Isolering af endotelceller fra lumen i musens halspulsårer til enkeltcellede multi-omics-eksperimenter

Summary

Vi præsenterer en metode til isolering af endotelceller og kerner fra lumen i musens halspulsårer udsat for stabile eller forstyrrede strømningsforhold for at udføre enkeltcelle omics-eksperimenter.

Abstract

Aterosklerose er en inflammatorisk sygdom i arterielle regioner udsat for forstyrret blodgennemstrømning (d-flow). D-flow regulerer ekspressionen af gener i endotelet på de transkriptomiske og epigenomiske niveauer, hvilket resulterer i proatherogene reaktioner. For nylig blev enkeltcellede RNA-sekventering (scRNAseq) og enkeltcelleassay for transposase tilgængelig kromatinsekventering (scATACseq) undersøgelser udført for at bestemme de transkriptomiske og kromatintilgængelighedsændringer ved en enkeltcelleopløsning ved hjælp af musens partielle carotisligation (PCL) model. Da endotelceller (EC'er) repræsenterer en mindre brøkdel af de samlede cellepopulationer i arterievæggen, blev der anvendt en luminal fordøjelsesmetode til at opnå EC-berigede enkeltcellepræparater. Til denne undersøgelse blev mus udsat for PCL-kirurgi for at inducere d-flow i venstre halspulsåre (LCA), mens de brugte højre halspulsåre (RCA) som kontrol. Halspulsårerne blev dissekeret to dage eller to uger efter PCL-operationen. Lumen i hver carotis blev udsat for kollagenasefordøjelse, og endotelberigede enkeltceller eller enkeltkerner blev opnået. Disse enkeltcellede og enkeltkernepræparater blev efterfølgende stregkodet ved hjælp af en 10x Genomics mikrofluidisk opsætning. De stregkodede enkeltceller og enkeltkerner blev derefter brugt til RNA-forberedelse, biblioteksgenerering og sekventering på en DNA-sequencer med høj kapacitet. Efter bioinformatikbehandling identificerede scRNAseq- og scATACseq-datasættene forskellige celletyper fra luminalfordøjelsen, primært bestående af EC'er. Glatte muskelceller, fibroblaster og immunceller var også til stede. Denne EC-berigelsesmetode hjalp med at forstå virkningen af blodgennemstrømning på endotelet, hvilket kunne have været vanskeligt med den samlede arteriefordøjelsesmetode. Den EC-berigede enkeltcellepræparationsmetode kan anvendes til at udføre enkeltcellede omics-undersøgelser i EC-knockouts og transgene mus, hvor virkningen af blodgennemstrømning på disse gener ikke er undersøgt. Det er vigtigt, at denne teknik kan tilpasses til at isolere EC-berigede enkeltceller fra humane arterieeksplanter til at udføre lignende mekanistiske undersøgelser.

Introduction

Dette laboratorium har tidligere vist, at induktion af d-flow fører til hurtig og robust ateroskleroseudvikling hos hyperlipidæmiske mus ^1,2. Den nye musemodel af d-flow-induceret åreforkalkning var mulig ved hjælp af delvis carotisligation (PCL) kirurgi ³. PCL-kirurgi inducerer lav og oscillerende blodgennemstrømningstilstand eller d-flow i den ligerede venstre halspulsåre (LCA). I modsætning hertil fortsætter den kontralaterale højre halspulsåre (RCA) med stabil laminær strømning (s-flow). Tidligere, for at forstå effekten af d-flow på endotelceller, blev halspulsårerne dissekeret efter delvis ligeringskirurgi og skyllet med et phenol- og guanidinisothiocyanatbaseret lyseringsmiddel (luminal RNA / DNA-skyllemetode)^2,4, som gav endotelberigede "pooled bulk" RNA'er eller DNA'er. Disse samlede bulk-RNA'er eller DNA'er blev derefter behandlet til transkriptomiske undersøgelser eller epigenomiske DNA-methylomundersøgelser, henholdsvis ^4,5,6. Disse undersøgelser hjalp med at opdage flere flowfølsomme gener og mikroRNA'er, hvis roller i endotelbiologi og aterosklerose blev grundigt undersøgt ^4,6,7.

