Administrer en enkelt i.p. injeksjon med 0,3 ml pristan til hver mus (8-10 uker). 10 dager etter å ha mottatt uberørt, injiser hver mus med 2-5 x 10 5 hybridomceller i0,5 ml PBS (pH 7,2).
- Forsiktig samle peritonealvæske fra bukhulen til disse musene 8 til 10 dager etter injeksjonen.
- Høst supernatantene ved sentrifugering ved 5000 × g i 15 minutter, og rens antistoffene i supernatantene ved hjelp av 33% mettet ammoniumsulfat [(NH 4)2SO4] utfelling og protein A-agarose.
4. Karakterisering av mAbs mot APN-protein
- Bestem immunoglobulinsubtypen til de innsamlede mAbs ved hjelp av et SBA Clonotyping System-HRP20. Bruk SDS-PAGE og western blotting for å vurdere mAb-renhet og spesifisitet.
- Analyser mAb-epitopspesifisitet mot APN-proteinet ved hjelp av ELISA21. Additivitetsverdi (AV) er forholdet mellom OD mAbs (a + b) til (OD mAbs-a + OD mAbs-b), som brukes til å evaluere ommAbs gjenkjenner det samme antigenstedet; OD mAbs-a og OD mAbs-b representerer OD450-verdiene av forskjellige monoklonale antistoffer mot APN alene, og OD mAbs(a + b) representerer OD450-verdiene til en 1: 1-blanding av tomAbs mot APN.
- Vurder hver prøve minst fire replikater, og gjenta hele eksperimentet minst tre ganger.
5. Uttrykk for rAbs mot APN
- Trekk ut totalt RNA fra de ovennevnte hybridomcellene og miltene til APN-immuniserte mus (f.eks. TRIzol)22. Syntetiser komplementært DNA (cDNA) ved hjelp av et cDNA-syntesesett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forsterk variable områder av mAbs ved hjelp av nestet PCR og bestem tungkjedesekvenser (VH) og lette kjedesekvenser (VL) ved hjelp av sekvensering. Analyser genene som koder for VH og VL ved hjelp av IMGT musegenomanalyseverktøy (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Kombiner VH- og VL-genene med ledersekvenser og underklon dem sekvensielt til henholdsvis pET28a (+) og pIRES2-ZsGreen1-vektorene, ved hjelp av sømløs kloningsteknologi for å tillate innsetting av arrfritt DNA-fragment. De spesifikke primerne er listet opp i tabell 1.
- Dyrk pET28a (+)-rAbs-APN-BL21-transformerte bakterier i nærvær av 0,4 mM IPTG i orbitale shakere ved 37 °C i 10 timer. Deretter indusere, rense og vurdere for ekspresjonen av rAbs-proteinet ved hjelp av rutinemessig proteinrensing.
- Frø 100 μL 0,5 x 105 CHO-celler per brønn i en 96-brønnsplate og inkuberes ved 37 °C i en 6% CO2 atmosfære i 18-24 timer. Når cellene når 80-90% konfluens, fortynn pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-plasmidet med Opti-MEM til en endelig konsentrasjon på 0,1 μg / μL, og inkuber 5 minutter ved romtemperatur før bruk for transfeksjon.
- Bland forsiktig 50 μL fortynnet pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-plasmid med 1 μl lipofektamin 2000 og 49 μl Opti-MEM, og inkuber blandingen i ytterligere 20 minutter ved romtemperatur. Tilsett 100 μL blanding til hver brønn i en 96-brønnplate inneholdende CHO-celler og inkuber ved 37 ° C i 6% CO2 atmosfære i 4-6 timer.
- Ved 4-6 timer etter transfeksjon, erstatt mediet med DMEM-F12-medium supplert med 10% FBS, og inkuber platen i ytterligere 48 timer. Deretter legger du til 400 μg / ml G418 til hver brønn for å velge de stabilt transfekterte cellene.
- Etter 10 dagers valg ved bruk av DMEM-F12-medium supplert med 10% FBS og 400 μg / ml G418, sorter cellene (3,0 × 107 celler / ml) ved fluorescensaktivert cellesortering. Omtrent 10-15% av cellepopulasjonen var positive.
- Serielt fortynnede høstede positive celler, frø i gjennomsnitt 0,5-2 celler per brønn i en 96-brønnsplate og kultur i en 37 °C, 6% CO2 -inkubator. Oppretthold de stabilt transfekterte pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-cellene ved å velge med G418 (200 μg / ml).
