Isolatie van endotheelcellen uit het lumen van muisslagaders voor eencellige multi-omics-experimenten

Summary

We presenteren een methode voor het isoleren van endotheelcellen en kernen uit het lumen van muiscarotisslagaders die zijn blootgesteld aan stabiele of verstoorde stroomomstandigheden om eencellige omics-experimenten uit te voeren.

Abstract

Atherosclerose is een ontstekingsziekte van de arteriële gebieden die worden blootgesteld aan een verstoorde bloedstroom (d-flow). D-flow reguleert de expressie van genen in het endotheel op transcriptomisch en epigenomisch niveau, wat resulteert in proatherogene responsen. Onlangs werden single-cell RNA sequencing (scRNAseq) en single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies uitgevoerd om de transcriptomische en chromatine toegankelijkheidsveranderingen te bepalen bij een single-cell resolutie met behulp van het muis partiële carotis ligatie (PCL) model. Aangezien endotheelcellen (EC's) een klein deel van de totale celpopulaties in de slagaderwand vertegenwoordigen, werd een luminale verteringsmethode gebruikt om EC-verrijkte eencellige preparaten te verkrijgen. Voor deze studie werden muizen onderworpen aan PCL-chirurgie om d-flow in de linker halsslagader (LCA) te induceren terwijl de rechter halsslagader (RCA) als controle werd gebruikt. De halsslagaders werden twee dagen of twee weken na de PCL-operatie ontleed. Het lumen van elke halsslagader werd onderworpen aan collagenasevertering en endotheelverrijkte enkele cellen of enkele kernen werden verkregen. Deze eencellige en eenkernige preparaten werden vervolgens gecodeerd met behulp van een 10x Genomics microfluïdische opstelling. De single-cells en single-nuclei met streepjescode werden vervolgens gebruikt voor RNA-voorbereiding, bibliotheekgeneratie en sequencing op een HIGH-throughput DNA-sequencer. Na de verwerking van bioinformatica identificeerden de datasets scRNAseq en scATACseq verschillende celtypen uit de luminale vertering, voornamelijk bestaande uit EC's. Gladde spiercellen, fibroblasten en immuuncellen waren ook aanwezig. Deze EC-verrijkingsmethode hielp bij het begrijpen van het effect van de bloedstroom op het endotheel, wat moeilijk had kunnen zijn met de totale slagaderverteringsmethode. De EC-verrijkte eencellige bereidingsmethode kan worden gebruikt om eencellige omics-studies uit te voeren bij EC-knock-outs en transgene muizen waarbij het effect van de bloedstroom op deze genen niet is bestudeerd. Belangrijk is dat deze techniek kan worden aangepast om EC-verrijkte enkele cellen te isoleren van menselijke arterie-explantaten om vergelijkbare mechanistische studies uit te voeren.

Introduction

Dit laboratorium toonde eerder aan dat inductie van d-flow leidt tot snelle en robuuste atheroscleroseontwikkeling bij hyperlipidemische muizen ^1,2. Het nieuwe muismodel van d-flow-geïnduceerde atherosclerose was mogelijk met behulp van partiële carotisligatie (PCL) chirurgie ³. PCL-chirurgie induceert een lage en oscillerende bloedstroomconditie of d-flow in de ligatie linker halsslagader (LCA). Daarentegen blijft de contralaterale rechter halsslagader (RCA) te maken hebben met een stabiele laminaire stroming (s-flow). Om het effect van d-flow op endotheelcellen te begrijpen, werden de halsslagaders eerder na een gedeeltelijke ligatieoperatie ontleed en gespoeld met een op fenol en guanidine isothiocyanaat gebaseerd lysingmiddel (luminale RNA / DNA-spoelmethode)^2,4, die endotheelverrijkte "gepoolde bulk" RNA's of DNA's leverden. Deze gepoolde bulk-RNA's of DNA's werden vervolgens verwerkt voor transcriptomische studies of epigenomische DNA-methyloomstudies, respectievelijk ^4,5,6. Deze studies hielpen bij het ontdekken van meerdere stroomgevoelige genen en microRNA's waarvan de rol in endotheelbiologie en atherosclerose uitgebreid werd onderzocht ^4,6,7.