På trods af endotelberigelse kunne disse bulk RNA / DNA-undersøgelser imidlertid ikke skelne mellem hver celletypes specifikke rolle i arterievæggen i d-flow-induceret aterosklerose. Endotelberiget enkeltcelle (sc) isolation og scRNA- og scATAC-sekventeringsstudier blev udført for at overvinde denne begrænsning⁸. Til dette blev C57Bl6-mus udsat for PCL-operationen for at inducere d-flow i LCA, mens de brugte den s-flow-eksponerede RCA som kontrol. To dage eller to uger efter PCL-operationen blev musene ofret, og carotiderne blev dissekeret og ryddet op. Lumen fra både LCA'er og RCA'er blev infunderet med collagenase, og de luminale collagenasefordøjelser indeholdende EC'er som en signifikant fraktion og andre arterielle celler blev opsamlet. Enkeltcellesuspensionen (scRNAseq) eller enkeltkernesuspensionen (scATACseq) blev forberedt og stregkodet med unikke identifikatorer for hver celle eller kerne ved hjælp af en 10x Genomics-opsætning. RNA'erne blev udsat for cDNA-biblioteksforberedelse og sekventeret.

ScRNAseq- og scATACseq-datasættene blev behandlet ved hjælp af Cell Ranger Single-Cell-softwaren og yderligere analyseret af Seurat- og Signac R-pakkerne ^9,10. Hver celle og kerne blev tildelt en celletype fra disse analyser og grupperet i celletypen baseret på markørgener og unikke genekspressionsmønstre. Resultaterne af scRNAseq og scATACseq viste, at disse enkeltcellepræparater er beriget med EC'er og også indeholder glatte muskelceller (SMC'er), fibroblaster og immunceller.

Yderligere analyse viste, at EF-populationen i luminalfordøjelsen er meget divergerende og plastisk (8 forskellige EC-klynger) og lydhør over for blodgennemstrømning. Vigtigst af alt viste disse resultater, at d-flow omprogrammerer EC'er fra en atherobeskyttet antiinflammatorisk fænotype til pro-atherogene fænotyper, herunder proinflammatorisk, endotel-til-mesenkymal overgang, endotelstamme / stamcelleovergang og mest overraskende endotel-til-immuncellelignende overgang. Derudover afslører scATACseq-data nye flowafhængige kromatintilgængelighedsændringer og transkriptionsfaktorbindingssteder på en genom-dækkende måde, som danner grundlag for flere nye hypoteser. Metoden og protokollen til fremstilling af enkeltendotelceller til enkeltcellede multi-omics-undersøgelser fra musens halspulsårer er beskrevet nedenfor.

Protocol

Alle dyreforsøg beskrevet nedenfor blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Emory University. Ikke-hyperkolesterolemiske, alders- og kønsmatchede C57BL/6-mus blev brugt til at afbøde kønsafhængig variation og opveje enhver komplikation af hyperkolesterolemiske tilstande.

1. Delvis carotisligation (PCL) kirurgi

BEMÆRK: Delvis halspulsåreligation af LCA blev udført som tidligere beskrevet og demonstreret³.

1. Anæstetik musen ved indånding af isofluran (5% isofluoran i ilt til induktion og 1,5% derefter til vedligeholdelse) under hele proceduren ved hjælp af en bedøvelsesfordamper. Placer musen liggende på en Deltaphase isotermisk pude for at forhindre tab af kropsvarme under operationen.
2. Påfør en okulær salve for at forhindre eksponering keratitis, og bekræft dybden af anæstesi ved fravær af tåspidsrespons.
3. Injicer buprenorphin 0,05 mg/kg subkutant for at håndtere smerter forebyggende. Desinficer det epilerede område ved påføring og rengøring med betadin og isopropanolopløsning tre gange. Sørg for, at betadin er det sidste trin til at sterilisere operationsområdet, startende fra midten og slutter ved siderne.
4. Brug aseptiske teknikker til at lave et ventralt midterlinjesnit (~ 1 cm) i nakkeområdet og udsætte LCA-grenpunktet ved stump dissektion.
5. Læg den venstre indre carotis, ekstern carotis og occipital arterier med 6-0 silke sutur; Lad den overlegne skjoldbruskkirtelarterie være uberørt.
6. Tilnærm huden og luk snittet med vævslim og/eller suturer.
7. Overfør musen til et forvarmet restitutionsbur (vedligeholdt ved 37 °C), og læg den på et rent håndklæde i op til 1 time for at undgå hypotermi efter operationen.
   BEMÆRK: Efter vores erfaring er en forebyggende enkeltdosis buprenorphin (0,05 mg / kg) normalt tilstrækkelig til smertebehandling efter operationen. En gentagen dosis buprenorphin kan administreres, hvis dyret er i nød efter de første 24 timer. Hvis det udføres korrekt, er der ingen dødelighed forbundet med denne procedure, og postoperativ stress for musen er minimal. Musene returneres til deres respektive bure og overvåges dagligt efter operationen.
8. Forbered perfusionsopsætningen.
   1. Brug 0,9% NaCl (normal saltvand) indeholdende 10 U / ml heparin i en IV-pose. Krog IV-posen 244-274 cm (8-9 fod) fra jorden eller ca. 122-152 cm (4-5 fod) højere end dissektionsbrættet. Fastgør sommerfuglnålen til enden af saltvandslinjen, og skyl eventuelle luftbobler ud af IV-linjen.

