ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Vi presenterer en metode for å isolere endotelceller og kjerner fra lumen i halspulsårene hos mus utsatt for stabile eller forstyrrede strømningsforhold for å utføre encellede omics-eksperimenter.
Abstract
Aterosklerose er en inflammatorisk sykdom i arterielle områder utsatt for forstyrret blodstrøm (d-flow). D-flow regulerer ekspresjonen av gener i endotelet på transkriptomiske og epigenomiske nivåer, noe som resulterer i proatherogene responser. Nylig ble enkeltcellet RNA-sekvensering (scRNAseq) og enkeltcelleanalyse for transposasetilgjengelig kromatinsekvensering (scATACseq) studier utført for å bestemme transkripsjons- og kromatintilgjengelighetsendringene ved en enkeltcelleoppløsning ved bruk av musens partielle karotisligeringsmodell (PCL). Siden endotelceller (ECs) representerer en mindre del av de totale cellepopulasjonene i arterieveggen, ble det brukt en luminal fordøyelsesmetode for å oppnå EC-berikede enkeltcellepreparater. For denne studien ble mus utsatt for PCL-kirurgi for å indusere d-strømning i venstre halspulsåren (LCA) mens de brukte høyre halspulsåren (RCA) som en kontroll. Karoten arterier ble dissekert ut to dager eller to uker etter PCL-kirurgi. Lumen av hver karoten ble utsatt for kollagenasefordøyelse, og endotelberikede enkeltceller eller enkeltkjerner ble oppnådd. Disse enkeltcellede og enkeltkjernepreparatene ble deretter strekkodet ved hjelp av et 10x Genomics mikrofluidisk oppsett. De strekkodede enkeltcellene og enkeltkjernene ble deretter brukt til RNA-forberedelse, bibliotekgenerering og sekvensering på en DNA-sequencer med høy gjennomstrømning. Etter bioinformatikkbehandling identifiserte datasettene scRNAseq og scATACseq forskjellige celletyper fra luminal fordøyelse, hovedsakelig bestående av ECs. Glatte muskelceller, fibroblaster og immunceller var også til stede. Denne EC-anrikningsmetoden hjalp til med å forstå effekten av blodstrømmen på endotelet, noe som kunne ha vært vanskelig med den totale arteriefordøyelsesmetoden. Den EC-berikede enkeltcellepreparasjonsmetoden kan brukes til å utføre enkeltcellede omics-studier i EC-knockouts og transgene mus der effekten av blodstrømmen på disse genene ikke er studert. Det er viktig at denne teknikken kan tilpasses for å isolere EC-berikede enkeltceller fra humane arterieplanter for å utføre lignende mekanistiske studier.
Introduction
Dette laboratoriet har tidligere vist at induksjon av d-flow fører til rask og robust ateroskleroseutvikling hos hyperlipidemiske mus 1,2. Den nye musemodellen av d-flow-indusert aterosklerose var mulig ved bruk av partiell carotisligasjon (PCL) kirurgi 3. PCL-kirurgi induserer lav og oscillerende blodstrømstilstand eller d-strømning i den ligerte venstre halspulsåren (LCA). I motsetning til dette fortsetter den kontralaterale høyre halspulsåren (RCA) å møte stabil laminær strømning (s-flow). Tidligere, for å forstå effekten av d-flow på endotelceller, ble halspulsårene dissekert ut etter delvis ligeringskirurgi og skyllet med et fenol- og guanidinisotiocyanatbasert lysingsmiddel (luminal RNA / DNA-spylemetode)2,4, som ga endotelberiket "pooled bulk" RNA eller DNA. Disse samlede bulk-RNA-ene eller DNA-ene ble deretter behandlet for transkriptomiske studier eller epigenomiske DNA-metylomstudier, henholdsvis 4,5,6. Disse studiene bidro til å oppdage flere strømningsfølsomme gener og mikroRNA hvis roller i endotelbiologi og aterosklerose ble grundig undersøkt 4,6,7.