- FBS-konsentrasjonen i det ovenfor beskrevne cellekulturmediet reduseres gradvis fra 10% til 0% i løpet av den logaritmiske vekstfasen over tidsperioden på 3 uker. Deretter tilpasser de adherente CHO-cellene til suspensjonsvekst i et serumfritt medium.
- Dyrkning av sådde pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler i logaritmisk vekstfase i serumfritt medium med en tetthet på 0,8-1,0 × 105 celler/ml i risteflasker ved 80-110 o/min ristehastighet og 37 °C, 6% CO2.
- Samle cellesuspensjonen hver 12. time for å bestemme endringer i cellens levedyktighet og vitalitet ved hjelp av et celletellingssett (f.eks. CCK-8) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Antistoffekspresjon når toppnivåer når cellens levedyktighet reduseres til 80% og celletettheten når 1,0-2,0 × 106 celler / ml. Høst cellesupernatanter ved hjelp av sentrifugering, filtrer ved hjelp av et 0,22 μm polytetrafluoretylenmembranfilter, og rens med protein A-agarose.
- Bekreft produksjon av APN-spesifikke antistoffer ved bruk av indirekte immunfluorescensanalyser (IFA).
- Bestem antistofftitere og bindingsaffiniteter ved bruk av ELISA-analyse som beskrevet tidligere. 23 Beregn likevektsdissosiasjonskonstanten (KD-verdi ) av antistoffene med en fire-parameter logistisk ligning ved hjelp av programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble det rensede, løselige APN-proteinet (2,12 mg/ml) brukt til immunisering av mus. Mus immunisert med APN-proteinet fire ganger med 14-dagers intervaller viste en høyere antistofftiter mot APN i sera. Selv om 14 hybridomer ble oppnådd ved hjelp av fusjonseksperimentene, overlevde bare 9 hybridomer de tre kontinuerlige fryse-tine-syklusene, noe som resulterte i 9 stabile kloner som utskilte antistoffer mot APN. Alle disse cellene er runde, lyse og klare (figur 1). De rensede mAbs med tunge og lette kjeder (henholdsvis 50 kDa og 25 kDa) ble bekreftet av SDS-PAGE og funnet i de rensede ascites (figur 2). Titere av disse anti-APN mAbs i kultur supernatants og ascites er vist i tabell 2.
Resultatet av muse mAbs isotyping viste at mAbs avledet fra kloner 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 og 6C56 hadde IgG2b subklasser, mens APN-2A20 var et IgG2a κappa- (κ) type antistoff, og mAbs APN-3FD9, -3F10 og -10F3 tilhørte IgM-type og bearbeidede κ lette kjeder (tabell 3). Som vist i tabell 4 viste de fleste av disse mAbs AV-verdier på over 50%, noe som indikerer at de målrettet mot forskjellige epitoper i APN, mens APN-5C51-antistoffet gjenkjente antigene epitoper som ligner de som er anerkjent av APN-3C48, -5B31 og -6C56 mAbs.
APN-5B36 viste betydelig høyere antistofftiter sammenlignet med andre mAbs. Derfor ble APN-5B36 VH-VL-genet amplifisert og ligert til en pET28a (+) eller pIRES2-ZsGreen1-vektor for å konstruere de rekombinante ekspresjonsplasmidene pET28a (+)-rAbs-APN og pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN, henholdsvis (figur 3). Antistoffene uttrykt av både pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) og pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler ble renset og analysert ved hjelp av ELISA- og IFA-analyser. Imidlertid, som vist i figur 4, var det bare antistoffet uttrykt i supernatanten av pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler som gjenkjente APN-proteinet, og det samme gjorde hybridomavledede mAbs. Dette rekombinante antistoffet besto av tunge IgG2b-kjeder og lette lambdakjeder, og viste en titer på 2,56 × 105 målt ved hjelp av ELISA. Bindingen av APN-5B36 mAbs til APN-proteiner nådde en likevekt tidligere enn rAbs gjorde (figur 5), som viser KD-verdipå (4,232±0,475) × 10-9 og (2,201±0,367) × henholdsvis 10-8 mol / L.
| Grunning | Sekvens (5'-3') | ||
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG | ||
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTCGTGATTCGA | ||
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGAGGGAGAGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
Tabell 1. De spesifikke primerne som ble brukt i denne studien.