2. Isolering af halspulsårer efter ofring

1. Ofr musene ved CO₂ -indånding efter den institutionelle IACUC-protokol.
2. Spray 70% ethanol på musehuden og læg den i liggende stilling på dissektionspladen, der indeholder adsorbentpapirhåndklæder. Fastgør musens poter til adsorbenthåndklæderne på dissektionsbrættet ved hjælp af tape eller en 21 G nål.
3. Brug en steril saks til at fjerne musens hud fra maven og helt til toppen af brystkassen.
4. Brug en saks til at åbne bugvæggen under brystkassen ved stump dissektion.
5. Brug saksen til forsigtigt at lave et snit langs membranens længde og fortsætte gennem ribbenene på begge sider af brystkassen, indtil brystbenet kan løftes væk. Løft forsigtigt brystbenet væk med et par tang; Fjern derefter brystkassen for at udsætte hjertet.
6. Fjern forsigtigt thymus og eventuelt bindevæv over hjertet for at visualisere de store kar.
7. Skær vena cava med en saks for at lade blodet komme ud af lukket cirkulation.
8. Indsæt en 21 G sommerfuglnål, der er forbundet til IV-linjen gennem hjertets spids, i venstre ventrikel og lad retrograd perfusion i 2-3 minutter med normal saltvand ved stuetemperatur. Sørg for, at en konstant strømningshastighed for normal saltvand opretholdes ved at holde saltvandsposen i højden 8-9 fod fra jorden.
   BEMÆRK: Lungerne og leveren bliver blege, hvilket indikerer optimal perfusion. Der anvendes ca. 20 ml perfusionsbuffer til hver mus.
9. Fjern huden fra nakkeområdet og fjern alt fedt, muskler og bindevæv for at udsætte halspulsårerne (figur 1A).
   BEMÆRK: Resten af proceduren udføres under dissekeringsmikroskopet.
10. Juster synsfeltet for at finde ligeringsstederne. Brug 10 mm mikrodissektionsaksen til at lave et lille snit under ligeringsstedet i LCA for at tillade perfusion.
11. Perfuse igen i yderligere 1 minut via venstre ventrikel og sørg for, at LCA er godt perfunderet og fri for synlige spor af blod.
12. Brug finspidset tang og en lille fjedersaks til forsigtigt at fjerne det peri-adventitære væv omkring carotis, mens carotis er fastgjort til kroppen.
    BEMÆRK: Vær yderst forsigtig med ikke at klemme eller strække halspulsårerne under dette rengøringstrin, da dette kan øge antallet af ikke-levedygtige celler. Hvis det udføres korrekt, er cellelevedygtigheden i den endelige cellesuspension normalt >93%.

3. Endotelcelleberiget enkeltcelleisolering fra mus carotider

BEMÆRK: De nedenfor beskrevne reagenser kan fremstilles på forhånd og opbevares ved 4 °C indtil brug: 1x og 0,1x enkeltkernelysisbuffere med de reagenser, der er anført i tabel 1; enkeltkerne vaskebuffer med de reagenser, der er anført i tabel 1 enkeltkernebufferopskrift med reagenserne anført i tabel 1. Arbejdslagrene for disse stødpuder skal udarbejdes i overensstemmelse med fabrikantens protokol. Nedbrydningsbuffersammensætning: Kollagenase type II 600 U/ml og DNase I 60 E/ml i 0,5% føtalt bovint serum (FBS)-indeholdende phosphatbufferet saltvand (PBS).