Ondanks endotheelverrijking konden deze bulk RNA/ DNA-studies echter niet de specifieke rol van elk celtype in de slagaderwand onderscheiden bij d-flow-geïnduceerde atherosclerose. Endotheelverrijkte eencellige (sc) isolatie en scRNA- en scATAC-sequencingstudies werden uitgevoerd om deze beperking te overwinnen⁸. Hiervoor werden C57Bl6-muizen onderworpen aan de PCL-operatie om d-flow in de LCA te induceren terwijl de s-flow-blootgestelde RCA als controle werd gebruikt. Twee dagen of twee weken na de PCL-operatie werden de muizen geofferd en werden de halsslagaders ontleed en opgeruimd. Het lumen van zowel LCA's als RCA's werd doordrenkt met collagenase en de luminale collagenase-digesten die EC's bevatten als een significante fractie en andere arteriële cellen werden verzameld. De single-cell suspension (scRNAseq) of single-nuclei suspensie (scATACseq) werden voorbereid en voorzien van barcodes met unieke identifiers voor elke cel of kern met behulp van een 10x Genomics setup. De RNA's werden onderworpen aan cDNA-bibliotheekvoorbereiding en gesequenced.

De scRNAseq en scATACseq datasets werden verwerkt met behulp van de Cell Ranger Single-Cell Software en verder geanalyseerd door Seurat en Signac R pakketten ^9,10. Elke cel en kern kreeg een celtype toegewezen uit deze analyses en geclusterd in het celtype op basis van de markergenen en unieke genexpressiepatronen. De resultaten van de scRNAseq en scATACseq toonden aan dat deze eencellige preparaten verrijkt zijn met EC's en ook gladde spiercellen (SMC's), fibroblasten en immuuncellen bevatten.

Verdere analyse toonde aan dat de EG-populatie in de luminale vertering zeer divergent en plastisch is (8 verschillende EC-clusters) en reageert op de bloedstroom. Het belangrijkste is dat deze resultaten aantoonden dat d-flow EC's herprogrammeert van een athero-beschermd ontstekingsremmend fenotype naar pro-atherogene fenotypen, waaronder pro-inflammatoire, endotheel-naar-mesenchymale overgang, endotheelstam / voorlopercelovergang en het meest verrassend, endotheel-naar-immuuncelachtige overgang. Bovendien onthullen scATACseq-gegevens nieuwe stroomafhankelijke chromatinetoegankelijkheidsveranderingen en transcriptiefactorbindingsplaatsen op een genoombrede manier, die de basis vormen van verschillende nieuwe hypothesen. De methodologie en het protocol voor het voorbereiden van enkelvoudige endotheelcellen voor eencellige multi-omics-studies van de muiscarotisslagaders worden hieronder beschreven.

Protocol

Alle hieronder beschreven dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Emory University. Niet-hypercholesterolemische, leeftijds- en geslachtsgematchte C57BL/6-muizen werden gebruikt om geslachtsafhankelijke variatie te verminderen en eventuele complicaties van hypercholesterolemische aandoeningen te compenseren.

1. Gedeeltelijke carotisligatie (PCL) chirurgie

OPMERKING: Gedeeltelijke halsslagaderligatie van LCA werd uitgevoerd zoals eerder beschreven en aangetoond³.