| Celler | Titre av supernatanter (U/ml) | Titre av ascites (U / ml) |
| 2A20 | 0,64×104 | 3.20×105 |
| 5B31 | 1.28×104 | 1.60×105 |
| 5B36 | 0,64×104 | 1.28×106 |
| 3C48 | 0,16×104 | 0,80×105 |
| 5C51 | 0,16×104 | 0,80×104 |
| 6C56 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3FD9 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3F10 | 0,16×104 | 0,16×105 |
| 10F3 | 0,80×103 | 0,32×105 |
Tabell 2. ELISA-titerne til APN mAbs.
| Ig | IgA | Igm | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | Kappa | Lambda | Sammendrag | |
| 2A20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a, Kappa |
| 5B31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b, Lambda |
| 5B36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b, Lambda |
| 3C48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b, Lambda |
| 5C51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b, Lambda |
| 6C56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b, Lambda |
| 3FD9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM, Kappa |
| 3F10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM, Kappa |
| 10F3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM, Kappa |
Tabell 3. Isotyper av hybridomavledede APN mAbs.
| mAbs | AV (100 %) | ||||||||
| 2A20 | 5B31 | 5B36 | 3C48 | 5C51 | 6C56 | 3FD9 | 3F10 | 10F3 | |
| 2A20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5B31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5B36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3C48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5C51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6C56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3FD9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3F10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10F3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
Tabell 4. Diskriminering av antigen-epitopspesifisitet av APN-spesifikke mAbs. AV-verdier større enn 0,5 indikerer at disse to mAbs gjenkjenner forskjellige antigeniske steder; AV-verdier mindre enn 0,5 indikerer at disse to mAbs gjenkjenner et lignende antigenisk sted.
Figur 1. Bilde av hybridomer. Under mikroskopisk analyse er hybridomer runde, lyse og klare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Rekombinante antistoffekspresjonsnivåer og ascites analysert ved hjelp av SDS-PAGE. (A) Lane M, protein markør; lane 1, renset pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) lysat; bane 2, pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) supernatant; lane 3, ascites væske renset med 33% (NH 4) 2SO4 nedbør. (B) Lane M, protein markør; lane 1, ascites væske renset ved hjelp av protein A agarose. I denne analysen ble 3-5 μg totalt protein lastet inn i hver bane av gelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Rekombinante ekspresjonsplasmider pET28a (+)-rAbs-APN og pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN analysert ved hjelp av agarosegelelektroforese. Lane M, Trans 2K pluss DNA-markør; bane 1, pET28a (+) vektor (5369 bp); lane 2 og 5, VH-VL gen kombinert med APN-5B36 ledersekvens; lane 3, pET28a (+)-rAbs-APN plasmid uttrykt i BL21 (DE3) E. coli; bane 4, pIRES2-ZsGreen1 vektor (5283 bp); bane 6, pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN plasmid uttrykt i DH5α E. coli. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Ekspresjon av rekombinant antistoffprotein og ascites analysert ved bruk av indirekte immunfluorescens. pEGFP-C1-APN-IPEC-J2-celler (grønn fluorescens) stabilt uttrykkende APN ble behandlet med (A) PBS, brukt som kontrollbehandling; (B) renset protein uttrykt av pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); (C) APN polyklonalt antistoff (1:500); (D) renset ascites væske (1:500); E) renset supernatant oppnådd fra pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-celler (1:500). DAPI ble brukt som kjernefysisk motflekk i konfokalmikroskopi. Cellene inkubert med DyLight 549-konjugert geit anti-mus IgG sekundært antistoff (1:200) og behandlet med renset ascites og renset supernatant fra pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO celler viste en robust rød-fluorescens signal indikerer som APN polyklonale antistoff gjorde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Bestemmelse av antistoff relative bindingsaffiniteter ved bruk av ELISA22. Absorpsjon av prøver som inneholder APN-5B36 mAbs eller rAbs, i fravær og tilstedeværelse av APN-protein, ble målt ved bølgelengden på 450 nm. Bindingskurven ble plottet ved hjelp av en fire-parameter logistisk kurvetilpasning; X-akse viser den logaritmiske konsentrasjonen av antistoffer, og y-aksen viser absorbansen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Induksjon av slimhinneimmunitet er en av de mest effektive tilnærmingene for å motvirke patogener og i forebygging og behandling av ulike sykdommer. APN, et sterkt uttrykt membranbundet protein i tarmslimhinnen, er involvert i induksjon av adaptiv immunrespons og i reseptormediert viral og bakteriell endocytose 1,5,8. APN brukes som antigenpartikler i mange formater av antigenbelastning og vaksinelevering. Den orale administrasjonen av APN-målrettede antistoffer kan også fremkalle effektive immunresponser 18,24,25. Imidlertid krever monoklonale antistoffer rettet mot forskjellige APN-spesifikke epitoper ytterligere undersøkelser.
Metodene beskrevet her ble brukt til å produsere monoklonale antistoffer mot APN ved bruk av både tradisjonelle hybridomer og rekombinante teknologier. Denne tilnærmingen kan brukes i produksjon av andre mAbs. Først fulgte vi en tidligere nevnt protokoll for å oppnå ni mAbs avledet fra forskjellige hybridoma-kloner. Selv om titerne av disse mAbs i cellesupernatanter og ascites var forskjellige, inneholdt alle mAbs 50 kDa tungkjede og 25 kDa lettkjede og viste spesifikk binding med svinens APN-protein. Resultatene av isotyping og identifisering av antigenepitoper viste at de fleste mAbene rettet seg mot ulike epitoper og tilhørte ulike antistofftyper. Disse resultatene indikerer at tradisjonell hybridoma-teknologi fortsatt er et effektivt valg i produksjonen av mAbs.
Tilnærminger som brukes til rekombinant-antistoffproduksjon kan øke mAb-produksjonseffektiviteten og minimere arbeids- og tidsrelaterte kostnader. Derfor har disse tilnærmingene vokst i popularitet, spesielt i utviklingen av antistoffer for diagnostiske og terapeutiske anvendelser16,17,26. rAbs viser flere fordeler i forhold til hybridoma-avledede mAbs. For det første kan rAbs produseres in vitro ved å klone antistoffgener i ekspresjonsvektorer, og dermed eliminere dyrebruk i antistoffproduksjon. I tillegg resulterer bruk av eukaryote eller prokaryote ekspresjonssystemer for å produsere rAbs i lave batch-til-batch-variasjoner og øker påliteligheten og stabiliteten til sluttproduktet. I motsetning til dette gjenkjenner mAbs produsert ved hjelp av hybridomer ofte ikke eller binder seg til de målrettede antigenepitopene, og påvirkes av hybridomcellelinjedrift, forurensning og gentap og mutasjoner. For tiden brukes hybridomavledede mAbs mest i diagnostiske eller terapeutiske immunreagenser, noe som understreker behovet for å produsere stabile og pålitelige antistoffer i en begrenset produksjonsperiode. For diagnostiske og terapeutiske anvendelser er rekombinant antistoffteknologi et bedre valg enn tradisjonell hybridombasert tilnærming. Dette skyldes at rekombinant antistoffteknologi tillater oss å modifisere sekvensen av rAbs for å bytte immunoglobulinisotyper, og dermed øke bindingsspesifisiteten til antistoffet14,16,17.
I denne studien brukte vi antistoff-engineering teknologi for å oppnå APN-målrettede rekombinante antistoffer. Vi fant at både milten til immuniserte mus og hybridomceller var like effektive for å amplifisere mAb tung- og lettkjedesekvensene. Antistoffet uttrykt ved pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) gjenkjente ikke APN effektivt i verken ELISA- eller indirekte immunfluorescensanalyser. Imidlertid gjenkjente rAbs uttrykt av pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-cellesuspensjonen og hybridomavledede mAbs og effektivt bindte APN-proteinet. Metodene beskrevet i denne studien kan brukes til å utvikle APN-antistoffbasert ADC og andre terapeutiske produkter rettet mot forskjellige APN-spesifikke epitoper. Denne studien vil også bidra til ytterligere å klargjøre APNs rolle i forebygging og behandling av ulike sykdommer. Strategier for å forbedre affiniteten og utbyttet av rAbs krever imidlertid ytterligere undersøkelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt. Alle forfatterne godkjente og ga sitt uttrykkelige samtykke til publisering av manuskriptet.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Chinese National Science Foundation Grant (nr. 32072820, 31702242), tilskudd fra Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) og Talents på høyt nivå fra Yangzhou University Scientific Research Foundation, et prosjekt grunnlagt av Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), Hoboken, N.J. 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient's need. British Journal of Nursing. 24 (16), Suppl 1 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