1. Mens carotiderne stadig er fastgjort, vask ydersiden af halspulsårerne med normal saltopløsning for at skylle spor af blod væk.
2. Brug en insulinsprøjte udstyret med en 29 G nål til at injicere ~ 50 μL af fordøjelsesbufferen i lumen i den distale ende af venstre halspulsåre. Når fordøjelsesbufferen begynder at fylde halspulsåren, klemmes den proksimale ende af halsbåndet med et mikroklip (figur 1B). Indfør yderligere 15-20 μL fordøjelsesbuffer i lumen og klip den distale ende for at undgå frigivelse af fordøjelsesbufferen.
3. Carotisarterierne udplantes forsigtigt fra musen (figur 1B,C) og anbringes i 35 mm skåle, der indeholder varm (ved 37 °C) Hepes-bufferet saltopløsning.
   BEMÆRK: Sørg for, at begge klemmer er placeret sikkert. Hvis klemmen løsner sig, kan fordøjelsesopløsningen lække ud af lumen og påvirke det opnåede celletal. Hvis dette sker, tilsættes yderligere enzymatisk opløsning ved hjælp af en insulinsprøjte udstyret med en 29 G nål fra den åbne ende af halsbåndet og fastgør klemmen igen (figur 1D). Hvis enzymbufferopløsningen lækker igen, er det sandsynligt, at carotis afskæres under eksplantationsprocessen. I dette tilfælde kasseres carotis og udelukker prøven fra undersøgelsen. Gentagen grov håndtering af carotis vil nedsætte cellelevedygtigheden og kvaliteten af enkeltcellepræparatet. Pas på at identificere og korrekt mærke venstre og højre halspulsårer.
4. Inkuber de udplantede carotider i 45 minutter ved 37 °C med intermitterende gyngen.

4. Skylning af halspulsårerne

1. Efter afslutningen af den luminale enzymatiske fordøjelse fjernes halspulsåren sammen med klemmerne fra 35 mm skålen. Fjern forsigtigt hver klemme, og pas på, at fordøjelsesbufferen ikke lækker.
2. Hold forsigtigt den ene ende af halspulsåren med fine tang oven på et 1,5 ml mikrocentrifugerør. En 29 G-nål med en insulinsprøjte indeholdende 100 μL varm fordøjelsesbuffer (37 °C) indsættes i lumen med den anden hånd (figur 1D).
3. Skyl hurtigt lumen i carotis ind i mikrocentrifugerøret. Bloker den enzymatiske reaktion ved at tilsætte 0,3 ml FBS i 1,5 ml røret. Placer røret på is.
   BEMÆRK: Skylningen indeholder cellerne fra den lysende enzymatiske fordøjelse. Tilføjelse af FBS og reduktion af temperaturen stopper den enzymatiske fordøjelsesproces. Hvis antallet af celler i præparatet er højt og indeholder snavs eller fedtvæv, anbefales det stærkt at bruge en 50 eller 70 μm cellesi til at filtrere uønsket vævsaffald. For at øge antallet af enkeltceller anbefales skylning af flere carotider. Her, for at opnå mindst 5.000 celler, blev 10-12 carotider skyllet og samlet som en prøve.
4. Cellerne centrifugeres ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C ved hjælp af en centrifuge udstyret med en rotor med fast vinkel (se materialetabellen).
5. Supernatanten kasseres, og cellepelleten gensuspenderes i fordøjelsesbufferen indeholdende celledissociationsreagens (se materialetabellen) i 5 minutter ved 37 °C for at adskille alle cellerne i enkeltceller.
   BEMÆRK: Hvis antallet af celler i præparatet er lavt, øges centrifugehastigheden op til 2.000-3.000 × g for at dreje cellerne ned. Desuden letter brugen af 0,5 ml centrifugerør bedre visualisering af cellepelleten i bunden af røret.
6. Bloker den enzymatiske reaktion ved at tilføje 0,15 ml FBS i 0,5 ml røret.
7. Enkeltcellesuspensionen centrifugeres ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C ved hjælp af en centrifuge udstyret med en fastvinklet rotor, som i trin 4.4.
8. Supernatanten kasseres, og cellerne gensuspenderes i 100 μL iskold 1% bovin serumalbumin (BSA)-opløsning i PBS i et 0,2 ml mikrocentrifugerør.
   BEMÆRK: Brug af 0,2 ml centrifugerør forbedrer visualiseringen af enkeltcellepelleten i bunden af røret.

5. Enkeltcelle- og enkeltkerneanalyser

1. Resuspender og indsend enkeltcellepræparatet til scRNAseq.
   1. Enkeltcellepelleten gensuspenderes med 100 μL iskold 1% BSA i PBS i et 0,2 ml rør.
   2. Efter at have resurate cellerne til enkeltcelleindkapsling, fortsæt straks til enkeltcelleindkapsling og stregkodning ved hjælp af et mikrofluidikbaseret enkeltcellepartitionerings- og stregkodningssystem (se materialetabellen).
   3. Inden prøverne indsendes til Genomics Core, skal du tælle og inspicere enkeltcellepræparaterne; sikre fraværet af celleaggregater.
      BEMÆRK: Aggregeringen af enkeltceller kan minimeres yderligere ved at øge BSA-mængden op til 2%.
2. Resuspender og indsend enkeltcellepræparatet til scATACseq.
   1. Cellepelleten resuspenderes i 100 μL af 0,04 % BSA i iskold 1x PBS, og enkeltcellesuspensionen centrifugeres ved 500 × g ved 4 °C.
   2. Lysér enkeltcellesuspensionen med iskold 0,1x lysisbuffer (tabel 1) og inkuber i 5 minutter på is.
   3. Bland lysatet 10 gange med en P-20 pipette og inkuber i yderligere 10 minutter.
   4. Der tilsættes 500 μL kølebuffer (tabel 1) til de lyserede celler og blandes 5 gange med en pipette.
      BEMÆRK: Brug en 70 μm cellesi til at filtrere snavs fra cellesuspensionen og overføre dem til et 2 ml rør.
   5. Lysatet centrifugeres ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og kernepelleten gensuspenderes i den fortyndede kernebuffer (150 μL) (se materialetabellen og tabel 1). Tæl og inspicer enkeltkernepræparaterne ved hjælp af et hæmocytometer¹¹.
   6. Indsend enkeltkerneprøven til Genomics Core til transponering af enkeltkerner, kernepartitionering, biblioteksforberedelse og sekventering.
      BEMÆRK: Hvis det oprindelige cellenummer er lavt, er det almindeligt at observere snavs langs kernerne. Derfor anbefales det at starte med et højt cellenummer.

Representative Results

Delvise carotis-ligationsoperationer blev udført på 44 mus, og begyndelsen af d-flow i LCA blev valideret ved at udføre ultralyd en dag efter delvis ligeringsoperation. Vellykket delvis ligeringskirurgi forårsager nedsat blodgennemstrømningshastighed og vender blodgennemstrømningen (forstyrret flow) i LCA³. Halspulsårerne blev dissekeret enten to dage eller to uger efter ligering. Lumen i hver carotis blev udsat for kollagenasefordøjelse, og endotelberigede enkeltceller eller enkeltkernesuspensioner blev fremstillet. Enkeltcellesuspensioner blev samlet fra 10 RCA'er og LCA'er for at øge celleudbyttet. De forberedte celler/kerner blev efterfølgende stregkodet og sekventeret. For sc-RNAseq-undersøgelsen var antallet af opnåede enkeltceller ~ 9.700. Fordelingen af celler fra 4 prøver fremgår af tabel 2.

Ligeledes blev enkeltceller isoleret fra 12 RCA'er og LCA'er, der blev forberedt, udsat for transposasebehandling, stregkodet og sekventeret til scATACse-undersøgelsen. Sekventering blev udført for 18.324 enkeltkerner, som blev samlet fra 1.291 (2-dages RCA [2D-R]), 5.351 (2-dages LCA [2D-L]), 5.826 (2-ugers RCA [2W-R]) og 5.856 (2-ugers LCA [2W-L]) (tabel 2). Repræsentative enkeltcelle- og enkeltkernepræparater som visualiseret ved brightfieldmikroskopi og fasekontrastmikroskopi er vist i figur 2A,B. Effektiviteten af enkeltkernepræparat fra encellet suspension er vist i figur 2C.