1. Verdoof de muis door isofluraaninhalatie (5% isofluoraan in zuurstof voor inductie en 1,5% daarna voor onderhoud) gedurende de hele procedure met behulp van een verdovingsverdamper. Plaats de muis in rugligging op een deltafase isothermisch kussen om verlies van lichaamswarmte tijdens de operatie te voorkomen.
2. Breng een oculaire zalf aan om blootstelling aan keratitis te voorkomen en bevestig de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van een teenknijprespons.
3. Injecteer buprenorfine 0,05 mg/kg subcutaan om pijn preventief te beheersen. Desinfecteer het geëmuleerde gebied door drie keer aan te brengen en te reinigen met betadine en isopropanoloplossing. Zorg ervoor dat betadine de laatste stap is om het operatiegebied te steriliseren, beginnend bij het midden en eindigend aan de zijkanten.
4. Maak met behulp van aseptische technieken een ventrale middenlijnincisie (~ 1 cm) in het nekgebied en stel het LCA-vertakkingspunt bloot door stompe dissectie.
5. Ligate de linker interne halsslagader, externe carotis en occipitale slagaders met 6-0 zijde hechting; laat de superieure schildklierslagader onaangeroerd.
6. Benader de huid en sluit de incisie met weefsellijm en/of hechtingen.
7. Breng de muis over naar een voorverwarmde herstelkooi (gehandhaafd op 37 °C) en plaats hem op een schone handdoek gedurende maximaal 1 uur om onderkoeling na de operatie te voorkomen.
   OPMERKING: In onze ervaring is een preventieve enkele dosis Buprenorfine (0,05 mg / kg) meestal voldoende voor pijnbestrijding na de operatie. Een herhaalde dosis Buprenorfine kan worden toegediend als het dier na de eerste 24 uur in nood verkeert. Indien correct uitgevoerd, is er geen mortaliteit geassocieerd met deze procedure en is postoperatieve stress voor de muis minimaal. De muizen worden teruggebracht naar hun respectievelijke kooien en dagelijks gecontroleerd na de operatie.
8. Bereid de perfusie-instelling voor.
   1. Gebruik 0,9% NaCl (normale zoutoplossing) met 10 U/ml heparine in een infuuszak. Haak de infuuszak 244-274 cm (8-9 voet) vanaf de grond of ongeveer 122-152 cm (4-5 voet) hoger dan de snijplank. Bevestig de vlindernaald aan het einde van de zoutoplossing en spoel eventuele luchtbellen uit de infuuslijn.

2. Isolatie van halsslagaders na opoffering

1. Offer de muizen op door CO 2-inademing volgens het institutionele IACUC-protocol.
2. Spuit 70% ethanol op de huid van de muis en plaats deze in rugligging op de snijplank met adsorberende papieren handdoeken. Bevestig de poten van de muis aan de adsorberende handdoeken op het snijplank met plakband of een naald van 21 G.
3. Verwijder met een steriele schaar de huid van de muis vanaf de buik en helemaal tot aan de bovenkant van de thorax.
4. Gebruik een schaar om de buikwand onder de ribbenkast te openen door stompe dissectie.
5. Maak met behulp van de schaar voorzichtig een incisie langs de lengte van het diafragma en ga door de ribben aan beide zijden van de thorax totdat het borstbeen kan worden weggetild. Til het borstbeen voorzichtig weg met een tang; verwijder daarna de ribbenkast om het hart bloot te leggen.
6. Verwijder voorzichtig de thymus en eventueel bindweefsel over het hart om de belangrijkste bloedvaten te visualiseren.
7. Knip de vena cava af met een schaar om bloed uit de gesloten circulatie te laten ontsnappen.
8. Steek een vlindernaald van 21 G verbonden met de IV-lijn door de top van het hart in de linker ventrikel en laat retrograde perfusie gedurende 2-3 minuten met normale zoutoplossing bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat een constante stroomsnelheid van normale zoutoplossing wordt gehandhaafd door de zoutzak op een hoogte van 8-9 voet van de grond te houden.
   OPMERKING: De longen en lever worden bleek, wat wijst op een optimale perfusie. Voor elke muis wordt ongeveer 20 ml perfusiebuffer gebruikt.
9. Verwijder de huid uit het nekgebied en verwijder alle vet, spieren en bindweefsels om de halsslagaders bloot te leggen (figuur 1A).
   OPMERKING: De rest van de procedure wordt uitgevoerd onder de ontleedmicroscoop.
10. Pas het gezichtsveld aan om de ligatieplaatsen te lokaliseren. Maak met behulp van de 10 mm microdissectieschaar een kleine incisie onder de ligatieplaats in de LCA om perfusie mogelijk te maken.
11. Perfuseer opnieuw gedurende nog eens 1 min via de linker ventrikel en zorg ervoor dat de LCA goed doordrenkt is en vrij van zichtbare bloedsporen.
12. Gebruik een fijne tiptang en een kleine veerschaar om de peri-adventitiale weefsels rond de halsslagader voorzichtig te verwijderen terwijl de halsslagader aan het lichaam is bevestigd.
    OPMERKING: Wees uiterst voorzichtig om de halsslagaders niet te knijpen of uit te rekken tijdens deze reinigingsstap, omdat dit het aantal niet-levensvatbare cellen kan verhogen. Indien correct uitgevoerd, is de levensvatbaarheid van de cel in de uiteindelijke celsuspensie meestal >93%.

3. Endotheel-cel-verrijkte eencellige isolatie van muizencarotiden

OPMERKING: De hieronder beschreven reagentia kunnen van tevoren worden bereid en tot gebruik bij 4 °C worden bewaard: 1x en 0,1x single-nuclei lysis buffers met de in tabel 1 vermelde reagentia; wasbuffer met één kern met de in tabel 1 vermelde reagentia; single-nuclei Nuclei Buffer recept met de in tabel 1 vermelde reagentia. De werkvoorraden van deze buffers moeten worden opgesteld volgens het protocol van de fabrikant. Samenstelling van de digestiebuffer: Collagenase Type II 600 U/ml en DNase I 60 U/ml in 0,5% foetaal runderserum (FBS)-bevattende fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).

1. Terwijl de halsslagaders nog steeds zijn bevestigd, wast u de buitenkant van de halsslagaders met een normale zoutoplossing om eventuele bloedsporen weg te spoelen.
2. Injecteer met behulp van een insulinespuit met een naald van 29 G ~ 50 μL van de digestiebuffer in het lumen van het distale uiteinde van de linker halsslagader. Als de digestiebuffer de halsslagader begint te vullen, klemt u het proximale uiteinde van de halsslagader vast met een microclip (figuur 1B). Breng een extra 15-20 μL digestiebuffer in het lumen en klem het distale uiteinde vast om het vrijkomen van de digestiebuffer te voorkomen.
3. Explant de halsslagaders voorzichtig uit de muis (figuur 1B,C) en plaats ze in schotels van 35 mm met warme (bij 37 °C) Hepes-gebufferde zoutoplossing.
   LET OP: Zorg ervoor dat beide klemmen goed geplaatst zijn. Als de klem losraakt, kan de verteringsoplossing uit het lumen lekken en het verkregen celgetal beïnvloeden. Als dit gebeurt, voeg dan extra enzymatische oplossing toe met behulp van een insulinespuit met een naald van 29 G vanaf het open uiteinde van de halsslagader en zet de klem opnieuw vast (figuur 1D). Als de enzymbufferoplossing opnieuw lekt, is het waarschijnlijk dat de halsslagader wordt afgebroken tijdens het explantatieproces. Gooi in dit geval de halsslagader weg en sluit het monster uit van het onderzoek. Herhaalde ruwe behandeling van de halsslagader zal de levensvatbaarheid van de cel en de kwaliteit van eencellige bereiding verminderen. Zorg ervoor dat u de linker- en rechter halsslagaders identificeert en correct labelt.
4. Incubeer de uitgeplante halsslagaders gedurende 45 minuten bij 37 °C met intermitterend schommelen.

4. Spoelen van de halsslagaders

1. Verwijder na het voltooien van de luminale enzymatische spijsvertering de halsslagader samen met de klemmen uit de schaal van 35 mm. Verwijder zorgvuldig elke klem en zorg ervoor dat de digestiebuffer niet lekt.
2. Houd het ene uiteinde van de halsslagader voorzichtig met een fijne tang op een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Steek met de andere hand een naald van 29 G met een insulinespuit met 100 μL warme verteringsbuffer (37 °C) in het lumen (figuur 1D).
3. Spoel het lumen van de halsslagader snel in de microcentrifugebuis. Blokkeer de enzymatische reactie door 0,3 ml FBS toe te voegen aan de buis van 1,5 ml. Plaats de tube op ijs.
   OPMERKING: Het blozen bevat de cellen van de luminale enzymatische spijsvertering. Het toevoegen van FBS en het verlagen van de temperatuur stopt het enzymatische verteringsproces. Als het aantal cellen in het preparaat hoog is en puin of vetweefsel bevat, wordt het gebruik van een celzeef van 50 of 70 μm ten zeerste aanbevolen om ongewenst weefselafval te filteren. Om het aantal één cellen te verhogen, wordt het spoelen van meerdere halsslagaders aanbevolen. Hier, om ten minste 5.000 cellen te verkrijgen, werden 10-12 halsslagaders gespoeld en samengevoegd als één monster.
4. Centrifugeer de cellen bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van een centrifuge die is uitgerust met een rotor met vaste hoek (zie de tabel met materialen).
5. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellet in de digestiebuffer met celdissociatiereagens (zie de materiaaltabel) gedurende 5 minuten bij 37 °C om alle cellen in afzonderlijke cellen te scheiden.
   OPMERKING: Als het aantal cellen in het preparaat laag is, verhoogt u de centrifugesnelheid tot 2.000-3.000 × g om de cellen te laten draaien. Bovendien vergemakkelijkt het gebruik van centrifugebuizen van 0,5 ml een betere visualisatie van de celpellet aan de onderkant van de buis.
6. Blokkeer de enzymatische reactie door 0,15 ml FBS toe te voegen aan de buis van 0,5 ml.
7. Centrifugeer de eencellige suspensie bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van een centrifuge met een rotor onder vaste hoek, zoals in stap 4.4.
8. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen in 100 μL ijskoude 1% runderserum albumine (BSA) oplossing in PBS in een microcentrifugebuis van 0,2 ml.
   OPMERKING: Het gebruik van centrifugebuizen van 0,2 ml verbetert de visualisatie van de eencellige pellet op de bodem van de buis.

5. Eencellige en eenkernige analyses

1. Resuspend en dien het eencellige preparaat in voor scRNAseq.
   1. Resuspendeer de eencellige pellet met 100 μL ijskoude 1% BSA in PBS in een buis van 0,2 ml.
   2. Nadat de cellen zijn geresuspendeerd voor inkapseling met één cel, gaat u onmiddellijk over tot inkapseling en barcodering met behulp van een op microfluïdica gebaseerd eencellig partitionerings- en barcoderingssysteem (zie de tabel met materialen).
   3. Voordat u de monsters naar de Genomics Core verzendt, telt en inspecteert u de eencellige preparaten; zorgen voor de afwezigheid van celaggregaten.
      OPMERKING: De aggregatie van afzonderlijke cellen kan verder worden geminimaliseerd door het BSA-bedrag tot 2% te verhogen.
2. Resuspendeer en dien het eencellige preparaat voor scATACseq in.
   1. Resuspendeer de celpellet in 100 μL van 0,04% BSA in ijskoude 1x PBS en centrifugeer de eencellige suspensie bij 500 × g bij 4 °C.
   2. Lyseer de eencellige suspensie met ijskoude 0,1x lysisbuffer (tabel 1) en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
   3. Meng het lysaat 10 keer met een P-20 pipet en incubeer nog eens 10 minuten.
   4. Voeg 500 μL gekoelde wasbuffer (tabel 1) toe aan de gelyseerde cellen en meng 5 keer met een pipet.
      OPMERKING: Gebruik een celzeef van 70 μm om vuil uit de celsuspensie te filteren en over te brengen in een buis van 2 ml.
   5. Centrifugeer het lysaat bij 500 × g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de kernen-pellet in de verdunde kernenbuffer (150 μL) (zie de tabel met materialen en tabel 1). Tel en inspecteer de preparaten met één kern met behulp van een hemocytometer¹¹.
   6. Dien het single-nuclei-monster in bij de Genomics Core voor single-nuclei-transpositie, nuclei-partitionering, bibliotheekvoorbereiding en sequencing.
      OPMERKING: Als het initiële celnummer laag is, is het gebruikelijk om puin langs de kernen te observeren. Daarom is het aan te raden om te beginnen met een hoog celgetal.

Representative Results

Gedeeltelijke carotisligatieoperaties werden uitgevoerd op 44 muizen en het begin van d-flow in de LCA werd gevalideerd door echografie uit te voeren een dag na gedeeltelijke ligatiechirurgie. Succesvolle gedeeltelijke ligatiechirurgie veroorzaakt een verminderde bloedstroomsnelheid en keert de bloedstroom (verstoorde stroom) in de LCA³ om. De halsslagaders werden ontleden na twee dagen of twee weken na ligatie. Het lumen van elke halsslagader werd onderworpen aan collagenasevertering en endotheelverrijkte suspensies met één cel of één kern werden bereid. Eencellige suspensies werden samengevoegd van 10 RCA's en LCA's om de celopbrengst te verhogen. De cellen/kernen die werden bereid, werden vervolgens voorzien van een streepjescode en gesequenced. Voor de sc-RNAseq-studie was het aantal verkregen enkele cellen ~ 9.700. De verdeling van cellen uit 4 monsters is weergegeven in tabel 2.

Evenzo werden voor de scATACseq-studie afzonderlijke cellen geïsoleerd uit 12 RCA's en LCA's die werden bereid, onderworpen aan transposasebehandeling, met streepjescode en gesequenced. Sequencing werd uitgevoerd voor 18.324 enkele kernen, die werden gepoold van 1.291 (2-daagse RCA [2D-R]), 5.351 (2-daagse LCA [2D-L]), 5.826 (2-weekse RCA [2W-R]) en 5.856 (2-weekse LCA [2W-L]) (Tabel 2). Representatieve eencellige en eenkernige preparaten zoals gevisualiseerd door brightfieldmicroscopie en fasecontrastmicroscopie zijn weergegeven in figuur 2A,B. De efficiëntie van eenkernpreparaat uit eencellige suspensie is weergegeven in figuur 2C.

De kernen (~ 7.000 elk) van 2D (RCA's en LCA's) en 2W (RCA's en LCA's) monsters werden geïncubeerd met een Transpositiemix (Tn5 transposase-enzym en buffer) zie de Tabel van Materialen) gedurende 60 minuten bij 37 °C volgens het protocol van de fabrikant. Op basis van de aanbeveling van de fabrikant hielp een milde wasmiddelconditie de kernen intact te houden tijdens het labelen. Een mastermix, bestaande uit een barcoderingsreagens, reductiemiddel B en barcoderingsenzym, werd vervolgens op een microfluïdisch cel / kernen inkapselingsplatform geladen om gelemulsies met één kern te bereiden met barcodering volgens de instructies van de fabrikant.

Na sequencing werd de Cell Ranger Single-Cell Software suite gebruikt voor demultiplexing, barcode processing alignment en initiële clustering van de ruwe scATACseq en scRNaseq profielen. Voor de scRNAseq-studie worden de verdeling van genen per cel, unieke moleculaire identificatie (UMI) per cel, mitochondriale reads per cel en sequencingverzadigingsinformatie weergegeven in figuur 3A-C. Evenzo worden voor de scATACseq-studie kwaliteitscontrolestatistieken weergegeven die de verdeling van de insertgrootte (nucleosoombandingspatroon) en de genormaliseerde TSS-verrijkingsscore laten zien in figuur 3D-F. Bovendien worden de procentuele fragmenten die worden gelezen in de pieken, piekregiofragmenten, TSS-verrijkingsscore, verhouding van reads in blacklist genomische sites en nucleosoomsignaalratio weergegeven in figuur 3G-K.

Endotheelverrijking werd gekwantificeerd door deze methode te vergelijken met die van enzymatische vertering van de gehele halsslagader¹². Het aantal endotheelcellen van de volledige vertering van de halsslagader was 3-5% van het totale aantal verkregen cellen, terwijl deze methode de verrijking van endotheelcellen tot >50% ⁸ mogelijk maakte. Evenzo toonde een andere eencellige studie die de hele muisaorta gebruikte aan dat endotheelfractie <7% van het totale celgetal was. Voor een diepgaande eencellige RNAseq- en eencellige ATACseq-analyse wordt lezers verzocht te verwijzen naar ⁸.

Figuur 1: Isolatie van halsslagaders voor eencellige bereiding. (A) Anatomisch beeld van de halsslagaders bij muizen. Rode pijlen en inzet tonen de geïsoleerde linker halsslagader na het opruimen van periadventitief vet. Voor een schema van de anatomie en ligaties van de halsslagader, zie figuur 1 in Nam et al³ (B) Afbeelding toont de locatie van microclips na het vullen van de halsslagader met de spijsverteringsbuffer. C) Gexplante halsslagader met digestiebuffer. Schaal: afstand tussen zwarte lijnen = 1 mm. (D) Een naald van 29 G in het lumen van de halsslagader van de muis. Deze stap helpt de halsslagader aan te vullen met digestiebuffer indien nodig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Eencellige en eenkernige preparaten uit luminale enzymatische vertering van de halsslagader van muizen. (A) Representatieve eencellige en eenkernige preparaten. Schaalbalken = 0,25 mm (B) Representatief fasecontrast en Gel-Rood beelden van preps met één kern. Schaalstaven = 0,25 mm. (C) Efficiëntie van voorbereiding van één kern in de linkerkolom toont het aantal enkele cellen aan het begin, terwijl de rechterkolom het aantal enkele kernen toont na verwerking met kernisolatiebuffer in verschillende stappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Standaard QC-statistieken voor de scRNAseq- en scATACseq-studie. Vioolplots tonen (A) de verdeling van genen per cel (nFeature RNA), (B) UMI per cel (nCount_RNA), (C) mitochondriale reads per cel (procent mt) voor de scRNAseq-gegevens. (D en E) tonen het nucleosoombandingspatroon voor het scATACseq-onderzoek. Het histogram van DNA-fragmentgroottes vertoont een sterk nucleosoombandingspatroon dat overeenkomt met de lengte van dna gewikkeld rond een enkel nucleosoom. (F) Genormaliseerde TSS-verrijkingsscore op elke positie ten opzichte van de TSS. De scatter/vioolplots tonen (G) procentuele fragmenten die in de pieken worden gelezen, een maat voor de sequencingdiepte, (H) piekgebiedfragmenten die het aantal fragmenten weergeven dat pieken overlapt, (I) TSS-verrijkingsscore, een verhouding tussen de totale verdeling van reads gecentreerd op TSS'en en die flankerend de overeenkomstige TSS, (J) blacklist ratio, een verhouding van reads in blacklist genomische sites, en (K) nucleosoomsignaal, een verhouding van mononucleosomale tot nucleosoomvrije fragmenten. Afkortingen: scRNAseq = single-cell RNA sequencing; scATACseq = single-cell Assay voor Transposase Accessible Chromatin sequencing; QC = kwaliteitscontrole; UMI = unieke moleculaire identificatie; TSS = transcriptie start site. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstelling van single-nuclei lysis en wash buffers. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Eencellige en eenkernentelling van de luminale vertering van de halsslagader van muizen. De tabel toont ook gemiddelde reads/cel en aantal genen/cel voor scRNAseq-gegevens. Voor de scATACseq-gegevens worden de gemiddelde fragmenten/cel en de totale afgelezen waarden per monster weergegeven⁸. Afkortingen: scRNAseq = single-cell RNA sequencing; scATACseq = single-cell Assay voor Transposase Accessible Chromatin sequencing; 2D = 2-daags; 2W = 2 weken; R/RCA = rechter halsslagader; L/LCA = linker halsslagader. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om eencellige preparaten te isoleren uit de halsslagaders van de muis. De invloed van d-flow op de endotheelcellen kan nauwkeurig worden bestudeerd als de PCL-operatie correct wordt uitgevoerd. Het is cruciaal om de takken van de gemeenschappelijke halsslagader correct te identificeren, zoals de externe halsslagader, interne halsslagader, occipitale slagader en superieure schildklierslagader. Validatie van stromingspatronen door echografie valideert verder het succesvolle begin van d-flow condities . Hoewel PCL-chirurgie kan worden uitgevoerd op muizen ongeacht hun leeftijd, is de voorkeursleeftijd 10 ± 2 weken. Oudere muizen en muizen met hypercholesterolemische achtergronden hebben over het algemeen de neiging om meer periadventitief vet en een stijvere huid te hebben.

Het is essentieel om de met carotisslagaders verrijkte eencellige preparaten zorgvuldig te ontleden die vrij zijn van het omliggende weefsel en periadventitievet. Het lumen van de halsslagaders moet grondig worden doordrenkt om besmetting van bloedcellen in de eencellige preparaten te voorkomen. Onjuiste weefselidentificatie en etikettering kan leiden tot een hoge standaarddeviatie. Voor dit protocol is een zorgvuldige planning en tijdmanagement vereist. Een ervaren chirurg en operator kunnen 15-20 minuten nodig hebben om één PCL-operatie uit te voeren. Het opofferen, carotisisolatie en luminale enzymatische spijsvertering van elke muis zou nog eens 35-40 minuten duren. De hands-on verwerkingstijd van endotheelcelspoeling tot single-cell/single-nuclei prep is nog eens 2 uur. Zorgvuldige planning en teamwork worden ten zeerste aanbevolen.

Zoals met elk experimenteel protocol, moeten enkele nadelen en beperkingen worden overwogen. Het huidige protocol bevat geen stappen om artefactuele activering van onmiddellijke vroege respons tijdens de luminale weefseldissociatie te voorkomen. In de literatuur is gemeld dat enzymatische spijsvertering kan leiden tot stresssignaleringsgebeurtenissen, zoals ontsteking en apoptose. Dit kan worden aangepakt door geschikte controlegroepen op te nemen in het experimentele ontwerp. Bovendien moeten natte laboratoriummethoden die de artefactuele activering van onmiddellijke respons tijdens enzymatische spijsvertering, zoals koud-actieve proteasen, kunnen minimaliseren, worden beschouwd als^13,14.

Dit protocol kan worden gebruikt voor elke muizenstam, ongeacht de genetische achtergrond. De met endotheel verrijkte preparaten kunnen echter het beste antwoord geven op onderzoeksvragen met betrekking tot de veranderingen in endotheel en zijn daarom zeer geschikt voor EC-specifieke knock-outs en EC-specifieke transgene muizen. Deze eencellige isolatiemethode kan worden aangepast om eencellige multi-omics-studies en andere op flowcytometrie gebaseerde assays zoals Imaging Flow Cytometry uit te voeren. De luminale verteringsbenadering kan worden gebruikt voor vers verkregen muisaorta's, slagaders van grote dieren (konijnen en varkens), evenals voor vers verkregen menselijke vasculaire explantaten. Collectief zou deze methode ons in staat stellen om de precieze rol van de bloedstroom op de endotheelfunctie en herprogrammering met een eencellige resolutie volledig te begrijpen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac