ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
نقدم طريقة لعزل الخلايا البطانية والنوى عن تجويف الشرايين السباتية للفئران المعرضة لظروف تدفق مستقرة أو مضطربة لإجراء تجارب omics أحادية الخلية.
Abstract
تصلب الشرايين هو مرض التهابي في المناطق الشريانية المعرضة لتدفق الدم المضطرب (d-flow). ينظم D-flow التعبير عن الجينات في البطانة على مستويات النسخ وفوق الجينوم ، مما يؤدي إلى استجابات برواثيروجينيك. في الآونة الأخيرة ، تم إجراء دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) وفحص الخلية الواحدة لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه عبر Transposase (scATACseq) لتحديد تغييرات إمكانية الوصول إلى النسخ والكروماتين بدقة خلية واحدة باستخدام نموذج ربط الشريان السباتي الجزئي للفأر (PCL). نظرا لأن الخلايا البطانية (ECs) تمثل جزءا صغيرا من إجمالي مجموعات الخلايا في جدار الشريان ، فقد تم استخدام طريقة هضم لمعانية للحصول على مستحضرات أحادية الخلية غنية ب EC. في هذه الدراسة ، خضعت الفئران لجراحة PCL للحث على تدفق D في الشريان السباتي الأيسر (LCA) أثناء استخدام الشريان السباتي الأيمن (RCA) كعنصر تحكم. تم تشريح الشرايين السباتية بعد يومين أو أسبوعين من جراحة PCL. تعرض تجويف كل سباتي لهضم الكولاجيناز ، وتم الحصول على خلايا مفردة غنية بالبطانة أو نوى واحدة. تم ترميز هذه المستحضرات أحادية الخلية وأحادية النوى في وقت لاحق باستخدام إعداد الموائع الدقيقة 10x Genomics. ثم تم استخدام الخلايا الأحادية المشفرة والنوى المفردة لإعداد الحمض النووي الريبي ، وتوليد المكتبة ، والتسلسل على جهاز تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية. بعد معالجة المعلوماتية الحيوية ، حددت مجموعات بيانات scRNAseq و scATACseq أنواعا مختلفة من الخلايا من الهضم المضيء ، والتي تتكون في المقام الأول من ECs. كانت خلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية والخلايا المناعية موجودة أيضا. ساعدت طريقة التخصيب EC هذه في فهم تأثير تدفق الدم على البطانة ، والتي كان من الممكن أن تكون صعبة مع طريقة هضم الشريان الكلي. يمكن استخدام طريقة تحضير الخلية الواحدة المخصب ب EC لإجراء دراسات omics أحادية الخلية في EC-knockouts والفئران المعدلة وراثيا حيث لم تتم دراسة تأثير تدفق الدم على هذه الجينات. الأهم من ذلك ، يمكن تكييف هذه التقنية لعزل الخلايا المفردة المخصب ب EC من الشريان البشري لإجراء دراسات ميكانيكية مماثلة.
Introduction
أثبت هذا المختبر سابقا أن تحريض تدفق D يؤدي إلى تطور تصلب الشرايين السريع والوعرة في الفئران شديدة الدهون 1,2. كان نموذج الفأر الجديد لتصلب الشرايين الناجم عن التدفق D ممكنا باستخدام جراحة ربط الشريان السباتي الجزئي (PCL) 3. تحفز جراحة PCL حالة تدفق الدم المنخفضة والمتذبذبة أو تدفق d في الشريان السباتي الأيسر المربوط (LCA). في المقابل، لا يزال الشريان السباتي الأيمن المقابل (RCA) يواجه تدفقا صفائحيا مستقرا (s-flow). في السابق ، لفهم تأثير تدفق D على الخلايا البطانية ، تم تشريح الشرايين السباتية بعد جراحة الربط الجزئي ومسحها بعامل تحلل قائم على الفينول والجوانيدين إيزوثيوسيانات (طريقة تدفق الحمض النووي الريبي / الحمض النووي) 2,4 ، والتي وفرت الحمض النووي الريبي "السائب المجمع" المخصب البطاني أو الحمض النووي. ثم تمت معالجة هذه الحمض النووي الريبي السائب المجمع أو الحمض النووي لدراسات النسخ أو دراسات ميثيلوم الحمض النووي فوق الجينومي ، على التوالي4،5،6. ساعدت هذه الدراسات في اكتشاف العديد من الجينات الحساسة للتدفق والحمض النووي الريبي الميكروي الذي تم التحقيق على نطاق واسع في أدواره في البيولوجيا البطانية وتصلب الشرايين4،6،7.
ومع ذلك ، على الرغم من التخصيب البطاني ، لم تتمكن دراسات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي السائبة هذه من التمييز بين الدور المحدد لكل نوع من الخلايا في جدار الشريان في تصلب الشرايين الناجم عن التدفق D. تم إجراء عزل الخلية الواحدة المخصب البطاني (sc) ودراسات تسلسل scRNA و scATAC للتغلب على هذا القيد8. لهذا ، خضعت الفئران C57Bl6 لجراحة PCL للحث على تدفق d في LCA أثناء استخدام RCA المكشوف للتدفق s كعنصر تحكم. بعد يومين أو أسبوعين من جراحة PCL ، تم التضحية بالفئران ، وتم تشريح السباتيدات وتنظيفها. تم غرس تجويف كل من LCAs و RCAs مع الكولاجيناز ، وتم جمع هضمات الكولاجيناز المضيئة التي تحتوي على ECs كجزء كبير والخلايا الشريانية الأخرى. تم إعداد التعليق أحادي الخلية (scRNAseq) أو التعليق أحادي النواة (scATACseq) وتم ترميزه بمعرفات فريدة لكل خلية أو نواة باستخدام إعداد 10x Genomics. تم إخضاع الحمض النووي الريبي لإعداد مكتبة cDNA وتسلسلها.
تمت معالجة مجموعات بيانات scRNAseq و scATACseq باستخدام برنامج Cell Ranger أحادي الخلية وتم تحليلها بشكل أكبر بواسطة حزم Seurat و Signac R 9,10. تم تعيين نوع خلية لكل خلية ونواة من هذه التحليلات وتم تجميعها في نوع الخلية بناء على جينات العلامات وأنماط التعبير الجيني الفريدة. أظهرت نتائج scRNAseq و scATACseq أن هذه المستحضرات أحادية الخلية غنية ب ECs وتحتوي أيضا على خلايا العضلات الملساء (SMCs) والخلايا الليفية والخلايا المناعية.
وكشف مزيد من التحليل أن مجموعة EC في عملية الهضم المضيئة متباعدة للغاية وبلاستيكية (8 مجموعات EC مختلفة) وتستجيب لتدفق الدم. الأهم من ذلك ، أظهرت هذه النتائج أن تدفق D يعيد برمجة ECs من النمط الظاهري المضاد للالتهابات المحمي من الثيرو إلى الأنماط الظاهرية المؤيدة لتصلب الشرايين ، بما في ذلك الانتقال المؤيد للالتهابات ، والانتقال البطاني إلى اللحمة المتوسطة ، وانتقال الخلايا الجذعية / السلفية البطانية ، والأكثر إثارة للدهشة ، الانتقال الشبيه بالخلية البطانية إلى المناعة. بالإضافة إلى ذلك، تكشف بيانات scATACseq عن تغييرات جديدة في إمكانية الوصول إلى الكروماتين تعتمد على التدفق ومواقع ربط عامل النسخ بطريقة على نطاق الجينوم، والتي تشكل الأساس للعديد من الفرضيات الجديدة. منهجية وبروتوكول إعداد الخلايا البطانية المفردة للدراسات متعددة الخلايا أحادية الخلية من الشرايين السباتية للفأر مفصلة أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة إيموري. تم استخدام الفئران C57BL/6 غير المتطابقة مع فرط الكوليسترول في الدم والعمر والجنس للتخفيف من التباين المعتمد على الجنس وتعويض أي مضاعفات لحالات فرط كوليستروليوم.
1. جراحة ربط الشريان السباتي الجزئي (PCL)
ملاحظة: تم إجراء ربط جزئي للشريان السباتي من LCA كما هو موضح سابقا وموضح3.
- تخدير الفأر عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (5٪ isofluorane في الأكسجين للحث و 1.5٪ بعد ذلك للصيانة) طوال العملية باستخدام مبخر مخدر. ضع الماوس ضعيفا على وسادة Deltaphase متساوية الحرارة لمنع فقدان حرارة الجسم أثناء الجراحة.
- ضع مرهما للعين لمنع التعرض لالتهاب القرنية ، وتأكد من عمق التخدير من خلال عدم وجود استجابة قرصة إصبع القدم.
- حقن البوبرينورفين 0.05 مغ/كغ تحت الجلد لإدارة الألم بشكل استباقي. تطهير المنطقة المزيلة عن طريق تطبيق وتنظيف مع البيتادين ومحلول الأيزوبروبانول ثلاث مرات. تأكد من أن البيتادين هو الخطوة الأخيرة لتعقيم منطقة الجراحة ، بدءا من المركز والانتهاء من الجانبين.
- باستخدام تقنيات التعقيم ، قم بعمل شق خط الوسط البطني (~ 1 سم) في منطقة الرقبة ، وكشف نقطة فرع LCA عن طريق تشريح حاد.
- ربط الشرايين السباتية الداخلية اليسرى والسباتية الخارجية والقذالي مع خياطة الحرير 6-0 ؛ اترك الشريان الدرقي العلوي دون مساس.
- تقريب الجلد وإغلاق شق مع الغراء الأنسجة و / أو الغرز.
- انقل الماوس إلى قفص استرداد تم تسخينه مسبقا (يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية) وضعه على منشفة نظيفة لمدة تصل إلى 1 ساعة لتجنب انخفاض حرارة الجسم بعد الجراحة.
ملاحظة: في تجربتنا ، عادة ما تكون جرعة واحدة وقائية من البوبرينورفين (0.05 مجم / كجم) كافية لإدارة الألم بعد الجراحة. يمكن إعطاء جرعة متكررة من البوبرينورفين إذا كان الحيوان في محنة بعد ال 24 ساعة الأولى. إذا تم تنفيذه بشكل صحيح ، فلا توجد وفيات مرتبطة بهذا الإجراء ، والإجهاد بعد العملية الجراحية للفأر هو الحد الأدنى. يتم إرجاع الفئران إلى أقفاصها ومراقبتها يوميا بعد الجراحة. - إعداد إعداد التروية.
- استخدم 0.9٪ كلوريد الصوديوم (محلول ملحي عادي) يحتوي على 10 U / mL الهيبارين في كيس IV. اربط الكيس الوريدي على بعد 244-274 سم (8-9 أقدام) من الأرض أو ما يقرب من 122-152 سم (4-5 أقدام) أعلى من لوح التشريح. قم بتوصيل إبرة الفراشة بنهاية الخط الملحي واطرد أي فقاعات هواء من الخط الوريدي.
2. عزل الشرايين السباتية بعد التضحية
- التضحية بالفئران عن طريق استنشاق CO2 وفقا لبروتوكول IACUC المؤسسي.
- رش 70٪ من الإيثانول على جلد الفأر وضعه في وضع ضعيف على لوحة التشريح التي تحتوي على مناشف ورقية ممتزة. قم بتأمين مخالب الماوس على المناشف الممتزة على لوحة التشريح باستخدام شريط لاصق أو إبرة 21 جم.
- باستخدام زوج من المقصات المعقمة ، قم بإزالة جلد الفأر بدءا من البطن وعلى طول الطريق إلى أعلى الصدر.
- استخدم زوجا من المقص لفتح جدار البطن أسفل القفص الصدري عن طريق التشريح الحاد.
- باستخدام المقص ، قم بعمل شق بعناية على طول الحجاب الحاجز ، واستمر من خلال الأضلاع على جانبي الصدر حتى يمكن رفع القص بعيدا. ارفع القص بلطف باستخدام زوج من الملقط ؛ بعد ذلك ، قم بإزالة القفص الصدري لفضح القلب.
- قم بإزالة الغدة الصعترية بعناية وأي نسيج ضام فوق القلب لتصور الأوعية الرئيسية.
- اقطع الوريد الأجوف بمقص للسماح للدم بالخروج من الدورة الدموية المغلقة.
- أدخل إبرة فراشة 21 جم متصلة بالخط الوريدي من خلال قمة القلب إلى البطين الأيسر واسمح بالتروية الرجعية لمدة 2-3 دقائق مع محلول ملحي طبيعي في درجة حرارة الغرفة. تأكد من الحفاظ على معدل تدفق ثابت من المياه المالحة العادية عن طريق الحفاظ على الكيس الملحي على ارتفاع 8-9 أقدام من الأرض.
ملاحظة: تصبح الرئتين والكبد شاحبتين ، مما يشير إلى التروية المثلى. يتم استخدام ما يقرب من 20 مل من المخزن المؤقت للتروية لكل ماوس. - إزالة الجلد من منطقة الرقبة وإزالة جميع الدهون والعضلات والأنسجة الضامة لفضح الشرايين السباتية (الشكل 1A).
ملاحظة: يتم تنفيذ بقية الإجراء تحت المجهر تشريح. - اضبط مجال الرؤية لتحديد موقع مواقع الربط. باستخدام مقص التشريح الدقيق مقاس 10 مم ، قم بعمل شق صغير أسفل موقع الربط في LCA للسماح بالتروية.
- قم بالتعديل مرة أخرى لمدة 1 دقيقة إضافية عبر البطين الأيسر وتأكد من أن LCA جيد الأداء وخالي من أي آثار مرئية للدم.
- استخدم ملقط ذو أطراف دقيقة ومقص زنبركي صغير لإزالة الأنسجة المحيطة بالسباتي بعناية أثناء ربط الشريان السباتي بالجسم.
ملاحظة: احرص بشدة على عدم الضغط على الشرايين السباتية أو تمديدها أثناء خطوة التنظيف هذه ، لأن هذا يمكن أن يزيد من عدد الخلايا غير القابلة للحياة. إذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فإن صلاحية الخلية في تعليق الخلية النهائي عادة ما تكون >93٪.
3. عزل الخلية الواحدة المخصب بالخلية البطانية من السباتيدات الفئران
ملاحظة: يمكن تحضير الكواشف الموصوفة أدناه مسبقا وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام: 1x و 0.1x مخازن التحلل أحادية النوى مع الكواشف المدرجة في الجدول 1؛ المخزن المؤقت لغسل النوى الواحدة مع الكواشف المدرجة في الجدول 1 ؛ وصفة المخزن المؤقت للنوى أحادية النوى مع الكواشف المدرجة في الجدول 1. يجب إعداد المخزونات العاملة لهذه المخازن المؤقتة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تركيبة المخزن المؤقت للهضم: كولاجيناز من النوع الثاني 600 U / mL و DNase I 60 U / mL في مصل بقري جنيني (FBS) يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بنسبة 0.5٪.
- في حين أن السباتيدات لا تزال متصلة ، اغسل الجزء الخارجي من الشرايين السباتية بمحلول ملحي طبيعي لطرد أي آثار للدم.
- باستخدام حقنة أنسولين مزودة بإبرة 29 جم ، قم بحقن ~ 50 ميكرولتر من مخزن الهضم المؤقت في تجويف الطرف البعيد من الشريان السباتي الأيسر. عندما يبدأ المخزن المؤقت للهضم في ملء الشريان السباتي ، قم بتثبيت الطرف القريب من الشريان السباتي بمشبك دقيق (الشكل 1B). أدخل 15-20 ميكرولتر إضافية من المخزن المؤقت للهضم في التجويف وقم بقص الطرف البعيد لتجنب إطلاق المخزن المؤقت للهضم.
- ازرع الشرايين السباتية بعناية من الماوس (الشكل 1B ، C) وضعها في أطباق 35 مم تحتوي على محلول ملحي دافئ (عند 37 درجة مئوية) مخزن بالسبس.
ملاحظة: تأكد من وضع كل من المشابك بشكل آمن. إذا أصبح المشبك فضفاضا ، يمكن أن يتسرب محلول الهضم من التجويف ويؤثر على عدد الخلايا التي تم الحصول عليها. إذا حدث هذا ، أضف محلولا إنزيميا إضافيا باستخدام حقنة أنسولين مزودة بإبرة 29 G من الطرف المفتوح للشريان السباتي وقم بتأمين المشبك مرة أخرى (الشكل 1D). إذا تسرب المحلول العازل للإنزيم مرة أخرى ، فمن المحتمل أن يتم قطع الشريان السباتي أثناء عملية الزرع. في هذه الحالة ، تخلص من السباتي واستبعد العينة من الدراسة. المعالجة الخشنة المتكررة للشريان السباتي ستقلل من صلاحية الخلية وجودة إعداد الخلية الواحدة. احرص على تحديد الشرايين السباتية اليسرى واليمنى وتصنيفها بشكل صحيح. - احتضان السباتيدات المزروعة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع هزاز متقطع.
4. احمرار الشرايين السباتية
- بعد الانتهاء من الهضم الأنزيمي اللمعاني ، قم بإزالة الشريان السباتي مع المشابك من الطبق 35 مم. قم بإزالة كل مشبك بعناية ، مع الحرص على عدم تسرب المخزن المؤقت للهضم.
- أمسك بلطف أحد طرفي الشريان السباتي باستخدام ملقط ناعم فوق أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. أدخل إبرة 29 جم مزودة بحقنة أنسولين تحتوي على 100 ميكرولتر من مخزن الهضم الدافئ (37 درجة مئوية) في التجويف باليد الأخرى (الشكل 1D).
- اغسل تجويف الشريان السباتي بسرعة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. امنع التفاعل الإنزيمي بإضافة 0.3 مل من FBS إلى أنبوب 1.5 مل. ضع الأنبوب على الثلج.
ملاحظة: يحتوي التنظيف على خلايا من الهضم الأنزيمي اللمع. إضافة FBS وخفض درجة الحرارة يوقف عملية الهضم الأنزيمي. إذا كان عدد الخلايا في المستحضر مرتفعا ويحتوي على حطام أو أنسجة دهنية ، يوصى بشدة باستخدام مصفاة خلايا 50 أو 70 ميكرومتر لتصفية حطام الأنسجة غير المرغوب فيها. لزيادة عدد الخلايا المفردة ، يوصى بتنظيف السباتات المتعددة. هنا ، للحصول على ما لا يقل عن 5000 خلية ، تم مسح 10-12 سباتي وتجميعها كعينة واحدة. - قم بطرد الخلايا مركزيا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي مجهز بدوار ثابت الزاوية (انظر جدول المواد).
- تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلية في مخزن الهضم المخزن المؤقت الذي يحتوي على كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل جميع الخلايا إلى خلايا مفردة.
ملاحظة: إذا كان عدد الخلايا في المستحضر منخفضا ، فقم بزيادة سرعة جهاز الطرد المركزي حتى 2000-3000 × جم لتدوير الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن استخدام أنابيب الطرد المركزي 0.5 مل يسهل تصورا أفضل لحبيبات الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب. - امنع التفاعل الإنزيمي بإضافة 0.15 مل من FBS إلى أنبوب 0.5 مل.
- جهاز طرد مركزي للتعليق أحادي الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي مجهز بدوار ثابت الزاوية ، كما هو الحال في الخطوة 4.4.
- تخلص من الخارق وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول زلال مصل البقر البارد 1٪ (BSA) في PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق 0.2 مل.
ملاحظة: إن استخدام أنابيب الطرد المركزي سعة 0.2 مل يعزز تصور الكرية أحادية الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب.
5. تحليلات الخلية الواحدة والنواة الواحدة
- أعد تعليق وتقديم إعداد الخلية الواحدة ل scRNAseq.
- أعد تعليق الكريات أحادية الخلية مع 100 ميكرولتر من BSA المثلج البارد بنسبة 1٪ في PBS في أنبوب 0.2 مل.
- بعد إعادة تعليق الخلايا للتغليف أحادي الخلية ، انتقل على الفور إلى تغليف الخلية الواحدة والترميز الشريطي باستخدام نظام تقسيم وترميز أحادي الخلية قائم على الموائع الدقيقة (انظر جدول المواد).
- قبل تقديم العينات إلى نواة الجينوم ، قم بحساب وفحص المستحضرات أحادية الخلية ؛ ضمان عدم وجود مجاميع الخلايا.
ملاحظة: يمكن تقليل تجميع الخلايا المفردة عن طريق زيادة كمية BSA إلى 2٪.
- أعد تعليق وتقديم إعداد الخلية الواحدة ل scATACseq.
- أعد تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من 0.04٪ BSA في 1x PBS البارد المثلج وطرد مركزي لتعليق الخلية الواحدة عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية.
- قم بتخفيف التعليق أحادي الخلية باستخدام المخزن المؤقت للتحلل المثلج 0.1x (الجدول 1) واحتضنه لمدة 5 دقائق على الجليد.
- امزج الليزات 10 مرات مع ماصة P-20 واحتضنها لمدة 10 دقائق إضافية.
- أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل المبرد (الجدول 1) إلى الخلايا المحللة واخلطها 5 مرات باستخدام ماصة.
ملاحظة: استخدم مصفاة خلية 70 ميكرومتر لتصفية أي حطام من تعليق الخلية ونقلها إلى أنبوب 2 مل. - جهاز الطرد المركزي للليزات عند 500 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات النوى في المخزن المؤقت للنوى المخففة (150 ميكرولتر) (انظر جدول المواد والجدول 1). عد وفحص المستحضرات أحادية النوى باستخدام مقياس الدم11.
- أرسل عينة النوى الواحدة إلى نواة الجينوم لنقل النوى المفردة، وتقسيم النوى، وإعداد المكتبة، والتسلسل.
ملاحظة: إذا كان رقم الخلية الأولي منخفضا، فمن الشائع ملاحظة الحطام على طول النوى. لذلك ، يوصى بالبدء برقم خلية مرتفع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء جراحات ربط الشريان السباتي الجزئي على 44 فأرا ، وتم التحقق من صحة بداية تدفق D في LCA عن طريق إجراء التصوير بالموجات فوق الصوتية بعد يوم واحد من جراحة الربط الجزئي. تؤدي جراحة الربط الجزئي الناجحة إلى انخفاض سرعة تدفق الدم وعكس تدفق الدم (التدفق المضطرب) في LCA3. تم تشريح الشرايين السباتية إما في يومين أو في أسبوعين بعد الربط. خضع تجويف كل سباتي لهضم الكولاجيناز ، وتم إعداد الخلايا المفردة المخصب بالبطانة أو معلقات أحادية النواة. تم تجميع المعلقات أحادية الخلية من 10 RCAs و LCAs لزيادة إنتاجية الخلية. تم بعد ذلك ترميز الخلايا / النوى المعدة وتسلسلها. بالنسبة لدراسة sc-RNAseq ، كان عدد الخلايا المفردة التي تم الحصول عليها ~ 9,700. ويبين الجدول 2 توزيع الخلايا من 4 عينات.
وبالمثل ، بالنسبة لدراسة scATACseq ، تم عزل الخلايا المفردة من 12 RCAs و LCAs التي تم إعدادها ، وإخضاعها لعلاج transposase ، والباركود ، والتسلسل. تم إجراء التسلسل ل 18,324 نواة مفردة ، والتي تم تجميعها من 1,291 (RCA لمدة يومين [2D-R]) ، و 5,351 (LCA لمدة يومين [2D-L]) ، و 5,826 (RCA لمدة أسبوعين [2W-R]) ، و 5,856 (LCA لمدة أسبوعين [2W-L]) (الجدول 2). ويوضح الشكل 2A,B الاستعدادات التمثيلية أحادية الخلية والنواة الأحادية كما تصورها المجهر الساطع والمجهر المتباين الطوري. ويبين الشكل 2C كفاءة إعداد النوى الواحدة من التعليق أحادي الخلية.
تم احتضان النوى (~ 7000 لكل منها) من عينات ثنائية الأبعاد (RCAs و LCAs) و 2W (RCAs و LCAs) بمزيج تبديل (إنزيم ترانسبوساز Tn5 ومخزن مؤقت) انظر جدول المواد) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بناء على توصية الشركة المصنعة ، ساعدت حالة المنظفات الخفيفة في الحفاظ على النوى سليمة أثناء وضع العلامات. ثم تم تحميل مزيج رئيسي ، يتكون من كاشف الترميز الشريطي ، والعامل المختزل B ، وإنزيم الترميز الشريطي ، على منصة تغليف الخلايا / النوى الموائع الدقيقة لإعداد مستحلبات هلام أحادية النوى مع الترميز الشريطي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
بعد التسلسل ، تم استخدام مجموعة برامج Cell Ranger أحادية الخلية لإزالة الإرسال المتعدد ، ومحاذاة معالجة الباركود ، والتجميع الأولي لملفات تعريف scATACseq و scRNaseq الخام. بالنسبة لدراسة scRNAseq ، يظهر توزيع الجينات لكل خلية ، والمعرف الجزيئي الفريد (UMI) لكل خلية ، وقراءات الميتوكوندريا لكل خلية ، ومعلومات تشبع التسلسل في الشكل 3A-C. وبالمثل ، بالنسبة لدراسة scATACseq ، تظهر مقاييس مراقبة الجودة التي توضح توزيع حجم الإدراج (نمط النطاقات النووية) ودرجة إثراء TSS الطبيعية في الشكل 3D-F. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النسبة المئوية للقراءات الشظايا في القمم ، وشظايا منطقة الذروة ، ودرجة إثراء TSS ، ونسبة القراءات في مواقع الجينوم في القائمة السوداء ، ونسبة إشارة النيوكليوسوم موضحة في الشكل 3G-K.
تم قياس التخصيب البطاني كميا من خلال مقارنة هذه الطريقة بالهضم الأنزيمي للشريان السباتي بأكمله12. كان عدد الخلايا البطانية من هضم الشريان السباتي الكامل 3-5٪ من إجمالي الخلايا التي تم الحصول عليها ، في حين سمحت هذه الطريقة بتخصيب الخلايا البطانية إلى >50٪ 8. وبالمثل ، أظهرت دراسة أخرى أحادية الخلية استخدمت الشريان الأورطي للفأر بأكمله أن الكسر البطاني كان <7٪ من إجمالي عدد الخلايا. للحصول على تحليل متعمق ل RNAseq أحادي الخلية و ATACseq أحادي الخلية ، يطلب من القراء الرجوع إلى 8.
الشكل 1: عزل الشرايين السباتية لإعداد خلية واحدة. (أ) الرؤية التشريحية للشرايين السباتية في الفئران. تظهر الأسهم الحمراء والداخلية الشريان السباتي الأيسر المعزول بعد تنظيف الدهون المحيطة بالبطنتين. للحصول على مخطط لتشريح السباتي والأربطة ، راجع الشكل 1 في Nam et al3 (B) توضح الصورة موقع المقاطع الدقيقة بعد ملء الشريان السباتي بمخزن الهضم المؤقت. (ج) الشريان السباتي المزروع الذي يحتوي على عازل هضم. المقياس: المسافة بين الخطوط السوداء = 1 مم (D) إبرة 29 G في تجويف الشريان السباتي للفأر. تساعد هذه الخطوة على تجديد الشريان السباتي باستخدام مخزن مؤقت للهضم إذا لزم الأمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد وحيد الخلية ووحيد النوى من الهضم الأنزيمي اللمعاني للشريان السباتي للفأر . (أ) المستحضرات التمثيلية أحادية الخلية والنواة الواحدة. أشرطة المقياس = 0.25 مم (B) تباين الطور التمثيلي وصور Gel-Red للتحفيضات أحادية النواة. أشرطة المقياس = 0.25 مم. (C) تظهر كفاءة إعداد النوى المفردة في العمود الأيسر عدد الخلايا المفردة في البداية بينما يعرض العمود الأيمن عدد النوى المفردة بعد المعالجة باستخدام مخزن مؤقت عزل النوى في خطوات مختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقاييس مراقبة الجودة القياسية لدراسة scRNAseq و scATACseq. تظهر مخططات الكمان (أ) توزيع الجينات لكل خلية (nFeature RNA) ، (B) UMI لكل خلية (nCount_RNA) ، (C) قراءات الميتوكوندريا لكل خلية (النسبة المئوية mt) لبيانات scRNAseq. (D و E) تظهر نمط النطاقات النيوكليوسومية لدراسة scATACseq. يظهر الرسم البياني لأحجام أجزاء الحمض النووي نمط ربط نيوكليوسوم قوي يتوافق مع طول الحمض النووي الملفوف حول نيوكليوسوم واحد. (و) درجة إثراء TSS العادية في كل موضع بالنسبة إلى TSS. تظهر مخططات التشتت / الكمان (G) النسبة المئوية لقراءة الأجزاء في القمم ، وهو مقياس لعمق التسلسل ، (H) شظايا منطقة الذروة التي تظهر عدد الشظايا المتداخلة مع القمم ، (I) درجة إثراء TSS ، وهي نسبة بين التوزيع الكلي للقراءات المتمركزة على TSSs والتي تحيط ب TSS المقابلة ، (J) نسبة القائمة السوداء ، نسبة القراءات في مواقع القائمة السوداء السوداء ، و (K) إشارة النيوكليوسوم ، وهي نسبة من الشظايا أحادية النواة إلى شظايا خالية من النيوكليوسومات. الاختصارات: scRNAseq = تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية; scATACseq = فحص أحادي الخلية لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه عبر الترانسبوساز ؛ مراقبة الجودة = مراقبة الجودة; UMI = معرف جزيئي فريد ؛ TSS = موقع بدء النسخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تكوين التحلل أحادي النوى ومخازن الغسيل. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: عدد الخلايا الأحادية والنوى الواحدة من الهضم اللمعاني للشريان السباتي للفأر. يوضح الجدول أيضا وسائل القراءة / الخلية وعدد الجينات / الخلية لبيانات scRNAseq. بالنسبة لبيانات scATACseq ، يتم عرض متوسط الأجزاء / الخلية وإجمالي القراءات التي تم الحصول عليها لكل عينة8. الاختصارات: scRNAseq = تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية; scATACseq = فحص أحادي الخلية لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه عبر الترانسبوساز ؛ 2D = 2 يوم; 2W = 2 أسبوع; R / RCA = الشريان السباتي الأيمن; L/LCA = الشريان السباتي الأيسر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لعزل مستحضرات الخلية الواحدة عن الشرايين السباتية للفأر. يمكن دراسة تأثير تدفق D على الخلايا البطانية بدقة إذا تم إجراء جراحة PCL بشكل صحيح. من الأهمية بمكان تحديد فروع الشريان السباتي الشائع بشكل صحيح ، مثل الشريان السباتي الخارجي والسباتي الداخلي والشريان القذالي والشريان الدرقي العلوي. التحقق من صحة أنماط التدفق بواسطة التصوير بالموجات فوق الصوتية يزيد من صحة البداية الناجحة لظروف التدفق d . على الرغم من أنه يمكن إجراء جراحة PCL على الفئران بغض النظر عن عمرها ، إلا أن العمر المفضل هو 10 ± أسبوعين. تميل الفئران الأكبر سنا والفئران ذات الخلفيات المفرطة في الكوليسترول بشكل عام إلى الحصول على المزيد من الدهون حول القناة والجلد الأكثر صلابة.
من الضروري تشريح المستحضرات أحادية الخلية المخصب بالبطانية للشريان السباتي بعناية والخالية من الأنسجة المحيطة والدهون المحيطة بالأمعاء. يجب أن يكون تجويف السباتي جيدا لتجنب تلويث خلايا الدم في مستحضرات الخلية الواحدة. يمكن أن يؤدي تحديد الأنسجة ووضع العلامات عليها بشكل غير صحيح إلى انحراف معياري عالي. مطلوب التخطيط الدقيق وإدارة الوقت لهذا البروتوكول. يمكن للجراح والمشغل المهرة أن يستغرق 15-20 دقيقة لإجراء جراحة PCL واحدة. سيستغرق التضحية والعزل السباتي والهضم الأنزيمي المضيء من كل فأر 35-40 دقيقة إضافية. وقت المعالجة العملية من تدفق الخلايا البطانية إلى إعداد خلية واحدة / أحادية النوى هو 2 ساعة إضافية. يوصى بشدة بالتخطيط الدقيق والعمل الجماعي.
وكما هو الحال مع أي بروتوكول تجريبي، ينبغي النظر في بعض العيوب والقيود. لا يتضمن البروتوكول الحالي خطوات لتجنب التنشيط الفعلي للاستجابة المبكرة الفورية أثناء تفكك الأنسجة اللمعانية. وقد أفيد في الأدبيات أن الهضم الأنزيمي يمكن أن يؤدي إلى أحداث إشارات الإجهاد ، مثل الالتهاب وموت الخلايا المبرمج. ويمكن معالجة ذلك من خلال دمج المجموعات الضابطة المناسبة في التصميم التجريبي. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي النظر في الطرق المختبرية الرطبة التي يمكن أن تقلل من التنشيط الاصطناعي للاستجابة الفورية أثناء الهضم الأنزيمي ، مثل البروتياز النشط على البارد ،13,14.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لأي سلالة فأر بغض النظر عن خلفيتها الوراثية. ومع ذلك ، يمكن للمستحضرات الغنية بالبطانة أن تجيب بشكل أفضل على الأسئلة البحثية المتعلقة بالتغيرات في البطانة ، وبالتالي فهي مناسبة تماما للضربات القاضية الخاصة ب EC والفئران المعدلة وراثيا الخاصة ب EC. يمكن تكييف طريقة عزل الخلية الواحدة هذه لإجراء دراسات متعددة الخلايا أحادية الخلية وغيرها من الفحوصات القائمة على قياس التدفق الخلوي مثل قياس التدفق الخلوي للتصوير. يمكن استخدام نهج الهضم المضيء للشريان الأورطي للفئران الذي تم الحصول عليه حديثا ، والشرايين من الحيوانات الكبيرة (الأرانب والخنازير) ، وكذلك للنباتات الوعائية البشرية التي تم الحصول عليها حديثا. بشكل جماعي ، ستسمح لنا هذه الطريقة بفهم الدور الدقيق لتدفق الدم بشكل كامل على وظيفة البطانية وإعادة البرمجة بدقة خلية واحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
HJ هو مؤسس FloKines Pharma. المؤلفون الآخرون ليس لديهم تضارب في المصالح للإعلان.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بتمويل من منح المعاهد الوطنية للصحة HL119798 و HL095070 و HL139757 إلى HJ. يتم دعم HJ أيضا من قبل Wallace H. Coulter Distinguished College Chair Professorship. تم دعم الخدمات التي تقدمها إيموري المتكاملة لعلم الجينوم الأساسي (EIGC) من قبل كلية الطب بجامعة إيموري وتم دعمها جزئيا من قبل تحالف جورجيا للعلوم السريرية والانتقالية التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم. UL1TR002378. المحتوى المقدم أعلاه هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يعكس وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
References
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al.
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
Tags
علم الأحياء، العدد 176، خلايا الشريان، الخلايا البطانية، الحمض النووي الريبي أحادي الخلية، أتاكيس أحادي الخلية، تصلب الشرايينErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 06/22/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