Kernerne (~ 7.000 hver) fra 2D (RCA'er og LCA'er) og 2W (RCA'er og LCA'er) prøver blev inkuberet med en Transposition Mix (Tn5 transposase enzym og buffer) se materialetabellen) i 60 minutter ved 37 ° C efter producentens protokol. Baseret på producentens anbefaling hjalp en mild vaskemiddeltilstand med at holde kernerne intakte under tagmentation. En masterblanding, der består af et stregkodningsreagens, reduktionsmiddel B og stregkodningsenzym, blev derefter lagt på en mikrofluidisk celle / kerneindkapslingsplatform for at fremstille enkeltkernede gelemulsioner med stregkodning i henhold til producentens anvisninger.

Efter sekventering blev Cell Ranger Single-Cell Software-pakken brugt til demultiplexing, stregkodebehandlingsjustering og indledende klyngedannelse af de rå scATACseq- og scRNaseq-profiler. For scRNAseq-undersøgelsen er fordelingen af gener pr. celle, unik molekylær identifikator (UMI) pr. celle, mitokondrielæsninger pr. celle og sekventeringsmætningsinformation vist i figur 3A-C. Ligeledes for scATACseq-undersøgelsen er kvalitetskontrolmålinger, der viser skærstørrelsesfordelingen (nukleosombåndmønster) og normaliseret TSS-berigelsesscore, vist i figur 3D-F. Derudover er procentfragmentet læst i toppe, topregionsfragmenter, TSS-berigelsesscore, forholdet mellem læsninger i sortlistegenomiske steder og nukleosomsignalforhold vist i figur 3G-K.

Endotelberigelse blev kvantificeret ved at sammenligne denne metode med enzymatisk fordøjelse af hele halspulsåren¹². Endotelcelletallet fra den komplette carotisarteriefordøjelse var 3-5% af de samlede celler, der blev opnået, mens denne metode tillod berigelse af endotelceller til >50% ⁸. Tilsvarende viste en anden enkeltcelleundersøgelse, der brugte hele musens aorta, at endotelfraktionen var <7% af det samlede celletal. For en dybdegående enkeltcellet RNAseq- og enkeltcelle ATACseq-analyse anmodes læserne om at henvise til ⁸.

Figur 1: Isolering af halspulsårer til enkeltcellepræparat. (A) Anatomisk syn på halspulsårerne hos mus. Røde pile og indsats viser den isolerede venstre halspulsåre efter oprydning af perientielt fedt. For en skematisk oversigt over carotisanatomien og ligeringer henvises til figur 1 i Nam et al³ (B) Billedet viser placeringen af mikroklip efter fyldning af halspulsåren med fordøjelsesbufferen. (C) Explantet halspulsåre indeholdende fordøjelsesbuffer. Skala: afstand mellem sorte linjer = 1 mm. (D) En 29 G nål i lumen i musens halspulsåre. Dette trin hjælper med at genopbygge halspulsåren med fordøjelsesbuffer, hvis det er nødvendigt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Enkeltcelle- og enkeltkernepræparat fra luminal enzymatisk fordøjelse af musens halspulsåre . (A) Repræsentative enkeltcelle- og enkeltkernepræparater. Skalabjælker = 0,25 mm (B) Repræsentativ fasekontrast og Gel-Red billeder af enkeltkerner preps. Skalabjælker = 0,25 mm. (C) Effektiviteten af enkeltkerneforberedelse i venstre kolonne viser antallet af enkeltceller i starten, mens højre kolonne viser antallet af enkeltkerner efter behandling med kerneisoleringsbuffer i forskellige trin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Standard QC-målinger for scRNAseq- og scATACseq-undersøgelsen. Violinplots viser (A) fordelingen af gener pr. celle (nFeature RNA), (B) UMI pr. celle (nCount_RNA), (C) mitokondrieaflæsninger pr. celle (procent mt) for scRNAseq-dataene. (D og E) viser nukleosombåndsmønsteret for scATACseq-undersøgelsen. Histogrammet af DNA-fragmentstørrelser udviser et stærkt nukleosombåndmønster svarende til længden af DNA viklet rundt om et enkelt nukleosom. (F) Normaliseret TSS-berigelsesscore på hver position i forhold til TSS. Scatter/violin-plottene viser (G) procentvise fragmentlæsninger i toppe, et mål for sekventeringsdybde, (H) topregionsfragmenter, der viser antallet af fragmenter, der overlapper toppe, (I) TSS-berigelsesscore, et forhold mellem den samlede fordeling af læsninger centreret om TSS'er og det, der flankerer det tilsvarende TSS, (J) sortlisteforhold, et forhold mellem læsninger i sortlistegenomiske steder, og (K) nukleosomsignal, et forhold mellem mononukleosomale og nukleosomfrie fragmenter. Forkortelser: scRNAseq = enkeltcellet RNA-sekventering; scATACseq = enkeltcelleassay til transposase tilgængelig kromatinsekventering; QC = kvalitetskontrol; UMI = unik molekylær identifikator; TSS = transkription startsted. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sammensætning af enkeltkernelysis og vaskebuffere. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Enkeltcelle- og enkeltkernetal fra musens carotisarterieluminale fordøjelse. Tabellen viser også middellæsninger/celle og antal gener/celle for scRNAseq-data. For scATACseq-dataene vises gennemsnitlige fragmenter/celle og samlede aflæsninger opnået pr. prøve⁸. Forkortelser: scRNAseq = enkeltcellet RNA-sekventering; scATACseq = enkeltcelleassay til transposase tilgængelig kromatinsekventering; 2D = 2-dages; 2W = 2-ugers; R/RCA = højre halspulsåre; L/LCA = venstre halspulsåre. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Dette papir giver en detaljeret protokol til isolering af enkeltcellepræparater fra musens halspulsårer. Indflydelsen af d-flow på endotelcellerne kan undersøges nøjagtigt, hvis PCL-operationen udføres korrekt. Det er afgørende at korrekt identificere grene af den fælles carotis, såsom den ydre carotis, indre carotis, occipital arterie og overlegen skjoldbruskkirtelarterie. Validering af strømningsmønstre ved ultrasonografi validerer yderligere den vellykkede begyndelse af d-flowforhold . Selvom PCL-kirurgi kan udføres på mus uanset deres alder, er den foretrukne alder 10 ± 2 uger. Ældre mus og mus med hyperkolesterolemisk baggrund har generelt en tendens til at have mere perientitielt fedt og stivere hud.

