ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Tek hücreli omik deneyler yapmak için stabil veya rahatsız edici akış koşullarına maruz kalan fare karotis arterlerinin lümeninden endotel hücrelerini ve çekirdeklerini izole etmek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Ateroskleroz, bozulmuş kan akışına (d-flow) maruz kalan arteriyel bölgelerin enflamatuar bir hastalığıdır. D-akımı , endoteldeki genlerin ekspresyonunu transkriptomik ve epigenomik seviyelerde düzenler ve proaterojenik yanıtlarla sonuçlanır. Son zamanlarda, fare kısmi karotis ligasyonu (PCL) modeli kullanılarak transkriptomik ve kromatin erişilebilirliği değişikliklerini tek hücreli çözünürlükte belirlemek için Transpozaz Erişilebilir Kromatin dizilimi (scATACseq) için tek hücreli RNA dizilimi (scRNAseq) ve tek hücreli Tahlil çalışmaları yapılmıştır. Endotel hücreleri (ECs), arter duvarındaki toplam hücre popülasyonlarının küçük bir kısmını temsil ettiğinden, EC ile zenginleştirilmiş tek hücreli preparatlar elde etmek için luminal bir sindirim yöntemi kullanılmıştır. Bu çalışma için fareler, sağ karotis arteri (RCA) kontrol olarak kullanırken, sol karotis arterde (LCA) d-akışını indüklemek için PCL cerrahisine tabi tutuldu. Karotis arterler PCL cerrahisinden iki gün veya iki hafta sonra diseke edildi. Her karotidin lümeni kollajenaz sindirimine tabi tutuldu ve endotelyal zenginleştirilmiş tek hücreler veya tek çekirdekler elde edildi. Bu tek hücreli ve tek çekirdekli preparatlar daha sonra 10x Genomik mikroakışkan kurulum kullanılarak barkodlandı. Barkodlanmış tek hücreler ve tek çekirdekler daha sonra RNA hazırlama, kütüphane oluşturma ve yüksek verimli bir DNA sıralayıcısında dizileme için kullanıldı. Biyoinformatik işleme sonrası, scRNAseq ve scATACseq veri kümeleri, öncelikle EC'lerden oluşan luminal sindirimden çeşitli hücre tiplerini tanımladı. Düz kas hücreleri, fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri de mevcuttu. Bu EC-zenginleştirme yöntemi, toplam arter sindirim yöntemiyle zor olabilecek kan akışının endotel üzerindeki etkisini anlamaya yardımcı oldu. EC ile zenginleştirilmiş tek hücreli hazırlama yöntemi, kan akışının bu genler üzerindeki etkisinin çalışılmadığı EC-nakavtlarda ve transgenik farelerde tek hücreli omik çalışmalar yapmak için kullanılabilir. Önemli olarak, bu teknik, benzer mekanik çalışmalar yapmak için EC ile zenginleştirilmiş tek hücreleri insan arter eksplantlarından izole etmek için uyarlanabilir.
Introduction
Bu laboratuvar daha önce d-flow indüksiyonunun hiperlipidemik farelerde hızlı ve sağlam ateroskleroz gelişimine yol açtığını göstermiştir 1,2. D-flow kaynaklı aterosklerozun yeni fare modeli, kısmi karotis ligasyonu (PCL) cerrahisi kullanılarak mümkün olmuştur 3. PCL cerrahisi, bağlı sol karotis arterde (LCA) düşük ve salınımlı kan akımı durumunu veya d-akışını indükler. Buna karşılık, kontralateral sağ karotis arter (RCA) stabil laminer akışla (s-flow) yüzleşmeye devam eder. Önceden, d-akışının endotel hücreleri üzerindeki etkisini anlamak için, karotis arterler kısmi ligasyon ameliyatından sonra diseke edildi ve endotelyal olarak zenginleştirilmiş "havuzlanmış yığın" RNA'ları veya DNA'ları sağlayan bir fenol ve guanidin izotiyosiyanat bazlı lize edici ajan (luminal RNA / DNA yıkama yöntemi)2,4 ile yıkandı. Bu havuzlanmış toplu RNA'lar veya DNA'lar daha sonra sırasıylatranskriptomik çalışmalar veya epigenomik DNA metilom çalışmaları için işlendi, sırasıyla 4,5,6. Bu çalışmalar, endotel biyolojisi ve aterosklerozdaki rolleri kapsamlı bir şekilde araştırılan çoklu akışa duyarlı genlerin ve mikroRNA'ların keşfedilmesine yardımcı oldu 4,6,7.
Bununla birlikte, endotel zenginleştirmesine rağmen, bu toplu RNA / DNA çalışmaları, d-flow kaynaklı aterosklerozda arter duvarındaki her hücre tipinin spesifik rolünü ayırt edememiştir. Bu sınırlılığın üstesinden gelmek için endotelyal zenginleştirilmiş tek hücreli (sc) izolasyon ve scRNA ve scATAC dizileme çalışmalarıyapılmıştır 8. Bunun için, C57Bl6 fareleri, s-akışına maruz kalan RCA'yı kontrol olarak kullanırken LCA'da d-akışını indüklemek için PCL ameliyatına tabi tutuldu. PCL ameliyatından iki gün veya iki hafta sonra, fareler kurban edildi ve karotidler diseke edildi ve temizlendi. Hem LCA'ların hem de RCA'ların lümenleri kollajenaz ile aşılandı ve önemli bir fraksiyon olarak ECs içeren luminal kollajenaz sindirimi ve diğer arteriyel hücreler toplandı. Tek hücreli süspansiyon (scRNAseq) veya tek çekirdekli süspansiyon (scATACseq), 10x Genomik kurulum kullanılarak her hücre veya çekirdek için benzersiz tanımlayıcılarla hazırlandı ve barkodlandı. RNA'lar cDNA kütüphanesi hazırlığına tabi tutuldu ve sıralandı.
scRNAseq ve scATACseq veri kümeleri, Cell Ranger Tek Hücreli Yazılım kullanılarak işlendi ve ayrıca Seurat ve Signac R paketleri 9,10 tarafından analiz edildi. Her hücreye ve çekirdeğe bu analizlerden bir hücre tipi atandı ve işaretleyici genlere ve benzersiz gen ekspresyon modellerine dayanarak hücre tipine kümelendi. ScRNAseq ve scATACseq'in sonuçları, bu tek hücreli preparatların ECs ile zenginleştirildiğini ve ayrıca düz kas hücreleri (SMC'ler), fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri içerdiğini göstermiştir.
Daha ileri analizler, luminal sindirimdeki EC popülasyonunun oldukça farklı ve plastik (8 farklı EC kümesi) olduğunu ve kan akışına duyarlı olduğunu ortaya koymuştur. En önemlisi, bu sonuçlar d-flow'un ECs'leri athero korumalı bir anti-enflamatuar fenotipten, pro-enflamatuar, endotelyal-mezenkimal geçiş, endotel kök / progenitör hücre geçişi ve en şaşırtıcı şekilde, endotelyal-bağışıklık hücresi benzeri geçiş dahil olmak üzere pro-aterojenik fenotiplere yeniden programladığını göstermiştir. Ek olarak, scATACseq verileri, birkaç yeni hipotezin temelini oluşturan genom çapında yeni akışa bağlı kromatin erişilebilirlik değişikliklerini ve transkripsiyon faktörü bağlanma bölgelerini ortaya koymaktadır. Fare karotis arterlerinden tek hücreli multi-omik çalışmalar için tek endotel hücrelerinin hazırlanmasına yönelik metodoloji ve protokol aşağıda detaylandırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hiperkolesterolemik olmayan, yaş ve cinsiyete uygun C57BL / 6 fareleri, cinsiyete bağlı varyasyonu hafifletmek ve hiperkolesterolemik durumların herhangi bir komplikasyonunu dengelemek için kullanıldı.
1. Parsiyel karotis ligasyonu (PCL) cerrahisi
NOT: LCA'nın parsiyel karotis arter ligasyonu daha önce tarif edildiği ve gösterildiği gibigerçekleştirilmiştir 3.
- Anestezik buharlaştırıcı kullanarak işlem boyunca fareyi izofluran inhalasyonu (indüksiyon için oksijende% 5 izofloran ve bakım için% 1.5) ile anestezik hale getirin. Ameliyat sırasında vücut ısısı kaybını önlemek için fare sırtüstü yatağını Deltafaze izotermal ped üzerine yerleştirin.
- Maruz kalma keratiti önlemek için bir oküler merhem uygulayın ve ayak parmağı sıkışma yanıtının yokluğunda anestezi derinliğini onaylayın.
- Ağrıyı önleyici olarak yönetmek için deri altından 0.05 mg / kg buprenorfin enjekte edin. Epilasyonlu bölgeyi betadin ve izopropanol çözeltisi ile üç kez uygulayarak ve temizleyerek dezenfekte edin. Betadinin, ameliyat alanını sterilize etmek için merkezden başlayarak ve yanlarda bitirerek son adım olduğundan emin olun.
- Aseptik teknikler kullanarak, boyun bölgesinde ventral orta hat insizyonu (~ 1 cm) yapın ve künt diseksiyon ile LCA dal noktasını ortaya çıkarın.
- Sol internal karotid, eksternal karotis ve oksipital arterleri 6-0 ipek sütür ile bağlayın; superior tiroid arteri el değmeden bırakın.
- Cilde yaklaşın ve insizyonu doku yapıştırıcısı ve / veya dikişlerle kapatın.
- Fareyi önceden ısıtılmış bir kurtarma kafesine (37 ° C'de tutulur) aktarın ve ameliyat sonrası hipotermiyi önlemek için 1 saate kadar temiz bir havluya yerleştirin.
NOT: Deneyimlerimize göre, önleyici tek doz Buprenorfin (0.05 mg / kg) genellikle ameliyat sonrası ağrı yönetimi için yeterlidir. Hayvan ilk 24 saatten sonra sıkıntıdaysa tekrarlanan bir Buprenorfin dozu uygulanabilir. Doğru yapılırsa, bu prosedürle ilişkili ölüm oranı yoktur ve fareye postoperatif stres minimumdur. Fareler kendi kafeslerine geri gönderilir ve ameliyattan sonra günlük olarak izlenir. - Perfüzyon kurulumunu hazırlayın.
- IV torbada 10 U/mL heparin içeren %0,9 NaCl (normal salin) kullanın. IV torbasını yerden 244-274 cm (8-9 feet) veya diseksiyon tahtasından yaklaşık 122-152 cm (4-5 feet) daha yükseğe bağlayın. Kelebek iğnesini tuzlu su hattının sonuna takın ve hava kabarcıklarını IV hattından temizleyin.
2. Fedakarlık sonrası karotis arterlerin izolasyonu
- Kurumsal IACUC protokolünü takiben fareleri CO2 inhalasyonu ile feda edin.
- Fare derisine% 70 etanol püskürtün ve adsorban kağıt havlu içeren diseksiyon panosu üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Farenin pençelerini, yapışkan bant veya 21 G'lik bir iğne kullanarak diseksiyon panosundaki adsorban havlulara sabitleyin.
- Bir çift steril makas kullanarak, farenin derisini karından başlayarak ve göğüs kafesinin tepesine kadar çıkarın.
- Göğüs kafesinin altındaki karın duvarını künt diseksiyonla açmak için bir çift makas kullanın.
- Makası kullanarak, diyaframın uzunluğu boyunca dikkatlice bir kesi yapın ve sternum kaldırılana kadar toraksın her iki tarafındaki kaburgalardan devam edin. Sternumu bir çift forseps ile yavaşça kaldırın; Bundan sonra, kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini çıkarın.
- Büyük damarları görselleştirmek için timüs ve kalp üzerindeki herhangi bir bağ dokusunu dikkatlice çıkarın.
- Kanın kapalı dolaşımdan çıkmasına izin vermek için vena kavayı makasla kesin.
- Kalbin tepesinden IV hattına bağlı 21 G kelebek iğneyi sol ventriküle yerleştirin ve oda sıcaklığında normal salin ile 2-3 dakika boyunca retrograd perfüzyona izin verin. Tuzlu su torbasını yerden 8-9 fit yükseklikte tutarak normal salinin sabit bir akış hızının korunduğundan emin olun.
NOT: Akciğerler ve karaciğer soluklaşır, bu da optimal perfüzyonu gösterir. Her fare için yaklaşık 20 mL perfüzyon tamponu kullanılır. - Cildi boyun bölgesinden çıkarın ve karotis arterleri açığa çıkarmak için tüm yağ, kas ve bağ dokularını çıkarın (Şekil 1A).
NOT: İşlemin geri kalanı diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilir. - Ligasyon alanlarını bulmak için görüş alanını ayarlayın. 10 mm'lik mikro diseksiyon makaslarını kullanarak, perfüzyona izin vermek için LCA'daki ligasyon bölgesinin altında küçük bir kesi yapın.
- Sol ventrikül üzerinden 1 dakika daha perfüze edin ve LCA'nın iyi perfüze edildiğinden ve görünür kan izlerinden arındırıldığından emin olun.
- Karotis vücuda bağlıyken karotidleri çevreleyen peri-adventitial dokuları dikkatlice çıkarmak için ince uçlu forseps ve küçük yaylı makas kullanın.
NOT: Bu temizleme adımı sırasında karotis arterleri sıkmamaya veya germemeye son derece dikkat edin, çünkü bu canlı olmayan hücrelerin sayısını artırabilir. Doğru yapılırsa, son hücre süspansiyonundaki hücre canlılığı genellikle% >93'tür.
3. Farelerin karotidlerinden endotel hücre bakımından zenginleştirilmiş tek hücreli izolasyon
NOT: Aşağıda tarif edilen reaktifler önceden hazırlanabilir ve kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir: Tablo 1'de listelenen reaktiflerle birlikte 1x ve 0.1x tek çekirdekli lizis tamponları; Tablo 1'de listelenen reaktiflerle tek çekirdekli yıkama tamponu; Tablo 1'de listelenen reaktiflerle tek çekirdekli Çekirdek Tampon tarifi. Bu tamponların çalışma stokları üreticinin protokolüne uygun olarak hazırlanmalıdır. Sindirim tamponu bileşimi: %0.5 fetal sığır serumu (FBS) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde kollajenaz Tip II 600 U/mL ve DNaz I 60 U/mL.
- Karotidler hala bağlıyken, kan izlerini temizlemek için karotis arterlerin dışını normal salin çözeltisi ile yıkayın.
- 29 G'lık bir iğne ile donatılmış bir insülin şırıngası kullanarak, sindirim tamponunun ~ 50 μL'sini sol karotis arterin distal ucunun lümenine enjekte edin. Sindirim tamponu karotis arteri doldurmaya başladığında, karotisin proksimal ucunu bir mikro klipsle sıkıştırın (Şekil 1B). Lümenin içine ilave 15-20 μL sindirim tamponu ekleyin ve sindirim tamponunun salınmasını önlemek için distal ucu klipsleyin.
- Karotis arterleri fareden dikkatlice çıkarın (Şekil 1B, C) ve bunları ılık (37 ° C'de) Hepes tamponlu salin çözeltisi içeren 35 mm'lik kaplara yerleştirin.
NOT: Her iki kelepçenin de sağlam bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Kelepçe gevşerse, sindirim çözeltisi lümenden sızabilir ve elde edilen hücre sayısını etkileyebilir. Bu durumda, karotisin açık ucundan 29 G'lık bir iğne ile donatılmış bir insülin şırıngası kullanarak ek enzimatik çözelti ekleyin ve kelepçeyi tekrar sabitleyin (Şekil 1D). Enzim tampon çözeltisi tekrar sızarsa, ekzotidin ekplantasyon işlemi sırasında kopması muhtemeldir. Bu durumda, karotidi atın ve numuneyi çalışmadan çıkarın. Karotisin tekrarlanan kaba kullanımı, hücre canlılığını ve tek hücreli preparatın kalitesini azaltacaktır. Sol ve sağ karotis arterleri tanımlamaya ve doğru şekilde etiketlemeye özen gösterin. - Ekilen karotidleri aralıklı sallanma ile 37 ° C'de 45 dakika boyunca inkübe edin.
4. Karotis arterlerin yıkanması
- Luminal enzimatik sindirimi tamamladıktan sonra, karotis arteri kelepçelerle birlikte 35 mm'lik çanaktan çıkarın. Sindirim tamponunun sızmamasına dikkat ederek her kelepçeyi dikkatlice çıkarın.
- Karotis arterin bir ucunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün üstünde ince forseps ile yavaşça tutun. 100 μL sıcak sindirim tamponu (37 °C) içeren bir insülin şırıngası ile donatılmış 29 G'lık bir iğneyi diğer elinizle lümene yerleştirin (Şekil 1D).
- Karotisin lümenini mikrosantrifüj tüpüne hızla yıkayın. 1,5 mL tüpe 0,3 mL FBS ekleyerek enzimatik reaksiyonu engelleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.
NOT: Kızarma, luminal enzimatik sindirimden gelen hücreleri içerir. FBS eklemek ve sıcaklığı düşürmek enzimatik sindirim işlemini durdurur. Preparattaki hücre sayısı yüksekse ve döküntü veya yağ dokusu içeriyorsa, istenmeyen doku kalıntılarını filtrelemek için 50 veya 70 μm hücre süzgeci kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Tek hücreli sayımı arttırmak için, birden fazla karotidin yıkanması önerilir. Burada, en az 5.000 hücre elde etmek için, 10-12 karotit yıkandı ve bir örnek olarak toplandı. - Sabit açılı rotorla donatılmış bir santrifüj kullanarak hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Süpernatantı atın ve tüm hücreleri tek hücrelere ayırmak için hücre ayrışma reaktifini içeren sindirim tamponunda hücre peletini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de 5 dakika boyunca yeniden askıya alın.
NOT: Preparattaki hücre sayısı düşükse, hücreleri döndürmek için santrifüj hızını 2.000-3.000 × g'a kadar artırın. Ayrıca, 0,5 mL santrifüj tüplerinin kullanılması, tüpün altındaki hücre peletinin daha iyi görselleştirilmesini kolaylaştırır. - 0,5 mL tüpe 0,15 mL FBS ekleyerek enzimatik reaksiyonu engelleyin.
- Tek hücreli süspansiyonu, adım 4.4'te olduğu gibi sabit açılı rotorla donatılmış bir santrifüj kullanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın.
- Süpernatantı atın ve hücreleri 0.2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde PBS'de 100 μL buz soğuk% 1 sığır serum albümini (BSA) çözeltisinde yeniden askıya alın.
NOT: 0,2 mL santrifüj tüplerinin kullanılması, tüpün altındaki tek hücreli peletin görselleştirilmesini artırır.
5. Tek hücreli ve tek çekirdekli analizler
- scRNAseq için tek hücreli hazırlığı yeniden askıya alın ve gönderin.
- Tek hücreli peleti, 0,2 mL'lik bir tüp içinde PBS'de 100 μL buz soğuk% 1 BSA ile yeniden askıya alın.
- Hücreleri tek hücreli kapsülleme için yeniden askıya aldıktan sonra, hemen mikroakışkanlar tabanlı tek hücreli bölümleme ve barkodlama sistemi kullanarak tek hücreli kapsülleme ve barkodlama için devam edin (bkz.
- Örnekleri Genomik Çekirdeğine göndermeden önce, tek hücreli preparatları sayın ve inceleyin; hücre agregalarının olmamasını sağlamak.
NOT: Tek hücrelerin toplanması, BSA miktarının% 2'ye kadar arttırılmasıyla daha da aza indirilebilir.
- scATACseq için tek hücreli hazırlığı yeniden askıya alın ve gönderin.
- Hücre peletini buz gibi soğuk 1x PBS'de %0,04 BSA'lık 100 μL'de yeniden askıya alın ve tek hücreli süspansiyonu 4 °C'de 500 × g'de santrifüj edin.
- Tek hücreli süspansiyonu buz gibi soğuk 0.1x lizis tamponu ile lize edin (Tablo 1) ve buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Lisatı bir P-20 pipetle 10 kez karıştırın ve 10 dakika daha kuluçkaya yatırın.
- Lize edilmiş hücrelere 500 μL soğutulmuş yıkama tamponu (Tablo 1) ekleyin ve pipet kullanarak 5 kez karıştırın.
NOT: Hücre süspansiyonundaki kalıntıları filtrelemek ve bunları 2 mL'lik bir tüpe aktarmak için 70 μm'lik bir hücre süzgeci kullanın. - Lisatı 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj edin. Süpernatantı atın ve çekirdek-peleti seyreltilmiş çekirdek tamponunda (150 μL) yeniden askıya alın (Malzeme Tablosu ve Tablo 1'e bakınız). Bir hemositometre11 kullanarak tek çekirdekli preparatları sayın ve inceleyin.
- Tek çekirdekli transpozisyon, çekirdek bölümleme, kütüphane hazırlama ve dizileme için tek çekirdekli örneği Genomik Çekirdek'e gönderin.
NOT: İlk hücre sayısı düşükse, çekirdekler boyunca enkaz gözlemlemek yaygındır. Bu nedenle, yüksek bir hücre numarası ile başlamanız önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Parsiyel karotis ligasyon ameliyatları 44 fareye uygulandı ve parsiyel ligasyon cerrahisinden bir gün sonra ultrasonografi yapılarak LCA'da d-akımının başlangıcı doğrulandı. Başarılı kısmi ligasyon cerrahisi, kan akış hızının azalmasına neden olur ve LCA3'teki kan akışını (bozulmuş akış) tersine çevirir. Karotis arterler ligasyondan iki gün sonra veya iki hafta sonra diseke edildi. Her karotidin lümeni kollajenaz sindirimine tabi tutuldu ve endotelyal zenginleştirilmiş tek hücreli veya tek çekirdekli süspansiyonlar hazırlandı. Tek hücreli süspansiyonlar, hücre verimini artırmak için 10 RCA ve LCA'dan toplandı. Hazırlanan hücreler/çekirdekler daha sonra barkodlanmış ve sıralanmıştır. Sc-RNAseq çalışması için, elde edilen tek hücre sayısı ~ 9.700 idi. 4 örnekten hücrelerin dağılımı Tablo 2'de gösterilmiştir.
Benzer şekilde, scATACseq çalışması için, hazırlanan 12 RCA ve LCA'dan tek hücreler izole edildi, transpozaz işlemine tabi tutuldu, barkodlandı ve sıralandı. 1.291 (2 günlük RCA [2D-R]), 5.351 (2 günlük LCA [2D-L]), 5.826 (2 haftalık RCA [2W-R]) ve 5.856 (2 haftalık LCA [2W-L]) (Tablo 2) arasından toplanan 18.324 tek çekirdek için dizileme yapıldı. Parlak alan mikroskobu ve faz kontrast mikroskobu ile görselleştirilen temsili tek hücreli ve tek çekirdekli preparatlar Şekil 2A,B'de gösterilmiştir. Tek hücreli süspansiyondan tek çekirdekli preparatın etkinliği Şekil 2C'de gösterilmiştir.
2D (RCA'lar ve LCA'lar) ve 2W (RCA'lar ve LCA'lar) numunelerden elde edilen çekirdekler (her biri ~ 7.000), üreticinin protokolünü takiben 37 ° C'de 60 dakika boyunca bir Transpozisyon Karışımı (Tn5 transpozaz enzimi ve tamponu) ile inkübe edildi. Üreticinin tavsiyesine dayanarak, hafif bir deterjan durumu, etiketleme sırasında çekirdeklerin bozulmadan kalmasına yardımcı oldu. Bir Barkodlama Reaktifi, İndirgeyici Ajan B ve Barkodlama Enziminden oluşan bir ana karışım, daha sonra üreticinin talimatlarına göre barkodlama ile tek çekirdekli jel emülsiyonları hazırlamak için bir mikroakışkan hücre / çekirdek kapsülleme platformuna yüklendi.
Sıralama sonrasında, Cell Ranger Tek Hücreli Yazılım paketi, ham scATACseq ve scRNaseq profillerinin çoklamasını çözme, barkod işleme hizalaması ve ilk kümelemesi için kullanıldı. ScRNAseq çalışması için, hücre başına genlerin dağılımı, hücre başına benzersiz moleküler tanımlayıcı (UMI), hücre başına mitokondriyal okumalar ve sıralama doygunluğu bilgileri Şekil 3A-C'de gösterilmiştir. Benzer şekilde, scATACseq çalışması için, kesici uç boyutu dağılımını (nükleozom bantlama paterni) ve normalleştirilmiş TSS zenginleştirme skorunu gösteren kalite kontrol metrikleri Şekil 3D-F'de gösterilmiştir. Ek olarak, piklerdeki yüzde fragman okumaları, pik bölge fragmanları, TSS zenginleştirme skoru, kara liste genomik bölgelerindeki okumaların oranı ve nükleozom sinyal oranı Şekil 3G-K'da gösterilmiştir.
Endotel zenginleştirme, bu yöntemin tüm karotis arterin enzimatik sindirimi ile karşılaştırılarak ölçüldü12. Tam karotis arter sindiriminden elde edilen endotel hücre sayısı, elde edilen toplam hücrelerin% 3-5'i iken, bu yöntem endotel hücrelerinin >50% 'ye zenginleşmesini sağlamıştır 8. Benzer şekilde, tüm fare aortunu kullanan bir başka tek hücreli çalışma, endotel fraksiyonunun toplam hücre sayısının% <7'si olduğunu göstermiştir. Derinlemesine tek hücreli RNAseq ve tek hücreli ATACseq analizi için, okuyucuların 8'e başvurmaları istenir.
Şekil 1: Tek hücreli preparat için karotis arterlerin izolasyonu. (A) Farelerde karotis arterlerin anatomik görünümü. Kırmızı oklar ve iç kısım, periadventitial yağın temizlenmesinden sonra izole sol karotis arteri gösterir. Karotis anatomisi ve ligasyonlarının bir şeması için, Nam et al3 (B) Resimdeki Şekil 1'e bakınız Resim, karotis arteri sindirim tamponu ile doldurduktan sonra mikro klipslerin yerini göstermektedir. (C) Sindirim tamponu içeren ekşimiş karotis arter. Ölçek: siyah çizgiler arasındaki mesafe = 1 mm. (D) Fare karotis arterinin lümenindeki 29 G'lik bir iğne. Bu adım, karotis arterin gerekirse sindirim tamponu ile yenilenmesine yardımcı olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fare karotis arterinin luminal enzimatik sindiriminden tek hücreli ve tek çekirdekli preparatlar . (A) Temsili tek hücreli ve tek çekirdekli preparatlar. Ölçek çubukları = 0,25 mm (B) Tek çekirdekli preparatların temsili faz kontrastı ve Jel-Kırmızı görüntüleri. Ölçek çubukları = 0,25 mm. (C) Sol sütundaki tek çekirdekli preparatın verimliliği, başlangıçtaki tek hücre sayısını gösterirken, sağ sütun, farklı adımlarda çekirdek izolasyon tamponu ile işlendikten sonra tek çekirdek sayısını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: scRNAseq ve scATACseq çalışması için standart QC metrikleri. Keman grafikleri (A) hücre başına genlerin dağılımını (nFeature RNA), (B) hücre başına UMI (nCount_RNA), (C) scRNAseq verileri için hücre başına mitokondriyal okumaları (yüzde mt) gösterir. (D ve E), scATACseq çalışması için nükleozom bantlama modelini gösterir. DNA fragman boyutlarının histogramı, tek bir nükleozomun etrafına sarılmış DNA'nın uzunluğuna karşılık gelen güçlü bir nükleozom bantlama paterni sergiler. (F) TSS'ye göre her pozisyonda normalleştirilmiş TSS zenginleştirme puanı. Dağılım/keman grafikleri (G) zirvelerde okunan yüzde parça, sıralama derinliğinin bir ölçüsü, (H) zirvelerle örtüşen parçaların sayısını gösteren tepe bölgesi parçaları, (I) TSS zenginleştirme skoru, TSS'lere odaklanan okumaların toplam dağılımı ile karşılık gelen TSS'yi çevreleyen bir oran, (J) kara liste oranı, kara liste genomik bölgelerindeki okumaların oranı, ve (K) nükleozom sinyali, mononükleozomal ila nükleozomsuz fragmanların oranı. Kısaltmalar: scRNAseq = tek hücreli RNA dizilimi; scATACseq = Transpozaz Erişilebilir Kromatin dizilimi için tek hücreli Tahlil; QC = kalite kontrol; UMI = benzersiz moleküler tanımlayıcı; TSS = transkripsiyon başlangıç sitesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Tek çekirdekli lizis ve yıkama tamponlarının bileşimi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Fare karotis arter luminal sindiriminden tek hücreli ve tek çekirdekli sayım. Tablo ayrıca scRNAseq verileri için okuma ortalamalarını / hücrelerini ve gen / hücre sayısını gösterir. scATACseq verileri için, örnek başına elde edilen ortalama parçalar/hücre ve toplam okumalar8 olarak gösterilmiştir. Kısaltmalar: scRNAseq = tek hücreli RNA dizilimi; scATACseq = Transpozaz Erişilebilir Kromatin dizilimi için tek hücreli Tahlil; 2D = 2 günlük; 2W = 2 haftalık; R/RCA = sağ karotis arter; L/LCA = sol karotis arter. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, tek hücreli preparatları fare karotis arterlerinden izole etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. D-flow'un endotel hücreleri üzerindeki etkisi, PCL cerrahisi doğru bir şekilde gerçekleştirilirse doğru bir şekilde incelenebilir. Dış karotid, internal karotid, oksipital arter ve superior tiroid arter gibi ortak karotidin dallarını doğru bir şekilde tanımlamak çok önemlidir. Ultrasonografi ile akış paternlerinin doğrulanması, d-flow koşullarının başarılı başlangıcını daha da doğrular. PCL cerrahisi farelerde yaşlarına bakılmaksızın yapılabilse de tercih edilen yaş 10 ± 2 haftadır. Yaşlı fareler ve hiperkolesterolemik arka plana sahip fareler genellikle daha fazla periadventitial yağa ve daha sert bir cilde sahip olma eğilimindedir.
Karotis arter endotelyal ile zenginleştirilmiş tek hücreli preparatların çevredeki doku ve periadventitial yağdan arındırılmış olarak dikkatlice diseke edilmesi esastır. Karotidlerin lümenleri, tek hücreli preparatlarda kan hücrelerinin kirlenmesini önlemek için iyice perfüze edilmelidir. Yanlış doku tanımlama ve etiketleme yüksek standart sapmasına neden olabilir. Bu protokol için dikkatli planlama ve zaman yönetimi gereklidir. Yetenekli bir cerrah ve operatör bir PCL ameliyatı yapmak için 15-20 dakika sürebilir. Her fareden fedakarlık, karotis izolasyonu ve luminal enzimatik sindirim 35-40 dakika daha sürecektir. Endotel hücre yıkamasından tek hücreli/tek çekirdekli hazırlığa kadar uygulamalı işlem süresi ek 2 saattir. Titiz planlama ve ekip çalışması şiddetle tavsiye edilir.
Herhangi bir deneysel protokolde olduğu gibi, bazı dezavantajlar ve sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Mevcut protokol, luminal doku ayrışması sırasında anında erken yanıtın yapay aktivasyonunu önlemek için adımlar içermemektedir. Literatürde enzimatik sindirimin inflamasyon ve apoptoz gibi stres sinyal olaylarına yol açabileceği bildirilmiştir. Bu, deneysel tasarıma uygun kontrol gruplarının dahil edilmesiyle ele alınabilir. Ek olarak, soğuk-aktif proteazlar gibi enzimatik sindirim sırasında anında yanıtın yapay aktivasyonunu en aza indirgeyebilen ıslak laboratuvar yöntemleri13,14 olarak düşünülmelidir.
Bu protokol, genetik arka planına bakılmaksızın herhangi bir fare suşu için kullanılabilir. Bununla birlikte, endotelyal olarak zenginleştirilmiş preparatlar, endoteldeki değişikliklerle ilgili araştırma sorularını en iyi şekilde cevaplayabilir ve bu nedenle EC'ye özgü nakavtlar ve EC'ye özgü transgenik fareler için çok uygundur. Bu tek hücreli izolasyon yöntemi, tek hücreli multi-omik çalışmalar ve Görüntüleme Akışı Sitometrisi gibi diğer akış sitometrisine dayalı tahliller gerçekleştirmek için uyarlanabilir. Luminal sindirim yaklaşımı, taze elde edilen fare aortları, büyük hayvanlardan (tavşanlar ve domuzlar) arterler ve ayrıca yeni elde edilmiş insan vasküler eksplantları için kullanılabilir. Toplu olarak, bu yöntem kan akışının endotel fonksiyonu ve tek hücreli bir çözünürlükte yeniden programlama üzerindeki kesin rolünü tam olarak anlamamızı sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
HJ, FloKines Pharma'nın kurucusudur. Diğer yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL119798, HL095070 ve HL139757'den HJ'ye hibe edilen fonlarla desteklenmiştir. HJ ayrıca Wallace H. Coulter Seçkin Fakülte Başkanı Profesörlüğü tarafından da desteklenmektedir. Emory Entegre Genomik Çekirdeği (EIGC) tarafından sağlanan hizmetler, Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından sübvanse edildi ve ayrıca Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Georgia Klinik ve Translasyonel Bilim İttifakı tarafından ödül numarası altında kısmen desteklendi. UL1TR002378. Yukarıda verilen içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini yansıtmamaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
References
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al.
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
Tags
Biyoloji Sayı 176 Arter hücreleri Endotel hücreleri tek hücreli RNAseq tek hücreli ATACseq AterosklerozErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 06/22/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