Til tross for endotelberikelse, kunne disse bulk RNA / DNA-studiene imidlertid ikke skille den spesifikke rollen til hver celletype i arterieveggen i d-flow-indusert aterosklerose. Endotelberiket enkeltcelleisolasjon (sc) og scRNA- og scATAC-sekvenseringsstudier ble utført for å overvinne denne begrensningen8. For dette ble C57Bl6-mus utsatt for PCL-kirurgi for å indusere d-flow i LCA mens de brukte s-flow-eksponert RCA som kontroll. To dager eller to uker etter PCL-operasjonen ble musene ofret, og carotisene ble dissekert og ryddet opp. Lumen i både LCA og RCA ble infundert med kollagenase, og luminal kollagenasefordøyelser som inneholdt ECs som en signifikant fraksjon og andre arterielle celler ble samlet inn. Enkeltcellesuspensjonen (scRNAseq) eller enkeltkjernesuspensjonen (scATACseq) ble fremstilt og strekkodet med unike identifikatorer for hver celle eller kjerne ved hjelp av et 10x Genomics-oppsett. RNA-ene ble utsatt for cDNA-bibliotekforberedelse og sekvensert.
ScRNAseq- og scATACseq-datasettene ble behandlet ved hjelp av Cell Ranger Single-Cell Software og videre analysert av Seurat og Signac R-pakke 9,10. Hver celle og kjerne ble tildelt en celletype fra disse analysene og gruppert i celletypen basert på markørgenene og unike genuttrykksmønstre. Resultatene av scRNAseq og scATACseq viste at disse enkeltcellepreparatene er beriket med ECs og inneholder også glatte muskelceller (SMC), fibroblaster og immunceller.
Videre analyse viste at EC-populasjonen i luminalfordøyelsen er svært divergerende og plastisk (8 forskjellige EC-klynger) og reagerer på blodstrømmen. Viktigst, disse resultatene viste at d-flow omprogrammerer ECs fra en atherobeskyttet antiinflammatorisk fenotype til pro-atherogene fenotyper, inkludert proinflammatorisk, endotel-til-mesenkymal overgang, endotelstamme / stamcelleovergang, og mest overraskende, endotel-til-immuncelle-lignende overgang. I tillegg avslører scATACseq-data nye flytavhengige kromatintilgjengelighetsendringer og transkripsjonsfaktorbindingssteder på en genomomfattende måte, som danner grunnlaget for flere nye hypoteser. Metodikken og protokollen for fremstilling av enkeltendotelceller for enkeltcellede multi-omics-studier fra musens karoten arterier er beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer beskrevet nedenfor ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Emory University. Ikke-hyperkolesterolemiske, alders- og kjønnsmatchede C57BL/6-mus ble brukt til å redusere kjønnsavhengig variasjon og oppveie eventuelle komplikasjoner ved hyperkolesterolemiske tilstander.
1. Delvis carotis ligering (PCL) kirurgi
MERK: Partiell ligering av LCA i halspulsåren ble utført som tidligere beskrevet og vist3.
- Bedøv musen ved isofluraninnånding (5% isofluoran i oksygen for induksjon og 1,5% etter det for vedlikehold) gjennom hele prosedyren ved bruk av en bedøvelsesfordamper. Plasser musen liggende på en Deltaphase isotermisk pute for å forhindre tap av kroppsvarme under operasjonen.
- Påfør en okulær salve for å forhindre eksponering keratitt, og bekreft dybden av anestesi ved fravær av tåklemmerespons.
- Injiser buprenorfin 0,05 mg/kg subkutant for å håndtere smerte preemptively. Desinfiser det epilerte området ved å påføre og rengjøre med betadin og isopropanoloppløsning tre ganger. Sørg for at betadin er det siste trinnet for å sterilisere operasjonsområdet, starter fra midten og slutter på sidene.
- Ved hjelp av aseptiske teknikker, gjør et ventral midtlinjesnitt (~ 1 cm) i nakkeområdet, og utsett LCA-grenpunktet ved stump disseksjon.
- Ligate venstre indre carotis, ekstern carotis og occipital arteries med 6-0 silke sutur; La arteria thyreoidea superior ligge urørt.
- Omtrentlig huden og lukk snittet med vevslim og/eller suturer.
- Overfør musen til et forvarmet gjenopprettingsbur (vedlikeholdt ved 37 °C) og legg den på et rent håndkle i opptil 1 time for å unngå hypotermi etter operasjonen.
MERK: Vår erfaring er at en forkjøps enkeltdose buprenorfin (0,05 mg/kg) vanligvis er tilstrekkelig for smertebehandling etter operasjonen. En gjentatt dose buprenorfin kan administreres hvis dyret er i nød etter de første 24 timene. Hvis det utføres riktig, er det ingen dødelighet forbundet med denne prosedyren, og postoperativ belastning på musen er minimal. Musene returneres til sine respektive bur og overvåkes daglig etter operasjonen. - Forbered perfusjonsoppsettet.
- Bruk 0,9 % NaCl (vanlig saltvann) som inneholder 10 U/ml heparin i en i.v. pose. Hekt IV-posen 244-274 cm (8-9 fot) fra bakken eller omtrent 122-152 cm (4-5 fot) høyere enn disseksjonsbrettet. Fest sommerfuglnålen til enden av saltvannslinjen og skyll eventuelle luftbobler ut av IV-linjen.
2. Isolering av karoten arterier etter offer
- Ofre musene ved CO 2-innånding etter den institusjonelle IACUC-protokollen.
- Spray 70% etanol på musehuden og legg den i liggende stilling på disseksjonstavlen som inneholder adsorberende papirhåndklær. Fest musens poter til adsorbenthåndklærne på disseksjonstavlen ved hjelp av tape eller en 21 G nål.
- Bruk en steril saks, fjern musens hud fra magen og helt til toppen av thoraxen.
- Bruk en saks for å åpne bukveggen under brystkassen ved stump disseksjon.
- Bruk saksen, gjør forsiktig et snitt langs lengden på membranen, og fortsett gjennom ribbeina på begge sider av thoraxen til brystbenet kan løftes bort. Løft forsiktig bort brystbenet med et par tang; Fjern deretter brystkassen for å eksponere hjertet.
- Fjern forsiktig thymus og bindevev over hjertet for å visualisere de store karene.
- Sever vena cava med saks for å la blodet komme ut av lukket sirkulasjon.
- Sett inn en 21 G sommerfuglnål koblet til IV-linjen gjennom hjertets topp i venstre ventrikel og tillat retrograd perfusjon i 2-3 minutter med normal saltvann ved romtemperatur. Sørg for at en konstant strømningshastighet av normal saltvann opprettholdes ved å holde saltvannsposen i høyden 8-9 meter fra bakken.
MERK: Lungene og leveren blir bleke, noe som indikerer optimal perfusjon. Omtrent 20 ml perfusjonsbuffer brukes for hver mus. - Fjern huden fra halsregionen og fjern alt fett, muskler og bindevev for å eksponere halspulsårene (figur 1A).
MERK: Resten av prosedyren utføres under dissekeringsmikroskopet. - Juster synsfeltet for å finne ligeringsstedene. Bruk 10 mm mikrodisseksjonssaks til å lage et lite snitt under ligeringsstedet i LCA for å tillate perfusjon.
- Perfuse igjen i ytterligere 1 minutt via venstre ventrikkel og sørg for at LCA er godt perfundert og fri for synlige spor av blod.
- Bruk finspiss tang og liten fjærsaks for å forsiktig fjerne peri-adventitial vev rundt carotis mens carotis er festet til kroppen.
MERK: Vær ekstremt forsiktig så du ikke klemmer eller strekker halspulsårene under dette rengjøringstrinnet, da dette kan øke antall ikke-levedyktige celler. Hvis det utføres riktig, er cellens levedyktighet i den endelige cellesuspensjonen vanligvis >93%.
3. Endotel-celle-beriket encellet encellet isolasjon fra mus carotis
MERK: Reagensene beskrevet nedenfor kan fremstilles på forhånd og oppbevares ved 4 °C til bruk: 1x og 0,1x enkeltkjernelysebuffere med reagensene listet opp i tabell 1; enkeltkjerner vaskebuffer med reagensene listet opp i tabell 1; single-nuclei Nuclei Buffer oppskrift med reagensene oppført i tabell 1. Arbeidslagrene for disse bufferne skal utarbeides i henhold til produsentens protokoll. Fordøyelsesbuffersammensetning: Kollagenase Type II 600 U / ml og DNase I 60 U / ml i 0,5% føtalt bovint serum (FBS) -inneholdende fosfatbufret saltvann (PBS).
- Mens carotisene fortsatt er festet, vask utsiden av halspulsårene med normal saltoppløsning for å skylle bort spor av blod.
- Bruk en insulinsprøyte utstyrt med en 29 G kanyle, injiser ~ 50 μL av fordøyelsesbufferen inn i lumen i den distale enden av venstre halspulsåre. Når fordøyelsesbufferen begynner å fylle halspulsåren, klemmer du den proksimale enden av halspulsåren med en mikroklemme (figur 1B). Innfør en ekstra 15-20 μL fordøyelsesbuffer i lumen og klipp den distale enden for å unngå frigjøring av fordøyelsesbufferen.
- Eksplant halspulsårene forsiktig fra musen (figur 1B, C) og legg dem i 35 mm retter som inneholder varm (ved 37 ° C) Hepes-bufret saltoppløsning.
MERK: Forsikre deg om at begge klemmene er ordentlig plassert. Hvis klemmen løsner, kan fordøyelsesløsningen lekke ut av lumen og påvirke det oppnådde celletallet. Hvis dette skjer, tilsett ytterligere enzymatisk oppløsning ved hjelp av en insulinsprøyte utstyrt med en 29 G kanyle fra den åpne enden av caroten og fest klemmen igjen (figur 1D). Hvis enzymbufferløsningen lekker igjen, er det sannsynlig at karoten blir kuttet under eksplantationprosessen. I dette tilfellet skal du kaste bort caroten og ekskludere prøven fra studien. Gjentatt grov håndtering av karoten vil redusere cellens levedyktighet og kvaliteten på encellet preparat. Pass på å identifisere og riktig merke venstre og høyre karoten arterier. - Inkuber de eksplanterte carotisene i 45 minutter ved 37 °C med intermitterende gynging.
4. Spyling av halspulsårene
- Etter å ha fullført luminal enzymatisk fordøyelse, fjern halspulsåren sammen med klemmene fra 35 mm parabolen. Fjern forsiktig hver klemme, pass på at fordøyelsesbufferen ikke lekker.
- Hold forsiktig den ene enden av halspulsåren med fine tang på toppen av et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Stikk en 29 G kanyle utstyrt med en insulinsprøyte inneholdende 100 μL varm fordøyelsesbuffer (37 °C) inn i lumen med den andre hånden (figur 1D).
- Skyll raskt lumen av karoten inn i mikrosentrifugerøret. Blokker den enzymatiske reaksjonen ved å tilsette 0,3 ml FBS i 1,5 ml røret. Legg røret på is.
MERK: Spylingen inneholder cellene fra den luminale enzymatiske fordøyelsen. Tilsetning av FBS og reduksjon av temperaturen stopper den enzymatiske fordøyelsesprosessen. Hvis antall celler i preparatet er høyt og inneholder rusk eller fettvev, anbefales bruk av en 50 eller 70 μm cellesil sterkt for å filtrere ut uønskede vevsrester. For å øke enkeltcelletallet anbefales det å skylle flere carotis. Her, for å oppnå minst 5000 celler, ble 10-12 carotis skyllet og samlet som en prøve. - Sentrifuge cellene ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C ved hjelp av en sentrifuge utstyrt med en fastvinkelrotor (se materialtabellen).
- Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i fordøyelsesbuffer som inneholder celledissosiasjonsreagens (se materialtabellen) i 5 minutter ved 37 °C for å skille alle cellene i enkeltceller.
MERK: Hvis antall celler i preparatet er lavt, øk sentrifugehastigheten opp til 2,000-3,000 × g for å spinne ned cellene. Videre muliggjør bruk av 0,5 ml sentrifugerør bedre visualisering av cellepelleten i bunnen av røret. - Blokker den enzymatiske reaksjonen ved å tilsette 0,15 ml FBS i 0,5 ml røret.
- Sentrifuge enkeltcelleopphenget ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C ved hjelp av en sentrifuge utstyrt med en fastvinklet rotor, som i trinn 4.4.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 100 μL iskald 1% bovin serumalbumin (BSA) løsning i PBS i et 0,2 ml mikrosentrifugerør.
MERK: Bruk av 0,2 ml sentrifugerør forbedrer visualiseringen av enkeltcellepelleten i bunnen av røret.
5. Enkeltcelleanalyser og enkeltkjerneanalyser
- Resuspendere og sende inn enkeltcellepreparatet for scRNAseq.
- Resuspender encellet pellet med 100 μL iskald 1% BSA i PBS i et 0,2 ml rør.