Det er vigtigt omhyggeligt at dissekere carotisarterien endotelberigede enkeltcellepræparater fri for det omgivende væv og perientitialt fedt. Carotidernes lumen skal gennemsyres grundigt for at undgå at forurene blodlegemer i enkeltcellepræparaterne. Forkert vævsidentifikation og mærkning kan resultere i høj standardafvigelse. Omhyggelig planlægning og tidsstyring er påkrævet for denne protokol. En dygtig kirurg og operatør kan tage 15-20 minutter at udføre en PCL-operation. Ofring, carotisisolering og lysende enzymatisk fordøjelse fra hver mus ville tage yderligere 35-40 minutter. Den praktiske behandlingstid fra endotelcelleskylning til enkeltcelle / enkeltkerneforberedelse er yderligere 2 timer. Omhyggelig planlægning og teamwork anbefales stærkt.

Som med enhver eksperimentel protokol bør nogle ulemper og begrænsninger overvejes. Den nuværende protokol indeholder ikke trin til at undgå artefaktuel aktivering af øjeblikkelig tidlig reaktion under luminalvævsdissociationen. Det er blevet rapporteret i litteraturen, at enzymatisk fordøjelse kan føre til stresssignaleringshændelser, såsom betændelse og apoptose. Dette kan løses ved at indarbejde passende kontrolgrupper i forsøgsdesignet. Derudover bør våde laboratoriemetoder, der kan minimere den artefaktuelle aktivering af øjeblikkelig respons under enzymatisk fordøjelse, såsom koldaktive proteaser, betragtes som^13,14.

Denne protokol kan bruges til enhver musestamme uanset dens genetiske baggrund. De endotelberigede præparater kan dog bedst besvare forskningsspørgsmål vedrørende ændringerne i endotel og er derfor velegnede til EF-specifikke knockouts og EC-specifikke transgene mus. Denne enkeltcelleisoleringsmetode kan tilpasses til at udføre enkeltcellede multi-omics-undersøgelser og andre flowcytometribaserede assays såsom Imaging Flow Cytometry. Den luminale fordøjelsesmetode kan anvendes til friskopkøbte museaortas, arterier fra store dyr (kaniner og svin) samt til friskopkøbte humane vaskulære eksplanter. Samlet set ville denne metode give os mulighed for fuldt ud at forstå den præcise rolle, som blodgennemstrømningen spiller for endotelfunktionen og omprogrammering ved en enkeltcelleopløsning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac