Summary
A proteína de anticorpos recombinantes expressa em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e anticorpos monoclonais produzidos usando a tecnologia tradicional de hibridoma pode reconhecer e ligar-se à proteína N aminopeptidase suína (APN).
Abstract
A aminopeptidase N suína (PNA), uma metalopeptidase ligada à membrana abundantemente presente na mucosa do intestino delgado, pode iniciar uma resposta imune mucosa sem qualquer interferência, como baixa expressão proteica, inatividade enzimática ou alterações estruturais. Isso torna a APN uma candidata atraente no desenvolvimento de vacinas que visam seletivamente o epitélio da mucosa. Estudos anteriores mostraram que a PNA é uma proteína receptora tanto para Escherichia coli (E. coli) F4 enterotoxigênica quanto para o vírus da gastroenterite transmissível. Assim, a APN mostra-se promissora no desenvolvimento de conjugados anticorpo-droga ou novas vacinas baseadas em anticorpos específicos da APN. Neste estudo, comparamos a produção de anticorpos monoclonais específicos para APN (mAbs) usando a tecnologia tradicional de hibridoma e o método de expressão de anticorpos recombinantes. Nós também estabelecemos uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) transfectada de forma estável usando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN e uma cepa BL21(DE3) de expressão de E. coli abrigando o vetor pET28a (+)-rAbs-APN. Os resultados mostram que anticorpos expressos em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e mAbs produzidos usando hibridomas podem reconhecer e se ligar à proteína APN. Isso fornece a base para uma maior elucidação da função do receptor de APN para o desenvolvimento de terapêuticas direcionadas a diferentes epítopos específicos de APN.
Introduction
A aminopeptidase N (APN), enzima pertencente à família das metaloproteinases M1, atua como marcador, receptor e molécula sinalizadora tumoral por vias dependentes e independentes de enzimas 1,2. Além de clivar os resíduos de aminoácidos N-terminais de vários peptídeos bioativos para a regulação de sua atividade biológica, a PNA desempenha um papel importante na patogênese de várias doenças inflamatórias. A PNA participa do processamento e apresentação de antígenos por peptídeos aparados que se ligam firmemente a moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade 2,3. A PNA também exerce efeitos anti-inflamatórios ao se ligar a receptores acoplados à proteína G, participando de transdução de múltiplos sinais, modulando a secreção de citocinas e contribuindo para a fagocitose mediada pelo receptor gama Fc na resposta imune 4,5,6,7.
Como uma exopeptidase ligada à membrana amplamente distribuída, a PNA é abundante na mucosa do intestino delgado suíno e está intimamente associada à endocitose mediada por receptores 1,5,8. A PNA reconhece e liga a proteína spike do vírus da gastroenterite transmissível para entrada celular e interage diretamente com a subunidade FaeG das fímbrias F4 de Escherichia coli enterotoxigênicas para afetar a aderência bacteriana com as células hospedeiras 9,10,11. Assim, a PNA é um potencial alvo terapêutico no tratamento de doenças infecciosas virais e bacterianas.
Desde o desenvolvimento da tecnologia de hibridoma e outras estratégias para a produção de anticorpos monoclonais (mAbs) em 1975, os mAbs têm sido amplamente utilizados em imunoterapia, liberação de fármacos e diagnóstico12,13,14. Atualmente, os mAbs são utilizados com sucesso no tratamento de doenças, como câncer, doença inflamatória intestinal e esclerosemúltipla12,15. Devido à sua forte afinidade e especificidade, os mAbs podem ser alvos ideais no desenvolvimento de conjugados anticorpo-droga (ADC) ou novas vacinas16,17. A proteína APN é crítica para a entrega seletiva de antígenos a células específicas, podendo provocar uma resposta imune específica e forte da mucosa contra patógenos sem qualquer interferência, incluindo baixa expressão proteica, inatividade enzimática ou alterações estruturais 5,8,18. Portanto, produtos terapêuticos à base de mAbs específicos para APN mostram-se promissores contra infecções bacterianas e virais. Neste estudo, descrevemos a produção de mAbs específicos para APN usando tecnologia de hibridoma e a expressão de anticorpos recombinantes anti-APN (rAbs) usando vetores procarióticos e eucarióticos. O resultado indica que a proteína APN foi reconhecida tanto por rAbs expressos em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO quanto por mAbs derivados de hibridomas.
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Protocol
Todos os experimentos com animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yangzhou (SYXK20200041).
1. Preparação do antígeno da proteína APN suína
NOTA: A cepa pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) e as células pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 expressas de APN foram construídas em um estudo anterior11.
- Recuperar bactérias de um estoque congelado de glicerol e estriar em placas de Luria-Bertani (LB) contendo 50 μg/mL de canamicina (Km+) para isolamento de colônia única.
- Selecionar uma única colônia da placa recém-estriada, cultivar em 4 mL de meio LB (10 g/L de triptona, 10 g/L de cloreto de sódio (NaCl) e 5 g/L de extrato de levedura, pH 7,2) suplementado com Km+ (50 μg/mL), e deixar crescer durante a noite (12-16 h) com agitação (178 rpm) a 37 °C.
- Diluir as bactérias preparadas a 1:100 em caldo fresco Km+ LB e incubar a 37 °C com agitação durante 2-3 h até que o OD600 atinja 0,4-0,6.
- Adicionar isopropil β-d-1-thiogalactopiranosídeo (IPTG) ao meio até uma concentração final de 0,4 mM e incubar as culturas por mais 10 h a 16 °C.
- Consequentemente, centrifugar e colher as bactérias usando indução IPTG (10.000 × g, 4 °C 15 min).
- Ressuspender o pellet celular usando 5 mL de tampão LEW (Lysis/Equilibration/Wash) (50 mM de fosfato de sódio anidro monobásico (NaH2PO4) e NaCl 300 mM, pH 8,0) contendo 1 mg/mL de lisozima. Agite a suspensão bacteriana por 30 min no gelo e sonicate completamente (15 s pulso e 20 s desligado, 15 min) usando um homogeneizador ultra-sônico.
- Centrifugar o lisado celular bruto a 4 °C e 10.000 × g durante 30 minutos para remover os detritos celulares. Transfira o sobrenadante para uma coluna pré-equilibrada e incube 1-2 min antes da drenagem por gravidade. Repita esta etapa três vezes.
- Lavar a coluna com 20 mL de tampão LEW e drenar por gravidade. Eluir a proteína APN marcada com histidina usando 9 mL de tampão de eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl e 250 mM imidazol, pH 8,0) e coletar em tubos de diálise.
- Diálise da solução proteica durante a noite a 4 °C em tampão carbonato de sódio-bicarbonato de sódio (PBS, NaCl 135 mM, cloreto de potássio 4,7 mM, NaH 2 PO4 mM e fosfato de sódio dibásico dodecahidratado 10 mM, pH7,2).
- Analisar usando um gel de SDS-PAGE a 12,0% e western blotting para avaliar a pureza da proteína APN.
- Coloque 5 μg de proteína em cada poço do gel e deixe correr a 110 V por 1,5 h. Em seguida, transfira a proteína para uma membrana de PVDF por 50 min a 15 V. Determine a concentração da proteína purificada usando um ensaio de BCA.
2. Imunização animal
- Subcutâneo (s.c) injetar camundongos BALB/c fêmeas, 6-8 semanas de idade, com 50 μg de proteína APN ou PBS (controle negativo) misturado com adjuvantes uma vez a cada 2 semanas. Use o adjuvante de Freund completo que contém as micobactérias mortas pelo calor para a imunização inicial, e o adjuvante de Freund incompleto para as imunizações de reforço. Misturar volumes iguais de proteína APN (ou PBS) e adjuvante de Freund ou adjuvante de Freund incompleto, respectivamente.
- Detectar títulos de anticorpos contra APN no soro desses camundongos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) usando uma placa de microtitulação revestida com 5 μg/mL de proteína APN diluída em PBS 0,05 M (pH 9,6). .
3. Tecnologia de hibridoma para produção de anticorpos monoclonais contra PNA
- Intraperitonealmente (i.p.) injetar 100 μg de proteína APN nos camundongos selecionados para um reforço final do antígeno.
- Três dias depois, eutanasiar os camundongos com pentobarbital sódico (50 mg/kg, v/v, intraperitoneal) e luxação cervical.
- Colete baços e lave com DMEM duas vezes para remover o sangue e as células de gordura. Filtrar a suspensão de células do baço usando uma grade de cobre de 200 malhas para remover detritos de tecido e colher células do baço usando centrifugação (1500 × g, 10 min) para remover a membrana do baço.
- Células SP2/0 de mieloma múltiplo de camundongo em frasco de 25cm2 contendo 5 mL de DMEM suplementado com 6% de soro fetal bovino (SFB) e cultura a 37 °C, atmosfera de 6% de CO2 para manter a viabilidade celular. Após 5-6 dias de cultura, as células atingem 80%-90% de confluência pós-ressuscitação e estão em fase log de crescimento. Sob o microscópio, as células são redondas, brilhantes e claras.
- Um dia antes da hibridização, coletar macrófagos das cavidades peritoneais dos camundongos de acordo com método previamente publicado12,19.
- Macrófagos peritoneais de sementes a uma densidade de 0,1-0,2 × 105/mL em placas de 96 poços, cada poço contendo 100 μL de meio HAT (DMEM suplementado com 10% FBS e 1x HAT Supplement), e incubam a 37 °C, 6 % CO2 atmosfera umidificada durante a noite.
- Para hibridização, aspirar suavemente as células SP2/0 com uma pipeta de 8-10 frascos e suspender em 10 mL de meio DMEM sem soro. Lavar as células com DMEM fresco, centrifugar (1500 × g, 10 min) duas vezes e, em seguida, ressuspender em 10 mL de DMEM.
- Misturar as células quantificadas do baço com as células SP2/0 na proporção de 10:1 e transferir para tubos de 50 ml. Centrifugar (1500 × g, 10 min) e descartar o sobrenadante. Colete os pellets de células no fundo dos tubos e bata com a palma da mão para soltar os pellets antes da hibridização.
- Adicionar 1 mL de polietilenoglicol 1500 (PEG 1500), pré-aquecido a 37 °C, gota a gota, usando um conta-gotas para a pastilha de célula solta durante o período de tempo de 45 s, girando suavemente o fundo do tubo.
- Adicionar lentamente 1 mL de DMEM pré-aquecido a 37 °C à mistura acima durante o período de 90 s, seguido por mais 30 mL de DMEM fresco. Colocar o tubo de fusão num banho-maria a 37 °C durante 30 minutos.
- Após a incubação no banho quente, colher as células e ressuspender em meio HAT. Em seguida, cultura em placa de 96 poços inoculada com macrófagos peritoneais.
- Cinco dias depois, adicionar 100 μL de meio HAT fresco a cada poço e incubar a placa por mais 5 dias, após o que substituir o meio por meio HT (DMEM suplementado com 10% FBS e 1x HT Supplement).
- Utilizar uma placa de microtitulação revestida com 5 μg/mL de proteína APN diluída em PBS 0,05 M (pH 9,6) para analisar anticorpos monoclonais no sobrenadante do hibridoma usando ensaio ELISA.
- Quando o meio nos poços da placa de 96 poços fica amarelo (devido ao crescimento celular e liberação de metabólitos, o pH no meio diminui para 6,8 e o vermelho fenólico passa de fúcsia para amarelo) ou aglomerados celulares são observados, adquira 100 μL de sobrenadante dos poços selecionados e adicione aos poços da placa ELISA revestida. Use um leitor de microplacas para medir os valores OD450.
- Usar os anticorpos policlonais contra PNA e soro de camundongos não infectados como controle positivo e negativo, respectivamente, e usar PBS como controle em branco. Neste estudo, a razão OD450 amostra/controle negativo (P/R) ≥ 2,1 foi reconhecida como padrão de seleção positiva.
- Após três rodadas consecutivas de seleção positiva, selecione o hibridoma que apresenta resposta sorológica aumentada contra a proteína APN para um ensaio de diluição limitada.
- Preparar macrófagos peritoneais e sementes em placas de 96 poços, conforme descrito anteriormente.
- Suspender células de hibridoma em meio HT a uma média de 0,5-2 células por poço e cultivar em estufa a 37 °C, 6% CO2 . Repita essa etapa três ou quatro vezes até que a taxa de positividade indicada pelo imunoensaio ELISA atinja 100%.
- Sob a pressão de congelamento e descongelamento contínuos, selecione as células positivas do hibridoma capazes de secretar de forma estável anticorpos anti-APN e proliferar normalmente.
- Administrar uma única injeção i.p. de 0,3 ml de pristano a cada rato (8-10 semanas). Aos 10 dias após receber o pristine, injetar em cada camundongo 2-5 x10 5 células de hibridoma em 0,5 mL de PBS (pH 7,2).
- Coletar cuidadosamente líquido peritoneal da cavidade peritoneal desses camundongos 8 a 10 dias após a injeção.
- Colher os sobrenadantes por centrifugação a 5.000 × g por 15 min e purificar os anticorpos nos sobrenadantes usando precipitação de sulfato de amônio saturado a 33% [(NH 4)2SO4] e proteína A agarose.
4. Caracterização de mAbs contra proteína APN
- Determinar o subtipo de imunoglobulina dos mAbs coletados usando um SBA Clonotyping System-HRP20. Use SDS-PAGE e western blotting para avaliar a pureza e especificidade do mAb.
- Analise a especificidade do epítopo mAb contra a proteína APN usando ELISA21. O valor de aditividade, AV, é a razão entre ODmAbs (a+b) e (OD mAbs-a+ODmAbs-b), que é usado para avaliar se os mAbs reconhecem o mesmo sítio antigênico; ODmAbs-a e ODmAbs-b representam os valores de OD450 de diferentes anticorpos monoclonais contra APN isoladamente, e OD mAbs(a+b) representam os valores de OD450 de uma mistura 1:1 de dois mAbs contra APN.
- Avalie cada amostra pelo menos quatro repetições e repita todo o experimento pelo menos três vezes.
5. Expressão de rAbs contra APN
- Extrair o RNA total das células e baços do hibridoma acima mencionados de camundongos imunizados com APN (por exemplo, TRIzol)22. Sintetize DNA complementar (cDNA) usando um kit de síntese de cDNA de acordo com as instruções do fabricante.
- Amplificar regiões variáveis de mAbs usando nested PCR e determinar sequências de cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) usando sequenciamento. Analisar os genes que codificam VH e VL usando a ferramenta de análise do genoma de camundongos IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Combinar os genes VH e VL com sequências líderes e subcloná-los sequencialmente nos vetores pET28a (+) e pIRES2-ZsGreen1, respectivamente, usando tecnologia de clonagem contínua para permitir a inserção de fragmentos de DNA sem cicatrizes. Os primers específicos estão listados na Tabela 1.
- Cultivar as bactérias transformadas em pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 na presença de IPTG 0,4 mM em agitadores orbitais a 37 °C por 10 h. Em seguida, induzir, purificar e avaliar a expressão da proteína rAbs usando purificação proteica de rotina.
- Seme 100 μL 0,5 x 105 células CHO por poço em uma placa de 96 poços e incube a 37 °C em uma atmosfera de 6% de CO2 por 18-24 h. Quando as células atingirem 80-90% de confluência, diluir o plasmídeo pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN com Opti-MEM até uma concentração final de 0,1 μg/μL e incubar 5 min à temperatura ambiente antes de usar para transfecção.
- Misturar suavemente 50 μL do plasmídeo pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN diluído com 1 μL de Lipofectamina 2000 e 49 μL de Opti-MEM e incubar a mistura durante mais 20 minutos à temperatura ambiente. Adicionar 100 μL de mistura a cada poço de uma placa de 96 poços contendo células CHO e incubar a 37 °C em atmosfera de CO2 a 6% durante 4-6 horas.
- Em 4-6 h pós-transfecção, substituir o meio por meio DMEM-F12 suplementado com 10% de SFB e incubar a placa por mais 48 h. Em seguida, adicionar 400 μg/mL de G418 a cada poço para selecionar as células transfectadas de forma estável.
- Após 10 dias de seleção usando meio DMEM-F12 suplementado com FBS 10% e G418 400 μg/mL, classificar as células (3,0 × 107 células/mL) por triagem celular ativada por fluorescência. Aproximadamente 10-15% da população celular foi positiva.
- Diluir serialmente as células positivas colhidas, semear em média 0,5-2 células por poço em uma placa de 96 poços e cultura em uma incubadora de 37 °C e 6% de CO2 . Manter as células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO transfectadas de forma estável usando seleção com G418 (200 μg/mL).
- A concentração de FBS no meio de cultura celular descrito acima diminui gradualmente de 10% para 0% durante a fase de crescimento logarítmico ao longo do período de tempo de 3 semanas. Em seguida, adaptar as células CHO aderentes ao crescimento em suspensão em meio sem soro.
- Cultivar as células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO semeadas na fase logarítmica de crescimento em meio livre de soro a uma densidade de 0,8-1,0 × 105 células/mL em frascos de agitação a 80-110 rpm e 37°C, 6% CO2.
- Coletar a suspensão celular a cada 12 h para determinar mudanças na viabilidade e vitalidade celular usando um kit de contagem de células (por exemplo, CCK-8) de acordo com as instruções do fabricante.
- A expressão de anticorpos atinge níveis máximos quando a viabilidade celular diminui para 80% e a densidade celular atinge 1,0-2,0 × 106 células/mL. Colher sobrenadantes celulares usando centrifugação, filtrar usando um filtro de membrana de politetrafluoretileno de 0,22 μm e purificar usando a proteína A agarose.
- Confirmar a produção de anticorpos específicos para PNA usando ensaios de imunofluorescência indireta (RIFI).
- Determine os títulos de anticorpos e as afinidades de ligação usando o ensaio ELISA, conforme descrito anteriormente. 23 Calcular a constante de dissociação de equilíbrio (valor de KD ) dos anticorpos com uma equação logística de quatro parâmetros usando software.
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Representative Results
Neste estudo, a proteína solúvel purificada de APN (2,12 mg/mL) foi usada para imunização em camundongos. Camundongos imunizados com a proteína APN quatro vezes em intervalos de 14 dias exibiram um título mais alto de anticorpos contra APN em seus soros. Embora 14 hibridomas tenham sido obtidos usando os experimentos de fusão, apenas 9 hibridomas sobreviveram aos três ciclos contínuos de congelamento-descongelamento, resultando em 9 clones estáveis que secretaram anticorpos contra a PNA. Todas essas células são redondas, brilhantes e claras (Figura 1). Os mAbs purificados que possuíam cadeias pesadas e leves (50 kDa e 25 kDa, respectivamente) foram confirmados por SDS-PAGE e encontrados na ascite purificada (Figura 2). Os títulos desses mAbs anti-APN em sobrenadantes de cultura e ascite são mostrados na Tabela 2.
O resultado da isotipagem de mAbs de camundongo revelou que os mAbs derivados dos clones 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 e 6C56 possuíam subclasses de IgG2b, enquanto APN-2A20 era um anticorpo do tipo IgG2a κappa- (κ), e os mAbs APN-3FD9, -3F10 e -10F3 pertenciam ao tipo IgM e processavam cadeias leves κ (Tabela 3). Como mostrado na Tabela 4, a maioria desses mAbs mostrou valores de AV acima de 50%, indicando que eles visaram diferentes epítopos na PNA, enquanto o anticorpo APN-5C51 reconheceu epítopos antigênicos semelhantes aos reconhecidos por APN-3C48, -5B31 e -6C56 mAbs.
APN-5B36 mostrou títulos de anticorpos consideravelmente mais altos em comparação com os de outros mAbs. Portanto, o gene VH-VL APN-5B36 foi amplificado e ligado em um vetor pET28a (+) ou pIRES2-ZsGreen1 para construir os plasmídeos de expressão recombinante pET28a (+)-rAbs-APN e pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN, respectivamente (Figura 3). Os anticorpos expressos pelas células pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) e pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO foram purificados e analisados por ensaios de ELISA e RIFI. No entanto, como mostrado na Figura 4, apenas o anticorpo expresso no sobrenadante das células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO reconheceu a proteína APN, assim como os mAbs derivados do hibridoma. Esse anticorpo recombinante consistiu de cadeias pesadas IgG2b e cadeias leves lambda, e mostrou um título de 2,56 × 105 conforme determinado por ELISA. A ligação de APN-5B36 mAbs às proteínas APN atingiu um equilíbrio mais precoce do que rAbs (Figura 5), mostrando valores de KD de (4,232±0,475) × 10-9 e (2,201±0,367) × 10-8 mol/L, respectivamente.
| Cartilha | Sequência (5'-3') | ||
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG | ||
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGAGGGGGGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
Tabela 1. Os primers específicos utilizados neste estudo.
| Células | Títulos de sobrenadantes (U/mL) | Títulos de ascite (U/mL) |
| 2A20 | 0,64×104 | 3.20×105 |
| 5B31 | 1,28×104 | 1,60×105 |
| 5B36 | 0,64×104 | 1,28×106 |
| 3C48 | 0,16×104 | 0,80×105 |
| 5C51 | 0,16×104 | 0,80×104 |
| 6C56 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3FD9 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3F10 | 0,16×104 | 0,16×105 |
| 10F3 | 0,80×103 | 0,32×105 |
Tabela 2. Os títulos ELISA de APN mAbs.
| Ig | IgA | Grão-mestre | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | Cá | Lambda | Resumo | |
| 2A20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a, Kappa |
| 5B31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b, Lambda |
| 5B36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b, Lambda |
| 3C48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b, Lambda |
| 5C51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b, Lambda |
| 6C56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b, Lambda |
| 3FD9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM, Kappa |
| 3F10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM, Kappa |
| 10F3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM, Kappa |
Tabela 3. Isótipos de APN mAbs derivados de hibridomas.
| mAbs | AV (100 %) | ||||||||
| 2A20 | 5B31 | 5B36 | 3C48 | 5C51 | 6C56 | 3FD9 | 3F10 | 10F3 | |
| 2A20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5B31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5B36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3C48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5C51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6C56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3FD9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3F10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10F3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
Tabela 4. Discriminação da especificidade antígeno-epítopo de mAbs específicos para APN. Valores de AV maiores que 0,5 indicam que esses dois mAbs reconhecem sítios antigênicos diferentes; Valores de AV menores que 0,5 indicam que esses dois mAbs reconhecem um sítio antigênico semelhante.
Gráfico 1. Imagem de hibridomas. Sob análise microscópica, os hibridomas são redondos, brilhantes e claros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 2. Níveis de expressão de anticorpos recombinantes e ascite analisados por SDS-PAGE. (A) Faixa M, marcador proteico; faixa 1, lisado purificado pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); faixa 2, sobrenadante pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); raia 3, líquido de ascite purificado por precipitação de 33% (NH 4)2SO4. (B) Faixa M, marcador proteico; faixa 1, líquido de ascite purificado com proteína A agarose. Neste ensaio, 3-5 μg de proteína total foram carregados em cada faixa do gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 3. Plasmídeos de expressão recombinante pET28a (+)-rAbs-APN e pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN analisados por eletroforese em gel de agarose. Faixa M, Trans 2K mais marcador de DNA; faixa 1, vetor pET28a (+) (5369 pb); raia 2 e 5, gene VH-VL combinado com sequência líder APN-5B36; faixa 3, plasmídeo pET28a (+)-rAbs-APN expresso em BL21 (DE3) E. coli; faixa 4, vetor pIRES2-ZsGreen1 (5283 pb); faixa 6, plasmídeo pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN expresso em DH5α E. coli. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 4. Expressão de proteína de anticorpo recombinante e ascite analisada por imunofluorescência indireta. As células pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 (fluorescência verde) expressando de forma estável a PNA foram tratadas com (A) PBS, usado como tratamento controle; (B) proteína purificada expressa por pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); (C) anticorpo policlonal APN (1:500); (D) líquido purificado de ascite (1:500); E) sobrenadante purificado obtido de células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO (1:500). DAPI foi usado como contracoloração nuclear em microscopia confocal. As células incubadas com o anticorpo secundário IgG de camundongo anti-cabra conjugado DyLight 549 (1:200) e tratadas com ascite purificada e sobrenadante purificado de células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO mostraram um sinal robusto de fluorescência vermelha indicativo como o anticorpo policlonal APN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 5. Determinação das afinidades relativas de ligação de anticorpos utilizando o ELISA22. A absorção de amostras contendo APN-5B36 mAbs ou rAbs, na ausência e presença da proteína APN, foi medida no comprimento de onda de 450 nm. A curva de ligação foi construída usando um ajuste de curva logística de quatro parâmetros; O eixo x mostra a concentração logarítmica de anticorpos e o eixo y mostra a absorbância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A indução da imunidade da mucosa é uma das abordagens mais eficazes no combate a patógenos e na prevenção e tratamento de várias doenças. A PNA, uma proteína ligada à membrana altamente expressa na mucosa intestinal, está envolvida na indução da resposta imune adaptativa e na endocitose viral e bacteriana mediada por receptores 1,5,8. A PNA é usada como particulada antigênica em muitos formatos de carregamento de antígenos e entrega de vacinas. A administração oral de anticorpos direcionados para PNA também pode provocar respostas imunes efetivas 18,24,25. No entanto, anticorpos monoclonais direcionados a diferentes epítopos específicos da PNA requerem investigação adicional.
Os métodos aqui descritos foram empregados para produzir anticorpos monoclonais contra a PNA usando tanto hibridoma tradicional quanto tecnologias recombinantes. Esta abordagem pode ser usada na produção de outros mAbs. Primeiro, seguimos um protocolo mencionado anteriormente para obter nove mAbs derivados de diferentes clones de hibridomas. Embora os títulos desses mAbs no sobrenadante celular e na ascite fossem diferentes, todos os mAbs continham a cadeia pesada de 50 kDa e a cadeia leve de 25 kDa e mostraram ligação específica com a proteína APN suína. Os resultados da isotipagem e identificação de epítopos de antígenos mostraram que a maioria dos mAbs tinha como alvo diferentes epítopos e pertencia a diferentes tipos de anticorpos. Estes resultados indicam que a tecnologia tradicional de hibridoma continua sendo uma escolha eficaz na produção de mAbs.
As abordagens usadas para a produção de anticorpos recombinantes podem aumentar a eficiência da produção de mAb e minimizar os custos associados à mão de obra e ao tempo. Portanto, essas abordagens têm crescido em popularidade, especialmente no desenvolvimento de anticorpos para aplicações diagnósticas eterapêuticas16,17,26. Os rAbs apresentam várias vantagens sobre os mAbs derivados do hibridoma. Primeiro, os rAbs podem ser produzidos in vitro por clonagem de genes de anticorpos em vetores de expressão, eliminando assim o uso animal na produção de anticorpos. Além disso, o uso de sistemas de expressão eucarióticos ou procarióticos para produzir rAbs resulta em baixas variações lote a lote e aumenta a confiabilidade e estabilidade do produto final. Em contraste, os mAbs produzidos usando hibridomas muitas vezes não reconhecem ou se ligam aos epítopos de antígeno alvo, e são afetados por deriva de linhagem celular de hibridomas, contaminação e perda de genes e mutações. Atualmente, os mAbs derivados do hibridoma são usados principalmente em imunorreagentes diagnósticos ou terapêuticos, destacando a necessidade de produzir anticorpos estáveis e confiáveis em um período limitado de produção. Para aplicações diagnósticas e terapêuticas, a tecnologia de anticorpos recombinantes é uma escolha melhor do que a abordagem tradicional baseada em hibridomas. Isso ocorre porque a tecnologia de anticorpos recombinantes permite modificar a sequência de rAbs para mudar os isotipos de imunoglobulinas, aumentando assim a especificidade de ligação do anticorpo14,16,17.
Neste estudo, usamos tecnologia de engenharia de anticorpos para obter anticorpos recombinantes direcionados para APN. Descobrimos que tanto o baço de camundongos imunizados quanto as células do hibridoma foram igualmente eficazes para amplificar as sequências de cadeias pesadas e leves do mAb. O anticorpo expresso por pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) não reconheceu efetivamente a PNA em ensaios de ELISA ou imunofluorescência indireta. No entanto, rAbs expressos pela suspensão de células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO e mAbs derivados de hibridomas reconheceram e se ligaram efetivamente à proteína APN. Os métodos descritos neste estudo podem ser usados para desenvolver ADC baseado em anticorpos APN e outros produtos terapêuticos visando diferentes epítopos específicos para APN. Este estudo também ajudará a esclarecer melhor o papel da PNA na prevenção e tratamento de várias doenças. No entanto, estratégias para melhorar a afinidade e o rendimento dos rAbs requerem mais investigação.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse. Todos os autores aprovaram e deram seu consentimento explícito para a publicação do manuscrito.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Bolsa da Fundação Nacional de Ciência da China (No. 32072820, 31702242), subsídios da Bolsa do Governo de Jiangsu para Estudos no Exterior (JS20190246) e Talentos de Alto Nível da Fundação de Pesquisa Científica da Universidade de Yangzhou, um projeto fundado pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento da Instituição de Ensino Superior de Jiangsu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), Hoboken, N.J. 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient's need. British Journal of Nursing. 24 (16), Suppl 1 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