- Etter resuspendering av cellene for encellet innkapsling, fortsett umiddelbart for encellet innkapsling og strekkoding ved hjelp av et mikrofluidikkbasert enkeltcellepartisjonerings- og strekkodingssystem (se materialtabellen).
- Før du sender prøvene til Genomics Core, teller og inspiserer enkeltcellepreparatene; sørg for fravær av celleaggregater.
MERK: Aggregering av enkeltceller kan minimeres ytterligere ved å øke BSA-mengden opp til 2%.
- Resuspendere og sende enkeltcellepreparatet for scATACseq.
- Resuspender cellepelleten i 100 μL på 0,04% BSA i iskald 1x PBS og sentrifuger enkeltcellesuspensjonen ved 500 × g ved 4 °C.
- Lyse encellet suspensjon med iskald 0,1x lysisbuffer (tabell 1) og rug i 5 minutter på is.
- Bland lysatet 10 ganger med en P-20 pipette og inkuber i ytterligere 10 minutter.
- Tilsett 500 μL kjølt vaskebuffer (tabell 1) til de opplyste cellene og bland 5 ganger ved hjelp av en pipette.
MERK: Bruk en 70 μm cellesil for å filtrere rusk fra cellesuspensjonen og overfør dem til et 2 ml rør. - Sentrifuge lysatet ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspender kjernepelleten i den fortynnede kjernebufferen (150 μL) (se materialtabellen og tabell 1). Tell og inspiser enkeltkjernepreparatene ved hjelp av et hemocytometer11.
- Send inn enkeltkjerneprøven til Genomics Core for enkeltkjernetransponering, kjernepartisjonering, bibliotekforberedelse og sekvensering.
MERK: Hvis det opprinnelige celletallet er lavt, er det vanlig å observere rusk langs kjernene. Derfor anbefales det å starte med et høyt cellenummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Partielle carotisligasjonsoperasjoner ble utført på 44 mus, og debut av d-flow i LCA ble validert ved å utføre ultralyd en dag etter partiell ligeringskirurgi. Vellykket delvis ligeringskirurgi forårsaker redusert blodstrømningshastighet og reverserer blodstrømmen (forstyrret strømning) i LCA3. Halspulsårene ble dissekert ut enten to dager eller to uker etter ligasjon. Lumen av hver carotis ble utsatt for kollagenasefordøyelse, og endotelberikede enkeltceller eller enkeltkjernesuspensjoner ble fremstilt. Enkeltcellesuspensjoner ble samlet fra 10 RCAer og LCA-er for å øke celleutbyttet. Cellene/kjernene som ble tilberedt ble deretter strekkodet og sekvensert. For sc-RNAseq-studien var antall enkeltceller oppnådd ~ 9,700. Fordelingen av celler fra 4 prøver er vist i tabell 2.
På samme måte, for scATACseq-studien, ble enkeltceller isolert fra 12 RCAer og LCAer som ble forberedt, utsatt for transposasebehandling, strekkodet og sekvensert. Sekvensering ble utført for 18 324 enkeltkjerner, som ble samlet fra 1 291 (2-dagers RCA [2D-R]), 5 351 (2-dagers LCA [2D-L]), 5 826 (2-ukers RCA [2W-R]) og 5 856 (2-ukers LCA [2W-L]) (tabell 2). Representative enkeltcelle- og enkeltkjernepreparater som visualisert ved lysfeltmikroskopi og fasekontrastmikroskopi er vist i figur 2A, B. Effektiviteten av enkeltkjernepreparasjon fra encellet suspensjon er vist i figur 2C.
Kjernene (~ 7000 hver) fra 2D (RCA og LCA) og 2W (RCA og LCA) prøver ble inkubert med en transposisjonsblanding (Tn5 transposase enzym og buffer) se materialtabellen) i 60 minutter ved 37 ° C etter produsentens protokoll. Basert på produsentens anbefaling bidro en mild vaskemiddeltilstand til å holde kjernene intakte under merking. En hovedblanding, bestående av et strekkodingsreagens, reduksjonsmiddel B og strekkodingsenzym, ble deretter lastet på en mikrofluidisk celle / kjerneinnkapslingsplattform for å fremstille enkeltkjernegelemulsjoner med strekkoding i henhold til produsentens instruksjoner.
Etter sekvensering ble Cell Ranger Single-Cell Software-pakken brukt til demultiplexing, strekkodebehandlingsjustering og innledende klynger av rå scATACseq- og scRNaseq-profilene. For scRNAseq-studien er fordelingen av gener per celle, unik molekylær identifikator (UMI) per celle, mitokondriell lesing per celle og sekvenseringsmetningsinformasjon vist i figur 3A-C. På samme måte, for scATACseq-studien, er kvalitetskontrollmålinger som viser innsatsstørrelsesfordelingen (nukleosombåndsmønster) og normalisert TSS-anrikningspoeng vist i figur 3D-F. I tillegg leser prosentfragmentet i toppene, toppregionfragmentene, TSS-anrikningsscore, forholdet mellom avlesninger i svartelistegenomiske steder og nukleosomsignalforhold er vist i figur 3G-K.
Endotelberikelse ble kvantifisert ved å sammenligne denne metoden med enzymatisk fordøyelse av hele halspulsåren12. Endotelcelletallet fra hele karotisarteriefordøyelsen var 3-5% av de totale cellene som ble oppnådd, mens denne metoden tillot anrikning av endotelceller til >50% 8. Tilsvarende viste en annen enkeltcellestudie som brukte hele museaorta at endotelfraksjonen var <7% av det totale celletallet. For en grundig encellet RNAseq og encellet ATACseq-analyse, blir leserne bedt om å referere til 8.
Figur 1: Isolering av halspulsårer til encellet preparering. (A) Anatomisk visning av halspulsårene hos mus. Røde piler og innfelt viser isolert venstre halspulsåre etter opprydding av periadventitial fett. For et skjema over halspulsårens anatomi og ligeringer, se figur 1 i Nam et al3 (B) Bildet viser plasseringen av mikroklemmer etter å ha fylt halspulsåren med fordøyelsesbufferen. (C) Eksplantet halspulsåren som inneholder fordøyelsesbuffer. Skala: avstand mellom svarte linjer = 1 mm. (D) En 29 G nål i lumen i musens halspulsåren. Dette trinnet bidrar til å fylle halspulsåren med fordøyelsesbuffer om nødvendig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Encelle- og enkeltkjernepreparat fra luminal enzymatisk fordøyelse av halspulsåren mus. (A) Representative encellede og enkeltkjernepreparater. Skalastenger = 0,25 mm (B) Representativ fasekontrast og gelrøde bilder av enkeltkjernepreps. Skalastenger = 0,25 mm. (C) Effektivitet av enkeltkjernepreparasjon i venstre kolonne viser antall enkeltceller ved starten, mens høyre kolonne viser antall enkeltkjerner etter behandling med kjerneisolasjonsbuffer i forskjellige trinn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Standard QC-beregninger for scRNAseq- og scATACseq-studien. Fiolinplott viser (A) fordelingen av gener per celle (nFeature RNA), (B) UMI per celle (nCount_RNA), (C) mitokondriell leser per celle (prosent mt) for scRNAseq-dataene. (D og E) viser nukleosombåndmønsteret for scATACseq-studien. Histogrammet av DNA-fragmentstørrelser utviser et sterkt nukleosombåndmønster som tilsvarer lengden på DNA viklet rundt et enkelt nukleosom. (F) Normalisert TSS-anrikningspoeng ved hver posisjon i forhold til TSS. Sprednings-/fiolinplottene viser (G) prosentfragmentavlesninger i toppene, et mål på sekvenseringsdybde, (H) toppregionfragmenter som viser antall fragmenter som overlapper topper, (I) TSS-anrikningsscore, et forhold mellom den samlede fordelingen av avlesninger sentrert på TSS-er og som flankerer den tilsvarende TSS, (J) svartelisteforholdet, et forhold mellom avlesninger i svartelistegenomiske steder, og (K) nukleosomsignal, et forhold mellom mononukleosomale og nukleosomfrie fragmenter. Forkortelser: scRNAseq = encellet RNA-sekvensering; scATACseq = enkeltcelleanalyse for transposase tilgjengelig kromatinsekvensering; QC = kvalitetskontroll; UMI = unik molekylær identifikator; TSS = transkripsjon startsted. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Sammensetning av enkeltkjernelyse og vaskebuffere. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Enkeltcelle- og enkeltkjernetall fra halspulsåren på mus. Tabellen viser også gjennomsnitt leser / celle og antall gener / celle for scRNAseq data. For scATACseq-dataene vises gjennomsnittlige fragmenter/celle og totale avlesninger oppnådd per prøve8. Forkortelser: scRNAseq = encellet RNA-sekvensering; scATACseq = enkeltcelleanalyse for transposase tilgjengelig kromatinsekvensering; 2D = 2-dagers; 2W = 2-ukers; R/RCA = høyre halspulsåre; L/LCA = venstre halspulsåre. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret gir en detaljert protokoll for å isolere enkeltcellepreparater fra musens karoten arterier. Påvirkningen av d-strømning på endotelcellene kan studeres nøyaktig hvis PCL-operasjonen utføres riktig. Det er avgjørende å korrekt identifisere grenene av den vanlige carotis, slik som den eksterne carotis, indre carotis, occipital arterie, og overlegen thyroid arterie. Validering av strømningsmønstre ved ultralyd validerer ytterligere det vellykkede utbruddet av d-strømningsforhold . Selv om PCL-kirurgi kan utføres på mus uavhengig av alder, er den foretrukne alderen 10 ± 2 uker. Eldre mus og mus med hyperkolesterolemisk bakgrunn har generelt en tendens til å ha mer periadventitielt fett og stivere hud.
Det er viktig å nøye dissekere halspulsåren endotelberikede enkeltcellepreparater fri for det omkringliggende vevet og periadventitialfettet. Lumen i karoten må perfunderes grundig for å unngå å forurense blodceller i enkeltcellepreparatene. Feil vevsidentifikasjon og merking kan føre til høyt standardavvik. Nøye planlegging og tidsstyring er nødvendig for denne protokollen. En dyktig kirurg og operatør kan ta 15-20 minutter å utføre en PCL-operasjon. Ofring, carotisisolasjon og luminal enzymatisk fordøyelse fra hver mus vil ta ytterligere 35-40 minutter. Den praktiske behandlingstiden fra endotelcellespyling til enkeltcelle-/enkeltkjerneprep er ytterligere 2 timer. Grundig planlegging og teamarbeid anbefales på det sterkeste.
Som med enhver eksperimentell protokoll, bør noen ulemper og begrensninger vurderes. Den nåværende protokollen inneholder ikke trinn for å unngå artefakt aktivering av umiddelbar tidlig respons under luminal vevsdissosiasjon. Det har blitt rapportert i litteraturen at enzymatisk fordøyelse kan føre til stresssignalerende hendelser, som betennelse og apoptose. Dette kan løses ved å inkorporere passende kontrollgrupper i eksperimentell design. I tillegg bør våte laboratoriemetoder som kan minimere artefaktaktivering av umiddelbar respons under enzymatisk fordøyelse, for eksempel kaldaktive proteaser, vurderes13,14.
Denne protokollen kan brukes til enhver musestamme uavhengig av dens genetiske bakgrunn. Imidlertid kan de endotelberikede preparatene best svare på forskningsspørsmål knyttet til endringene i endotelet og er derfor godt egnet for EC-spesifikke knockouts og EC-spesifikke transgene mus. Denne encellede isolasjonsmetoden kan tilpasses for å utføre enkeltcellede multi-omics-studier og andre flowcytometribaserte analyser som Imaging Flow Cytometry. Den luminale fordøyelsesmetoden kan brukes til nyoppnådde museaorta, arterier fra store dyr (kaniner og griser), samt for nyoppnådde humane vaskulære eksplanter. Samlet vil denne metoden tillate oss å forstå den nøyaktige rollen som blodstrømmen på endotelfunksjon og omprogrammering ved en enkeltcelleoppløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
HJ er grunnleggeren av FloKines Pharma. Andre forfattere har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra National Institutes of Health tilskudd HL119798, HL095070 og HL139757 til HJ. HJ støttes også av Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Tjenestene som tilbys av Emory Integrated Genomics Core (EIGC) ble subsidiert av Emory University School of Medicine og ble også delvis støttet av Georgia Clinical and Translational Science Alliance of the National Institutes of Health under pris nr. UL1TR002378. Innholdet ovenfor er utelukkende forfatternes ansvar og gjenspeiler ikke de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
References
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al.
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
Tags
Biologi Utgave 176 Arterieceller Endotelceller encellet RNAseq encellet ATACseq AteroskleroseErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 06/22/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
