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Immunology and Infection

पोर्सिन आंतों के म्यूकोसल एपिथेलियम में एमिनोपेप्टिडेस एन को लक्षित करने वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन

Published: May 18, 2021 doi: 10.3791/62437
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1College of Veterinary Medicine (Institute of comparative medicine), Yangzhou University, 2Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 3Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety of Ministry of Education of China, Yangzhou University

Summary

पारंपरिक हाइब्रिडोमा तकनीक का उपयोग करके उत्पादित पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी में व्यक्त पुनः संयोजक एंटीबॉडी पोर्सिन एमिनोपेप्टिडेस एन (एपीएन) प्रोटीन को पहचान और बांध सकते हैं।

Abstract

पोर्सिन एमिनोपेप्टिडेस एन (एपीएन), एक झिल्ली-बाध्य मेटालोपेप्टिडेस जो छोटे आंतों के श्लेष्म में प्रचुर मात्रा में मौजूद है, कम प्रोटीन अभिव्यक्ति, एंजाइम निष्क्रियता या संरचनात्मक परिवर्तनों जैसे किसी भी हस्तक्षेप के बिना एक म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू कर सकता है। यह एपीएन को टीकों के विकास में एक आकर्षक उम्मीदवार बनाता है जो म्यूकोसल एपिथेलियम को चुनिंदा रूप से लक्षित करते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एपीएन एंटरोटॉक्सिजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) एफ 4 और पारगम्य गैस्ट्रोएंटेराइटिस वायरस दोनों के लिए एक रिसेप्टर प्रोटीन है। इस प्रकार, एपीएन एपीएन-विशिष्ट एंटीबॉडी के आधार पर एंटीबॉडी-ड्रग संयुग्म या नए टीकों के विकास में वादा दिखाता है। इस अध्ययन में, हमने पारंपरिक हाइब्रिडोमा तकनीक और पुनः संयोजक एंटीबॉडी अभिव्यक्ति विधि का उपयोग करके एपीएन-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) के उत्पादन की तुलना की। हमने पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन और एक ई कोलाई अभिव्यक्ति बीएल 21 (डीई 3) तनाव का उपयोग करके एक स्थिर रूप से स्थानांतरित चीनी हैम्स्टर अंडाशय (सीएचओ) सेल लाइन भी स्थापित की, जो पीईटी 28 ए (+)-आरएबीएस-एपीएन वेक्टर को परेशान करती है। परिणाम बताते हैं कि हाइब्रिडोमा का उपयोग करके उत्पादित पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं और एमएबी में व्यक्त एंटीबॉडी एपीएन प्रोटीन को पहचान और बांध सकते हैं। यह विभिन्न एपीएन-विशिष्ट एपिटोप्स को लक्षित करने वाले चिकित्सीय विकास के लिए एपीएन रिसेप्टर फ़ंक्शन के आगे स्पष्टीकरण के लिए आधार प्रदान करता है।

Introduction

एमिनोपेप्टिडेस एन (एपीएन), एक चांदनी एंजाइम जो मेटालोप्रोटीनेज एम 1 परिवार से संबंधित है, एंजाइम-निर्भर और एंजाइम-स्वतंत्रमार्गों 1,2 के माध्यम से ट्यूमर मार्कर, रिसेप्टर और सिग्नलिंग अणु के रूप में कार्य करता है। अपनी जैविक गतिविधि के नियमन के लिए विभिन्न बायोएक्टिव पेप्टाइड्स के एन-टर्मिनल एमिनो-एसिड अवशेषों को छोड़ने के अलावा, एपीएन विभिन्न भड़काऊ रोगों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एपीएन एंटीजन प्रसंस्करण और छंटनी पेप्टाइड्स द्वारा प्रस्तुति में भाग लेता है जो प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स क्लास II अणुओं 2,3 से कसकर बंधते हैं। एपीएन कई सिग्नल ट्रांसडक्शन में भाग लेने वाले जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के साथ बंधकर, साइटोकिन स्राव को संशोधित करके और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 4,5,6,7 में एफसी गामा रिसेप्टर-मध्यस्थता फागोसाइटोसिस में योगदान करके विरोधी भड़काऊ प्रभाव भी डालता है।

व्यापक रूप से वितरित झिल्ली-बाध्य एक्सोपेप्टिडेस के रूप में, एपीएन पोर्सिन छोटे आंतों के श्लेष्म में प्रचुर मात्रा में है और रिसेप्टर-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस 1,5,8 के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है। एपीएन कोशिका प्रवेश के लिए पारगम्य गैस्ट्रोएंटेराइटिस वायरस के स्पाइक प्रोटीन को पहचानता है और बांधता है, और मेजबान कोशिकाओं9,10,11 के साथ बैक्टीरिया के पालन को प्रभावित करने के लिए सीधे एंटरोटॉक्सिजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई एफ 4 फिम्ब्रिया के एफएईजी सबयूनिट के साथ बातचीत करता है। इस प्रकार, एपीएन वायरल और जीवाणु संक्रामक रोगों के उपचार में एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य है।

1975 में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) उत्पादन के लिए हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी और अन्य रणनीतियों के विकास के बाद से, एमएबी का व्यापक रूप से इम्यूनोथेरेपी, दवा वितरण और निदान12,13,14 में उपयोग किया गया है। वर्तमान में, एमएबी का उपयोग सफलतापूर्वक बीमारियों, जैसे कैंसर, सूजन आंत्र रोग और मल्टीपल स्केलेरोसिस12,15 के इलाज के लिए किया जाता है। उनकी मजबूत आत्मीयता और विशिष्टता के कारण, एमएबी एंटीबॉडी-ड्रग कंजुगेट (एडीसी) या नए टीकोंके विकास में आदर्श लक्ष्य हो सकते हैं। एपीएन प्रोटीन विशिष्ट कोशिकाओं को चुनिंदा एंटीजन देने के लिए महत्वपूर्ण है, और कम प्रोटीन अभिव्यक्ति, एंजाइम निष्क्रियता, या संरचनात्मक परिवर्तन 5,8,18 सहित किसी भी हस्तक्षेप के बिना रोगजनकों के खिलाफ एक विशिष्ट और मजबूत म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकता है। इसलिए, एपीएन-विशिष्ट एमएबी पर आधारित चिकित्सीय उत्पाद बैक्टीरिया और वायरल संक्रमण के खिलाफ वादा दिखाते हैं। इस अध्ययन में, हम हाइब्रिडोमा तकनीक का उपयोग करके एपीएन-विशिष्ट एमएबी के उत्पादन का वर्णन करते हैं, और प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक वैक्टर का उपयोग करके एंटी-एपीएन पुनः संयोजक एंटीबॉडी (आरएबी) की अभिव्यक्ति करते हैं। परिणाम इंगित करता है कि एपीएन प्रोटीन को पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं और हाइब्रिडोमा-व्युत्पन्न एमएबीएस में व्यक्त दोनों आरएबी द्वारा पहचाना गया था।

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Protocol

इस अध्ययन में सभी पशु प्रयोगों को यंग्ज़हौ विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (SYXK20200041) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पोर्सिन एपीएन प्रोटीन एंटीजन की तैयारी

नोट: पीईटी 28 ए (+)-एपीएन-बीएल 21 (डीई 3) स्ट्रेन और एपीएन स्थिर रूप से व्यक्त कोशिकाओं पीईजीएफपी-सी 1-एपीएन-आईपीईसी-जे 2 का निर्माण पिछले अध्ययन11 में किया गया था।

  1. एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से बैक्टीरिया को पुनर्प्राप्त करें और एकल कॉलोनी अलगाव के लिए 50 μg / mL Kanamycin (km+) युक्त लुरिया-बर्टानी (LB) प्लेटों पर लकीर डालें।
  2. ताजी लकीर वाली प्लेट से एक कॉलोनी का चयन करें, 4 मिलीलीटर एलबी माध्यम (10 ग्राम / एल ट्रिप्टोन, 10 ग्राम / एल सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) और 5 ग्राम / एल खमीर अर्क, पीएच 7.2) में किमी + (50 μg / mL) के साथ पूरक है, और 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन (178 आरपीएम) के साथ रात भर (12-16 घंटे) बढ़ने के लिए छोड़ दें।
  3. तैयार बैक्टीरिया को ताजा किमी + एलबी शोरबा में 1:100 पर पतला करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए हिलाने के साथ इनक्यूबेट करें जब तक कि ओडी600 0.4-0.6 तक न पहुंच जाए।
  4. 0.4 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए माध्यम में आइसोप्रोपिल β-डी-1-थियोगैलेक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी) जोड़ें, और 16 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 10 घंटे के लिए संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
  5. नतीजतन, आईपीटीजी प्रेरण (10,000 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट) का उपयोग करके बैक्टीरिया को सेंट्रीफ्यूज और फसल दें।
  6. सेल गोली को 5 मिलीलीटर एलईयू (लाइसिस/बैलेंस/वॉश) बफर (50 एमएम निर्जल सोडियम फॉस्फेट मोनोबैसिक (एनएएच2पीओ4) और 300 एमएम एनएसीएल, पीएच 8.0) का उपयोग करके पुन: निलंबित करें जिसमें 1 मिलीग्राम / एमएल लाइसोजाइम होता है। अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके बर्फ और सोनिकेट पर 30 मिनट के लिए बैक्टीरिया निलंबन को पूरी तरह से हिलाएं (15 एस पल्स और 20 सेकंड, 15 मिनट)।
  7. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 10,000 × ग्राम पर क्रूड सेल लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एक पूर्व-समतुल्य स्तंभ में स्थानांतरित करें और गुरुत्वाकर्षण जल निकासी से 1-2 मिनट पहले इनक्यूबेट करें। इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
  8. 20 एमएल एलयू बफर का उपयोग करके कॉलम को धोएं और गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करके सूखा लें। 9 एमएल क्षालन बफर (50 एमएम एनएएच2पीओ4, 300 एमएम एनएसीएल और 250 एमएम इमिडाज़ोल, पीएच 8.0) का उपयोग करके हिस्टिडाइन-टैग किए गए एपीएन प्रोटीन को एल्यूट करें और डायलिसिस ट्यूबिंग में एकत्र करें।
  9. सोडियम कार्बोनेट-सोडियम बाइकार्बोनेट (पीबीएस, 135 एमएम एनएसीएल, 4.7 एमएम पोटेशियम क्लोराइड, 2 एमएम एनएएच 2 पीओ 4, और 10 एमएम डोडेकाहाइड्रेट सोडियम फॉस्फेट डिबासिक, पीएच7.2) बफर में4 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन समाधान को रात भर डायलाइज़ करें।
  10. एपीएन प्रोटीन की शुद्धता का आकलन करने के लिए 12.0% एसडीएस-पेज जेल और वेस्टर्न ब्लॉटिंग का उपयोग करके विश्लेषण करें।
    1. जेल के प्रत्येक कुएं में 5 μg प्रोटीन लोड करें और 1.5 घंटे के लिए 110 V पर चलने दें। फिर, 15 वी पर 50 मिनट के लिए पीवीडीएफ झिल्ली पर प्रोटीन स्थानांतरित करें। बीसीए परख का उपयोग करके शुद्ध प्रोटीन की एकाग्रता निर्धारित करें।

2. पशु टीकाकरण

  1. उपचर्म (एससी) 6-8 सप्ताह की उम्र के मादा बीएएलबी / सी चूहों को हर 2 सप्ताह में एक बार 50 μg एपीएन प्रोटीन या पीबीएस (नकारात्मक नियंत्रण) के साथ सहायक दवाओं के साथ मिश्रित इंजेक्शन देते हैं। पूर्ण फ्रायंड के सहायक का उपयोग करें जिसमें प्रारंभिक टीकाकरण के लिए गर्मी से मारे गए माइकोबैक्टीरिया शामिल हैं, और बूस्टर टीकाकरण के लिए अपूर्ण फ्रायंड के सहायक शामिल हैं। क्रमशः एपीएन प्रोटीन (या पीबीएस) और फ्रायंड के सहायक या अपूर्ण फ्रायंड के सहायक की समान मात्रा मिलाएं।
  2. 0.05 एम पीबीएस (पीएच 9.6) में पतला 5 μg / mL APN प्रोटीन के साथ लेपित माइक्रोटिटर प्लेट का उपयोग करके अप्रत्यक्ष एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा इन चूहों के सेरा में एपीएन के खिलाफ एंटीबॉडी टिटर्स का पता लगाएं। .

3. एपीएन के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन करने के लिए हाइब्रिडोमा तकनीक

  1. इंट्रापरिटोनियल (यानी) अंतिम एंटीजन बूस्ट के लिए चयनित चूहों में एपीएन प्रोटीन के 100 μg इंजेक्ट करें।
  2. तीन दिन बाद, पेंटोबार्बिटल सोडियम (50 मिलीग्राम / किग्रा, वी / वी, इंट्रापरिटोनियल) और ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करके चूहों को इच्छामृत्यु दें।
  3. प्लीहा इकट्ठा करें, और रक्त और वसा कोशिकाओं को हटाने के लिए दो बार डीएमईएम से धोएं। ऊतक मलबे को हटाने के लिए 200-जाल कॉपर ग्रिड का उपयोग करके प्लीहा-सेल निलंबन को फ़िल्टर करें, और प्लीहा की झिल्ली को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन (1500 × ग्राम, 10 मिनट) का उपयोग करके प्लीहा कोशिकाओं की कटाई करें।
  4. सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए 25 सेमी 2फ्लास्क में बीज माउस मायलोमा एसपी2/0 कोशिकाओं में 5 मिलीलीटर डीएमईएम होता है जो 6% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 37 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर के साथ पूरक होता है। संस्कृति के 5-6 दिनों के बाद, कोशिकाएं पुनर्जीवन के बाद 80% -90% संगम तक पहुंच जाती हैं और विकास लॉग चरण में होती हैं। माइक्रोस्कोप के नीचे, कोशिकाएं गोल, उज्ज्वल और स्पष्ट होती हैं।
  5. संकरण से एक दिन पहले, पहले प्रकाशित विधि12,19 के अनुसार चूहों के पेरिटोनियल गुहाओं से मैक्रोफेज एकत्र करें।
  6. 96-वेल प्लेटों में 0.1-0.2 × 105/एमएल के घनत्व पर बीज पेरिटोनियल मैक्रोफेज, प्रत्येक अच्छी तरह से एचएटी माध्यम के 100 μL (डीएमईएम 10% एफबीएस और 1एक्स एचएटी पूरक के साथ पूरक) होते हैं, और 37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ2 ह्यूमिडिफाइड वातावरण में रात भर इनक्यूबेट करते हैं।
  7. संकरण के लिए, धीरे-धीरे 8-10 बोतलों से एक पिपेट के साथ एसपी 2/0 कोशिकाओं को एस्पिरेट करें, और सीरम-मुक्त डीएमईएम माध्यम के 10 एमएल में निलंबित करें। ताजा डीएमईएम, सेंट्रीफ्यूज (1500 × ग्राम, 10 मिनट) के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं, और फिर डीएमईएम के 10 एमएल में फिर से निलंबित करें।
  8. 10: 1 के अनुपात में एसपी 2/0 कोशिकाओं के साथ मात्रात्मक प्लीहा कोशिकाओं को मिलाएं और 50 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूज (1500 × ग्राम, 10 मिनट) और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। ट्यूबों के तल पर सेल छर्रों को इकट्ठा करें और संकरण से पहले छर्रों को ढीला करने के लिए हथेली से टैप करें।
  9. 1 मिलीलीटर पॉलीथीन ग्लाइकोल 1500 (पीईजी 1500) जोड़ें, जिसे 37 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गर्म किया जाता है, ट्यूब के निचले हिस्से को धीरे से घुमाते हुए 45 सेकंड की समय अवधि में ढीले सेल पेलेट में ड्रॉपर का उपयोग करके ड्रॉपवाइज डालें।
  10. धीरे-धीरे 90 सेकंड की अवधि में उपरोक्त मिश्रण में 37 डिग्री सेल्सियस तक 1 मिलीलीटर डीएमईएम जोड़ें, इसके बाद ताजा डीएमईएम का एक और 30 मिलीलीटर जोड़ें। फ्यूजन ट्यूब को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
  11. गर्म स्नान में इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं की कटाई करें और एचएटी माध्यम में फिर से निलंबित करें। फिर पेरिटोनियल मैक्रोफेज के साथ टीका लगाए गए 96-वेल प्लेट में संस्कृति।
  12. पांच दिन बाद, प्रत्येक कुएं में 100 μL ताजा एचएटी माध्यम जोड़ें, और अतिरिक्त 5 दिनों के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें, जिसके बाद माध्यम को एचटी माध्यम (डीएमईएम 10% एफबीएस और 1एक्स एचटी पूरक के साथ पूरक) से बदलें।
  13. एलिसा परख का उपयोग करके हाइब्रिडोमा सुपरनैटेंट में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का विश्लेषण करने के लिए 0.05 एम पीबीएस (पीएच 9.6) में पतला 5 μg / mL APN प्रोटीन के साथ लेपित माइक्रोटिटर प्लेट का उपयोग करें।
    1. जब 96-वेल प्लेट के कुओं में माध्यम पीला हो जाता है (सेल वृद्धि और मेटाबोलाइट रिलीज के कारण, माध्यम में पीएच 6.8 तक कम हो जाता है, और फिनोल लाल फ्यूशिया से पीले रंग में बदल जाता है) या सेल क्लस्टर देखे जाते हैं, तो चयनित कुओं से 100 μL सुपरनैटेंट प्राप्त करें और लेपित एलिसा प्लेट के कुओं में जोड़ें। OD450 मानों को मापने के लिए एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करें।
    2. एपीएन और गैर-संक्रमित माउस सीरम के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में करें, और पीबीएस को रिक्त नियंत्रण के रूप में उपयोग करें। इस अध्ययन में, नमूने के ओडी 450 अनुपात से नकारात्मक नियंत्रण (पी / एन) ≥ 2.1 को सकारात्मक चयन मानक के रूप में मान्यता दी गई थी।
  14. लगातार तीन सकारात्मक चयन राउंड के बाद, सीमित कमजोर पड़ने वाले परख के लिए एपीएन प्रोटीन के खिलाफ बढ़ी हुई सीरोलॉजी प्रतिक्रिया दिखाने वाले हाइब्रिडोमा का चयन करें।
    1. पेरिटोनियल मैक्रोफेज और बीज को 96-वेल प्लेटों में तैयार करें जैसा कि पहले वर्णित है।
    2. एचटी माध्यम में हाइब्रिडोमा कोशिकाओं को प्रति कुएं 0.5-2 कोशिकाओं के औसत पर निलंबित करें और 37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ2 इनक्यूबेटर में कल्चर करें। एलिसा इम्यूनोसे द्वारा इंगित सकारात्मक दर 100% तक पहुंचने तक इस चरण को तीन या चार बार दोहराएं।
  15. निरंतर ठंड और पिघलने के दबाव में, सकारात्मक हाइब्रिडोमा कोशिकाओं का चयन करें जो एंटी-एपीएन एंटीबॉडी को स्थिर रूप से स्रावित करने और सामान्य रूप से प्रसार करने में सक्षम हैं।
    1. प्रत्येक माउस (8-10 सप्ताह) को 0.3 एमएल प्रिस्टान का एक आईपी इंजेक्शन दें। प्राचीन प्राप्त करने के 10 दिनों के बाद, प्रत्येक माउस को 0.5 एमएल पीबीएस (पीएच 7.2) में 2-5 x 105 हाइब्रिडोमा कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट करें।
    2. इंजेक्शन के 8 से 10 दिन बाद इन चूहों के पेरिटोनियल गुहा से पेरिटोनियल द्रव को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें।
    3. 15 मिनट के लिए 5,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सतह पर तैरनेवालों की कटाई करें, और 33% संतृप्त अमोनियम सल्फेट [(एनएच 4)2एसओ4] वर्षा और प्रोटीन ए एग्रोस का उपयोग करके सुपरनैटेंट में एंटीबॉडी को शुद्ध करें।

4. एपीएन प्रोटीन के खिलाफ एमएबी का लक्षण वर्णन।

  1. एसबीए क्लोनोटाइपिंग सिस्टम-एचआरपी20 का उपयोग करके एकत्र किए गए एमएबी के इम्युनोग्लोबुलिन उपप्रकार का निर्धारण करें। एमएबी शुद्धता और विशिष्टता का आकलन करने के लिए एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉटिंग का उपयोग करें।
  2. एलिसा21 का उपयोग करके एपीएन प्रोटीन के खिलाफ एमएबी एपिटोप विशिष्टता का विश्लेषण करें। एडिटिविटी वैल्यू (एवी) ओडीएमएबीएस (ए + बी) से (ओडी एमएबीएस-ए + ओडीएमएबीएस-बी) का अनुपात है, जिसका उपयोग यह मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है कि क्याएमएबी एक ही एंटीजेनिक साइट को पहचानते हैं; ODmAbs-A और OD mAbs-b अकेले APN के खिलाफ विभिन्न मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के OD450 मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और OD mAbs(a+b) APN के खिलाफ दोmAbs के 1: 1 मिश्रण के OD450 मानों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    1. प्रत्येक नमूने का कम से कम चार प्रतिकृतियों का आकलन करें, और पूरे प्रयोग को कम से कम तीन बार दोहराएं।

5. एपीएन के खिलाफ आरएबी की अभिव्यक्ति

  1. उपर्युक्त हाइब्रिडोमा कोशिकाओं और एपीएन-प्रतिरक्षित चूहों की तिल्ली से कुल आरएनए निकालें (उदाहरण के लिए, टीआरआईज़ोल)22। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके पूरक डीएनए (सीडीएनए) को संश्लेषित करें।
  2. नेस्टेड पीसीआर का उपयोग करके एमएबी के चर क्षेत्रों को बढ़ाएं और अनुक्रमण का उपयोग करके भारी श्रृंखला (वीएच) और लाइट चेन (वीएल) अनुक्रम निर्धारित करें। आईएमजीटी माउस जीनोम विश्लेषण उपकरण (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php) का उपयोग करके वीएच और वीएल एन्कोडिंग जीन का विश्लेषण करें।
  3. वीएच और वीएल जीन को लीडर अनुक्रमों के साथ मिलाएं और क्रमिक रूप से उन्हें क्रमशः पीईटी 28 ए (+) और पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1 वैक्टर में उप-क्लोन करें, जिससे निशान रहित डीएनए टुकड़ा सम्मिलन की अनुमति मिल सके। विशिष्ट प्राइमरों को तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है।
  4. 10 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऑर्बिटल शेकर्स में 0.4 एमएम आईपीटीजी की उपस्थिति में पीईटी 28 ए (+)-आरएबीएस-एपीएन-बीएल 21-रूपांतरित बैक्टीरिया विकसित करें। फिर नियमित प्रोटीन शुद्धिकरण का उपयोग करके आरएबीएस प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित, शुद्ध और आकलन करें।
  5. बीज 100 μL 0.5 x 105 CHO कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से 96-वेल प्लेट में डालें और 18-24 घंटे के लिए 6%CO2 वातावरण में 37 °C पर इनक्यूबेट करें। जब कोशिकाएं 80-90% संगम तक पहुंच जाती हैं, तो ऑप्टि-एमईएम के साथ पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन1-आरएबीएस-एपीएन प्लास्मिड को 0.1 μg / μL की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें, और अभिकर्मक के लिए उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर 5 मिनट इनक्यूबेट करें।
  6. धीरे से 50 μL पतला PIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN प्लास्मिड को 1 μL लिपोफेक्टामाइन 2000 और 49 μL ऑप्टी-एमईएम के साथ मिलाएं, और मिश्रण को कमरे के तापमान पर अतिरिक्त 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सीएचओ कोशिकाओं वाले 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 100 μL मिश्रण जोड़ें और 4-6 घंटे के लिए 6%CO2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. 4-6 घंटे के पोस्ट-अभिकर्मक पर, माध्यम को डीएमईएम-एफ 12 माध्यम के साथ 10% एफबीएस के साथ पूरक करें, और प्लेट को 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, स्थिर रूप से स्थानांतरित कोशिकाओं का चयन करने के लिए प्रत्येक कुएं में 400 μg / mL G418 जोड़ें।
  8. डीएमईएम-एफ 12 माध्यम का उपयोग करके चयन के 10 दिनों के बाद, 10% एफबीएस और 400 μg / mL G418 के साथ पूरक, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा कोशिकाओं (3.0 × 107 सेल / एमएल) को सॉर्ट करें। सेल आबादी का लगभग 10-15% सकारात्मक था।
  9. क्रमिक रूप से पतला सकारात्मक कोशिकाएं, 96-वेल प्लेट में प्रति कुएं 0.5-2 कोशिकाओं के औसत पर बीज, और 37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ2 इनक्यूबेटर में संवर्धन। G418 (200 μg/mL) के साथ चयन का उपयोग करके स्थिर रूप से स्थानांतरित PIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO कोशिकाओं को बनाए रखें।
  10. उपरोक्त वर्णित सेल-कल्चर माध्यम में एफबीएस एकाग्रता 3 सप्ताह की समय अवधि में लघुगणकीय विकास चरण के दौरान धीरे-धीरे 10% से 0% तक कम हो जाती है। फिर, सीरम-मुक्त माध्यम में विकास को निलंबित करने के लिए अनुयायी सीएचओ कोशिकाओं को अनुकूलित करें।
  11. सीरम-मुक्त माध्यम में लघुगणकीय विकास चरण में बीज ति पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं को 80-110 आरपीएम हिलने की गति और 37 डिग्री सेल्सियस, 6% सीओ2 पर शेक फ्लास्क में 0.8-1.0 × 105 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर कल्चर करें।
  12. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल काउंटिंग किट (जैसे, सीसीके -8) का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता और जीवन शक्ति में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए हर 12 घंटे में सेल निलंबन एकत्र करें।
  13. एंटीबॉडी अभिव्यक्ति चरम स्तर तक पहुंच जाती है जब सेल व्यवहार्यता 80% तक कम हो जाती है और सेल घनत्व 1.0-2.0 × 106 सेल / एमएल तक पहुंच जाता है। सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके सेल सुपरनैटेंट की कटाई करें, 0.22 μm पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन झिल्ली फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें, और प्रोटीन ए एग्रोस का उपयोग करके शुद्ध करें।
  14. अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख (आईएफए) का उपयोग करके एपीएन-विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन की पुष्टि करें।
  15. एलिसा परख का उपयोग करके एंटीबॉडी टिटर्स और बाध्यकारी समानताओं का निर्धारण करें जैसा कि पहले वर्णित है। सॉफ्टवेयर का उपयोग करके चार-पैरामीटर लॉजिस्टिक समीकरण के साथ एंटीबॉडी के संतुलन पृथक्करण स्थिरांक (केडी मान) की गणना करें।

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Representative Results

इस अध्ययन में, माउस टीकाकरण के लिए शुद्ध घुलनशील एपीएन प्रोटीन (2.12 मिलीग्राम / एमएल) का उपयोग किया गया था। 14-दिन के अंतराल पर चार बार एपीएन प्रोटीन के साथ प्रतिरक्षित चूहों ने अपने सेरा में एपीएन के खिलाफ एक उच्च एंटीबॉडी टिटर का प्रदर्शन किया। यद्यपि संलयन प्रयोगों का उपयोग करके 14 हाइब्रिडोमा प्राप्त किए गए थे, केवल 9 हाइब्रिडोमा तीन निरंतर फ्रीज-पिघलने चक्रों से बच गए, जिसके परिणामस्वरूप 9 स्थिर क्लोन थे जो एपीएन के खिलाफ एंटीबॉडी का स्राव करते थे। ये सभी कोशिकाएं गोल, उज्ज्वल और स्पष्ट हैं (चित्रा 1)। भारी और हल्की चेन (क्रमशः 50 केडीए और 25 केडीए) रखने वाले शुद्ध एमएबी की पुष्टि एसडीएस-पेज द्वारा की गई थी और शुद्ध जलोदर में पाई गई थी (चित्रा 2)। संस्कृति सुपरनैटेंट और जलोदर में इन एंटी-एपीएन एमएबी के टिटर्स तालिका 2 में दिखाए गए हैं।

माउस एमएबीएस आइसोटाइपिंग के परिणाम से पता चला कि क्लोन 5बी31, 5बी36, 3सी48, 5सी51 और 6सी56 से प्राप्त एमएबीएस में आईजीजी2बी उपवर्ग थे, जबकि एपीएन-2ए20 एक आईजीजी2ए ए-ट्यूबप्पा टाइप एंटीबॉडी था, और एमएबीएस एपीएन-3एफडी9, -3एफ10 और -10एफ3 आईजीएम प्रकार के थे। जैसा कि तालिका 4 में दिखाया गया है, इनमें से अधिकांश एमएबी ने 50% से अधिक के एवी मान दिखाए, यह दर्शाता है कि उन्होंने एपीएन में विभिन्न एपिटोप्स को लक्षित किया, जबकि एपीएन -5 सी 51 एंटीबॉडी ने एपीएन -3 सी 48, -5 बी 31 और -6 सी 56 एमएबीएस द्वारा मान्यता प्राप्त एंटीजेनिक एपिटोप्स को मान्यता दी।

एपीएन -5 बी 36 ने अन्य एमएबी की तुलना में काफी अधिक एंटीबॉडी टिटर दिखाया। इसलिए, APN-5B36 VH-VL जीन को क्रमशः पुनः संयोजक अभिव्यक्ति प्लास्मिड pET28a (+)-rAbs-APN और PIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN के निर्माण के लिए pET28a (+) या PIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN में परिवर्धित और द्रवित किया गया था (चित्र 3)। पीईटी 28 ए (+)-आरएबीएस-एपीएन-बीएल 21 (डीई 3) और पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं द्वारा व्यक्त एंटीबॉडी को एलिसा और आईएफए परख का उपयोग करके शुद्ध और विश्लेषण किया गया था। हालांकि, जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, केवल पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं के सुपरनैटेंट में व्यक्त एंटीबॉडी ने एपीएन प्रोटीन को पहचाना, जैसा कि हाइब्रिडोमा-व्युत्पन्न एमएबीएस ने किया था। इस पुनः संयोजक एंटीबॉडी में आईजीजी 2 बी भारी श्रृंखलाएं और लैम्ब्डा लाइट चेन शामिल थे, और एलिसा का उपयोग करके निर्धारित 2.56 × 105 का टिटर दिखाया। एपीएन -5 बी 36 एमएबी का एपीएन प्रोटीन से बंधन आरएबीएस की तुलना में पहले एक संतुलन तक पहुंच गया (चित्रा 5), क्रमशः 10-9 और (2.201±±0.367) ×× 10-8 मोल / एल केकेडी मान को दर्शाता है।

प्रवेशिका अनुक्रम (5'-3')
VH-VL-F CCGGGTGGGGCCGGATAGACMGATGGGGGGCTG
VH-VL-R CCGGCCACACACCCCCACTTGACATTTGATGT
pET28a (+)-F TCCACCAGTCATGCTAGCCAACACGGTCGTGTCGA
pET28a (+)-R CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCtTAGTCccc
PIRES2-ZsGreen1-F CGACGGTACCGGGCCGGGGTAACACGGTCGTGGGA
PIRES2-ZsGreen1-R GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGaggatacctATTACCC

तालिका 1. इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट प्राइमर।

कोशिकाएँ सुपरनैटेंट (यू / एमएल) के टिटर्स जलोदर के टिटर्स (यू / एमएल)
2A20 0.64×104 3.20×105
5B31 1.28×104 1.60×105
5B36 0.64×104 1.28×106
3C48 0.16×104 0.80×105
5C51 0.16×104 0.80×104
6C56 0.80×103 0.80×104
3FD9 0.80×103 0.80×104
3F10 0.16×104 0.16×105
10F3 0.80×103 0.32×105

तालिका 2. एपीएन एमएबीएस के एलिसा टिटर्स।

आईजी IGA IGM IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 कापा लैम्ब्डा सारांश
2A20 1.735 0.023 0.011 0.006 0.903 0.044 0.015 0.137 0.073 आईजीजी 2 ए, कप्पा
5B31 1.199 0.006 0.003 0.005 0.005 1.731 0.004 0.004 0.413 IgG2b, लैम्ब्डा
5B36 1.652 0.012 0.013 0.01 0.008 2.41 0.002 0.003 0.707 IgG2b, लैम्ब्डा
3C48 0.951 0.063 0.068 0.104 0.062 1.785 0.059 0.065 0.51 IgG2b, लैम्ब्डा
5C51 1.064 0.008 0.007 0.008 0.008 1.87 0.004 0.004 0.415 IgG2b, लैम्ब्डा
6C56 0.78 0.062 0.06 0.063 0.063 1.516 0.062 0.061 0.387 IgG2b, लैम्ब्डा
3FD9 1.474 0.007 1.678 0.003 0.016 0.081 0.002 0.519 0.059 आईजीएम, कप्पा
3F10 1.21 0.002 1.454 0.009 0.008 0.054 0.003 0.414 0.096 आईजीएम, कप्पा
10F3 1.179 0.058 1.562 0.152 0.131 0.179 0.044 0.359 0.049 आईजीएम, कप्पा

तालिका 3. हाइब्रिडोमा-व्युत्पन्न एपीएन एमएबीएस के आइसोटाइप।

mAbs एवी (100%)
2A20 5B31 5B36 3C48 5C51 6C56 3FD9 3F10 10F3
2A20 - 0.601 0.905 0.889 0.804 0.884 1.009 1.047 0.914
5B31 0.601 - 0.871 0.754 0.464 0.694 0.613 0.88 0.989
5B36 0.905 0.871 - 0.794 0.684 0.934 0.91 1.07 0.959
3C48 0.889 0.754 0.794 - 0.461 0.709 0.428 1 0.787
5C51 0.804 0.464 0.684 0.461 - 0.301 0.601 0.594 0.852
6C56 0.884 0.694 0.934 0.709 0.301 - 1.216 0.583 0.389
3FD9 1.009 0.613 0.91 0.428 0.601 1.216 - 1.737 0.744
3F10 1.047 0.88 1.07 1 0.594 0.583 1.737 - 0.682
10F3 0.914 0.989 0.959 0.787 0.852 0.389 0.744 0.682 -

तालिका 4. "एपीएन-विशिष्ट एमएबी के एंटीजन-एपिटोप विशिष्टता का भेदभाव"। 0.5 से अधिक एवी मान इंगित करते हैं कि ये दो एमएबी विभिन्न एंटीजेनिक साइटों को पहचानते हैं; 0.5 से कम एवी मान इंगित करते हैं कि ये दो एमएबी एक समान एंटीजेनिक साइट को पहचानते हैं।

Figure 1
चित्र 1. हाइब्रिडोमास की छवि। सूक्ष्म विश्लेषण के तहत, हाइब्रिडोमा गोल, उज्ज्वल और स्पष्ट होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. पुनः संयोजक एंटीबॉडी अभिव्यक्ति स्तर और जलोदर का विश्लेषण एसडीएस-पेज का उपयोग करके किया गया। (ए) लेन एम, प्रोटीन मार्कर; लेन 1, शुद्ध पीईटी 28 ए (+)-आरएबीएस-एपीएन-बीएल 21 (डीई 3) लाइसेट; लेन 2, पीईटी 28 ए (+)-आरएबीएस-एपीएन-बीएल 21 (डीई 3) सुपरनैटेंट; लेन 3, जलोदर द्रव 33% (एनएच 4)2एसओ4 वर्षा द्वारा शुद्ध होता है। (बी) लेन एम, प्रोटीन मार्कर; लेन 1, प्रोटीन ए एगरोज का उपयोग करके जलोदर द्रव को शुद्ध किया जाता है। इस परख में, जेल के प्रत्येक लेन में कुल प्रोटीन का 3-5 μg लोड किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. पुनः संयोजक अभिव्यक्ति प्लास्मिड पीईटी 28 ए (+)-आरएबीएस-एपीएन और पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन का विश्लेषण एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके किया गया। लेन एम, ट्रांस 2 के प्लस डीएनए मार्कर; लेन 1, पीईटी 28 ए (+) वेक्टर (5369 बीपी); लेन 2 और 5, वीएच-वीएल जीन एपीएन -5 बी 36 नेता अनुक्रम के साथ संयुक्त; लेन 3, पीईटी 28 ए (+)-आरएबीएस-एपीएन प्लास्मिड बीएल 21 (डीई 3) ई कोलाई में व्यक्त किया गया; लेन 4, PIRES2-ZsGreen1 वेक्टर (5283 बीपी); लेन 6, PIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN प्लास्मिड DH5a E. coli में व्यक्त किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके पुनः संयोजक एंटीबॉडी प्रोटीन और जलोदर की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया। पीईजीएफपी-सी 1-एपीएन-आईपीईसी-जे 2 कोशिकाओं (हरी प्रतिदीप्ति) को स्थिर रूप से एपीएन व्यक्त करने के लिए (ए) पीबीएस के साथ इलाज किया गया था, जिसका उपयोग नियंत्रण उपचार के रूप में किया जाता था; (बी) पीईटी 28 ए (+)-आरएबीएस-एपीएन-बीएल 21 (डीई 3) द्वारा व्यक्त शुद्ध प्रोटीन; (सी) एपीएन पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (1: 500); (डी) शुद्ध जलोदर द्रव (1: 500); ई) पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं (1: 500) से प्राप्त शुद्ध सुपरनैटेंट। DAPI का उपयोग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में परमाणु काउंटरस्टेन के रूप में किया गया था। डायलाइट 549-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी द्वितीयक एंटीबॉडी (1:200) के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं और पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं से शुद्ध जलोदर और शुद्ध सुपरनैटेंट के साथ इलाज किया गया, जिसमें एपीएन पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की तरह एक मजबूत लाल-प्रतिदीप्ति संकेत संकेत दिखाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. एलिसा22 का उपयोग करके एंटीबॉडी सापेक्ष बाध्यकारी समानताओं का निर्धारण। एपीएन प्रोटीन की अनुपस्थिति और उपस्थिति में एपीएन -5 बी 36 एमएबीएस या आरएबीएस युक्त नमूनों का अवशोषण, 450 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर मापा गया था। बाइंडिंग कर्व को चार-पैरामीटर लॉजिस्टिक कर्व फिट का उपयोग करके प्लॉट किया गया था; एक्स-अक्ष एंटीबॉडी की लघुगणकीय एकाग्रता को दर्शाता है, और वाई-अक्ष अवशोषण को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

म्यूकोसल प्रतिरक्षा का प्रेरण रोगजनकों का मुकाबला करने और विभिन्न बीमारियों की रोकथाम और उपचार में सबसे प्रभावी तरीकों में से एक है। एपीएन, आंतों के श्लेष्म में एक अत्यधिक व्यक्त झिल्ली-बाध्य प्रोटीन, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रेरण और रिसेप्टर-मध्यस्थता वायरल और बैक्टीरियल एंडोसाइटोसिस 1,5,8 में शामिल है। एपीएन का उपयोग एंटीजन लोडिंग और वैक्सीन डिलीवरी के कई प्रारूपों में एंटीजन पार्टिकुलेट के रूप में किया जाता है। एपीएन-लक्षित एंटीबॉडी का मौखिक प्रशासन भी प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं प्राप्त कर सकता है 18,24,25. हालांकि, विभिन्न एपीएन-विशिष्ट एपिटोप्स को लक्षित करने वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को आगे की जांच की आवश्यकता होती है।

यहां वर्णित विधियों को पारंपरिक हाइब्रिडोमा और पुनः संयोजक प्रौद्योगिकियों दोनों का उपयोग करके एपीएन के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन करने के लिए नियोजित किया गया था। इस दृष्टिकोण का उपयोग अन्य एमएबी के उत्पादन में किया जा सकता है। सबसे पहले, हमने विभिन्न हाइब्रिडोमा क्लोनों से प्राप्त नौ एमएबी प्राप्त करने के लिए पहले उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन किया। यद्यपि सेल सुपरनैटेंट और जलोदर में इन एमएबी के टिटर्स अलग-अलग थे, सभी एमएबी में 50 केडीए भारी श्रृंखला और 25 केडीए प्रकाश श्रृंखला शामिल थी और पोर्सिन एपीएन प्रोटीन के साथ विशिष्ट बंधन दिखाया गया था। आइसोटाइपिंग और एंटीजन एपिटोप्स की पहचान के परिणामों से पता चला है कि अधिकांश एमएबी अलग-अलग एपिटोप्स को लक्षित करते हैं और विभिन्न एंटीबॉडी प्रकारों से संबंधित हैं। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि पारंपरिक हाइब्रिडोमा तकनीक एमएबीएस के उत्पादन में एक प्रभावी विकल्प बनी हुई है।

पुनः संयोजक-एंटीबॉडी उत्पादन के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण एमएबी उत्पादन दक्षता में वृद्धि कर सकते हैं और श्रम- और समय से जुड़ी लागत को कम कर सकते हैं। इसलिए, इन दृष्टिकोणों की लोकप्रियता में वृद्धि हुई है, विशेष रूप से नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए एंटीबॉडी के विकास में16,17,26। आरएबीएस हाइब्रिडोमा-व्युत्पन्न एमएबीएस पर कई फायदे दिखाते हैं। सबसे पहले, अभिव्यक्ति वैक्टर में एंटीबॉडी जीन क्लोन करके इन विट्रो में आरएबीएस का उत्पादन किया जा सकता है, जिससे एंटीबॉडी उत्पादन में पशु उपयोग समाप्त हो जाता है। इसके अतिरिक्त, आरएबीएस का उत्पादन करने के लिए यूकेरियोटिक या प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग करने से कम बैच-टू-बैच विविधताएं होती हैं और अंतिम उत्पाद की विश्वसनीयता और स्थिरता बढ़ जाती है। इसके विपरीत, हाइब्रिडोमा का उपयोग करके उत्पादित एमएबी अक्सर लक्षित एंटीजन एपिटोप्स को पहचानते या बांधते नहीं हैं, और हाइब्रिडोमा सेल-लाइन बहाव, संदूषण और जीन हानि और उत्परिवर्तन से प्रभावित होते हैं। वर्तमान में, हाइब्रिडोमा-व्युत्पन्न एमएबी का उपयोग ज्यादातर नैदानिक या चिकित्सीय प्रतिरक्षा-अभिकर्मकों में किया जाता है, जो सीमित उत्पादन अवधि में स्थिर और विश्वसनीय एंटीबॉडी का उत्पादन करने की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए, पुनः संयोजक एंटीबॉडी तकनीक पारंपरिक हाइब्रिडोमा-आधारित दृष्टिकोण की तुलना में बेहतर विकल्प है। ऐसा इसलिए है क्योंकि पुनः संयोजक एंटीबॉडी तकनीक हमें इम्युनोग्लोबुलिन आइसोटाइप्स को स्विच करने के लिए आरएबी के अनुक्रम को संशोधित करने की अनुमति देती है, जिससे एंटीबॉडी14,16,17 की बाध्यकारी विशिष्टता बढ़ जाती है।

इस अध्ययन में, हमने एपीएन-लक्षित पुनः संयोजक एंटीबॉडी प्राप्त करने के लिए एंटीबॉडी-इंजीनियरिंग तकनीक का उपयोग किया। हमने पाया कि प्रतिरक्षित चूहों और हाइब्रिडोमा कोशिकाओं की दोनों तिल्ली एमएबी भारी और हल्के-श्रृंखला अनुक्रमों को बढ़ाने के लिए समान रूप से प्रभावी थीं। पीईटी 28 ए (+)-आरएबीएस-एपीएन-बीएल 21 (डीई 3) द्वारा व्यक्त एंटीबॉडी ने एलिसा या अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख में एपीएन को प्रभावी ढंग से नहीं पहचाना। हालांकि, पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ सेल सस्पेंशन और हाइब्रिडोमा-व्युत्पन्न एमएबीएस द्वारा व्यक्त आरएबीएस ने एपीएन प्रोटीन को पहचाना और प्रभावी ढंग से बांधा। इस अध्ययन में वर्णित विधियों का उपयोग एपीएन एंटीबॉडी-आधारित एडीसी और विभिन्न एपीएन-विशिष्ट एपिटोप्स को लक्षित करने वाले अन्य चिकित्सीय उत्पादों को विकसित करने के लिए किया जा सकता है। यह अध्ययन विभिन्न बीमारियों की रोकथाम और उपचार में एपीएन की भूमिका को और स्पष्ट करने में भी सहायता करेगा। हालांकि, आरएबी की आत्मीयता और उपज में सुधार के लिए रणनीतियों को आगे की जांच की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है। सभी लेखकों ने पांडुलिपि के प्रकाशन के लिए मंजूरी दी और अपनी स्पष्ट सहमति दी।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चीनी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (संख्या 32072820, 31702242), विदेशी अध्ययन के लिए जियांग्सू सरकार छात्रवृत्ति (जेएस 20190246) और यंग्ज़हौ विश्वविद्यालय वैज्ञानिक अनुसंधान फाउंडेशन के उच्च-स्तरीय प्रतिभाओं से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, जो विकास जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थान के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम द्वारा स्थापित एक परियोजना है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s adjuvant Sigma-Aldrich F5881 Animal immunization
DAPI Beyotime  Biotechnology C1002 Nuclear counterstain
DMEM Gibco 11965092 Cell culture
DMEM-F12 Gibco 12634010 Cell culture
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody Abbkine A23310 Indirect immunofluorescence analysis
Enhanced Cell Counting Kit-8 Beyotime  Biotechnology C0042 Measurement of cell viability and vitality
Fetal bovine serum Gibco 10091 Cell culture
Geneticin Selective Antibiotic Gibco 11811098 Selective antibiotic
GraphPad Prism 8.0 software GraphPad 8.0 Scientific data analysis and graphing
HAT Supplement (50X) Gibco 21060017 Cell selection
HT Supplement (100X) Gibco 11067030 Cell selection
Incomplete Freund’s adjuvant Sigma-Aldrich F5506 Animal immunization
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside Sigma-Aldrich I5502 Protein expression
kanamycin Beyotime  Biotechnology ST102 Bactericidal antibiotic
Leica TCS SP8 STED confocal microscope Leica Microsystems  SP8 STED Fluorescence imaging
Lipofectamine 2000 Reagent Thermofisher 11668019 Transfection
LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting BD FACS LSRFortessa Flow cytometry
Microplate reader BioTek BOX 998 ELISA analysis
Micro spectrophotometer Thermo Fisher Nano Drop one Nucleic acid concentration detection
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308 Culture broth
(NH4)2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10002917 Culture broth
Opti-MEM Gibco 31985088 Cell culture
Polyethylene glycol 1500 Roche Diagnostics 10783641001 Cell fusion
PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit Takara Bio RR047 qPCR
protein A agarose Beyotime  Biotechnology P2006 Antibody protein purification
Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns MACHEREY-NAGEL 745120.5 Protein purification
SBA Clonotyping System-HRP Southern Biotech May-00 Isotyping of mouse monoclonal antibodies
Seamless Cloning Kit Beyotime  Biotechnology D7010S Construction of plasmids
Shake flasks Beyotime  Biotechnology E3285 Cell culture
Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer Beyotime  Biotechnology C0221A Cell culture
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-rad  170-3940 Western blot
Tryptone Oxoid LP0042 Culture broth
Ultrasonic Homogenizer Ningbo Xinzhi Biotechnology JY92-IIN Sample homogenization
Yeast extract Oxoid LP0021 Culture broth
96-well microplate Corning 3599 Cell culture

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References

  1. Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
  2. Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
  3. Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
  4. Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
  5. Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
  6. Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), Hoboken, N.J. 74-85 (2015).
  7. Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
  8. Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
  9. Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
  10. Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
  11. Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
  12. Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
  13. Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
  14. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  15. El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient's need. British Journal of Nursing. 24 (16), Suppl 1 4-13 (2015).
  16. Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
  17. Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
  18. Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
  19. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
  20. Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
  21. Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
  22. Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
  23. Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
  24. Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
  25. Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
  26. Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).

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इस महीने जोव अंक 171 एमिनोपेप्टिडेस एन रिसेप्टर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पुनः संयोजक एंटीबॉडी प्रोटीन आंतों के म्यूकोसल एपिथेलियम।
पोर्सिन आंतों के म्यूकोसल एपिथेलियम में एमिनोपेप्टिडेस एन को लक्षित करने वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन
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Xia, P., Lian, S., Wu, Y., Yan, L.… More

Xia, P., Lian, S., Wu, Y., Yan, L. Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium. J. Vis. Exp. (171), e62437, doi:10.3791/62437 (2021).

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